התרבות של תאים דנדריטים מיאלואידית מ מבשרי מח עצם

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

וידאו זה מדגים את נוהל המבדילים תאים דנדריטים מיאלואידית ממח העצם העכבר. בידוד של השוקה העכבר הירך, ועיבוד של מח העצם הם הפגינו. תמונות הוכחת מורפולוגיה תא לפני ואחרי בידול, דמויות המתארות פנוטיפ התא IL-12 בייצור התבגרות הבאות באמצעות CPG מוצגים.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Boudreau, J., Koshy, S., Cummings, D., Wan, Y. Culture of myeloid dendritic cells from bone marrow precursors. J. Vis. Exp. (17), e769, doi:10.3791/769 (2008).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

תאים דנדריטים מיאלואידית (DCS) משמשים לעתים קרובות כדי לחקור את יחסי הגומלין בין מנגנוני החיסון המולדת ובעלי כושר הסתגלות לבין תגובה מוקדמת לזיהום. כי אלה האנטיגן החזק ביותר בהצגת תאים, DCs נמצאים בשימוש יותר ויותר וקטור חיסון ללמוד את האינדוקציה של אנטיגן ספציפי התגובה החיסונית. בסרטון הזה, אנחנו מדגימים את הליך קצירת tibias ואת עצמות הירך של העכבר תורם, עיבוד מח עצם הבחנה DCs במבחנה. המאפיינים של שינוי בעקבות גירוי DCs: תאים דנדריטים בשלים הם phagocytes חזק, ואילו DCs בוגרים המסוגלים מצגת אנטיגן ואינטראקציה עם CD4 + ו - CD8 + T תאים. שינוי זה בפעילות תפקודית מתכתב עם upregulation של סמנים משטח התא ייצור ציטוקינים. סוכנים רבים שניתן להשתמש בהם כדי DCs בוגרים, כולל ציטוקינים חיוג כמו ligands הקולטן. בסרטון הזה אנחנו מדגימים השוואות תזרים cytometric הביטוי של שני שיתוף גירוי מולקולות, CD86 ו - CD40, ואת ציטוקינים, IL-12, בעקבות גירוי לילה עם טיפול CPG או מדומה. לאחר התמיינות, DCs ניתן להשפיע יותר כמו וקטור חיסון לשימוש או לייצר אנטיגן ספציפי על ידי המערכת החיסונית במבחנה פועם באמצעות פפטידים או חלבונים, או transduced באמצעות וקטורים ויראליים רקומביננטי.

Protocol

פרוטוקול זה הותאם מ לוץ ואח' 1.

קציר ועיבוד של מח העצם

  1. בידוד של עצם השוק לבין עצם הירך: להרדים את העכבר תורם ולרסס את הרגליים עם אתנול 70%. תפוס את הקרסול first היטב עם מלקחיים בוטה מתחילים לחתוך את העור ואת שרירי הבסיסי לחשוף את עצם השוק. כדי למנוע פגיעה בעצמות, לחתוך לאט במקביל השוקה, והשאיר על כנו מפרק הברך.

    כדי לנקות את עצם הירך, מפרק הברך לשתק את ידי אחיזה עם מלקחיים בוטה. לנקות את השרירים עם זוג מספריים חדות מלקחיים מעוקל. המשך כלפי מעלה עד מפרק הירך חשוף ומספריים יכול להיות ממוקם בין ראש עצם הירך ואת מפרק הירך. מוציאים את העצמות על ידי חיתוך משותף בין עצם הירך לבין המותן ומקום לתוך בופר פוספט (PBS) על קרח.
  2. הסרת מח עצם: השרירים הנותרות נקי של עצמות בעזרת מספריים מלקחיים מעוקל. לחתוך את העצם אפיפיזות כל ולאתר את חלל במרכז. בעזרת מזרק 10 מ"ל עמוסה PBS ו 25G0.5 "מחט, שטוף מוח העצם לתוך צלחת פטרי ללא רקמה מצופה.
  3. עיבוד של מוח העצם: השתמש סוף הגומי של הבוכנה של מזרק 1mL לנתק את מח העצם לתוך ההשעיה תא בודד (להשתמש מעלה ומטה, לא מגרד תנועה). איסוף מח העצם בצינור בז חרוטי, ולשטוף את מוח העצם שיורית עם PBS.

התרבות של תאים דנדריטים

  1. תאים Resuspend בוושינגטון התקשורת לספור מבשרי DC על hemocytometer (איור 1). אתה תראה תאים בגדלים שונים; מבשרי DC הם הגדולים והמבריקים. דיפרנציאלי לספור רק את התאים האלה. משתי עצמות הירך ושני tibias של C57Bl wild-type / 6 העכבר (6-8 שבועות), אתה יכול לצפות בין 25-40 x 10 6 מבשרי DC הכולל.



    איור 1

  2. התרבות תאים בצפיפות של 2 x 10 5 מבשרי DC / mL בוושינגטון התקשורת בתוספת 40 ng / mL רקומביננטי Murine GM-CSF. פלייט תאים שאינם רקמת מצופה צלחות פטרי קלקר.

הוסף מדיה (יום 3)

כדי לרענן את התקשורת, להוסיף חצי מהנפח הכולל של התקשורת טריים בתוספת 40 ng / mL GM-CSF.

החלף שליש התקשורת (יום 6) ו ההבשלה

כדי לרענן את התקשורת, להסיר בזהירות שליש מהנפח הכולל של התקשורת להחליף את נפח התקשורת עם טרי DC בתוספת 40 ng / mL GM-CSF ביום 6 של התרבות.

אם תרצה, תאים דנדריטים יכול להיות מגורה על התבגרות באמצעות ציטוקינים או חיוג כמו ligands הקולטן. בסרטון, DCs היו התבגר ידי גירוי לילה עם 5 ng / mL CPG.

קציר של תאים דנדריטים

תרבות הבירה הושלמה (איור 2). תאים יהיה גם השעיה דבק רופף הצלחת. תאים דבק ניתן להסיר על ידי גירוד מגרד את המנה עם תרבית רקמה ושטיפה עם PBS. המספר הכולל של תאים יגדל פי 5-8 במהלך התרבות שבוע ארוך תקופת הבחנה, אם כן, מצפים לקצור 1-1.6 x 10 6 תאים / מ"ל.

איור 2

איור 2

ריאגנטים

  1. DC התקשורת
    1. RPMI-1640 מדיה, בתוספת:
    2. 10% בסרום שור עוברית
    3. 100 IU / mL פניצילין
    4. 100 מיקרוגרם / מ"ל ​​סטרפטומיצין
    5. 1% L-גלוטמין
    6. 0.1% 2-mercaptoethanol
    7. 1X שאינם חיוניים חומצות אמינו
    8. 1X נתרן pyruvate
  2. רקומביננטי Murine GM-CSF
    1. rmGM-CSF (Peprotech inc, ניו ג'רזי, לא קטלוג. 315-03)

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

DCs שימושיים מחקרים של אינטראקציות החיסון המולדת ובעלי כושר הסתגלות, והוא יכול להיות מועסקים וקטור חיסון. בסרטון הזה, אנחנו הוכיחו את הצעדים כדי לבודד מח עצם להבדיל תאים דנדריטים מיאלואידית במבחנה. בעקבות התקופה תרבות, תאים אלו יכולים להיות דמיינו מיקרוסקופית שני תאים כמו חסיד, אשר לעתים קרובות בעלי דנדריטים, ולא חסיד תאים עגולים. DCs ניתן להשפיע עוד יותר על ידי פועם עם אנטיגן להצגת אנטיגן או גירוי של ייצור ציטוקינים לבין מולקולה upregulation costimulatory בעזרת ציטוקינים ו / או חיוג כמו ligands קולטן (לסקירה, ראה גלבוע, 2008 (2)).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgements

JB נתמך על ידי studentships מן למדעי הטבע וההנדסה המועצה למחקר (NSERC). תמיכה עבור פרויקט זה סופק על ידי מכוני הבריאות הקנדית Research, גרנט MOP-67066.

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
recombinant murine GM-CSF Reagent Peptrotech 315-03

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lutz, M. B., Kukutsch, N., Ogilvie, A. L., Rossner, S., Koch, F., Romani, N., Schuler, G. An advanced culture method for generating large quantities of highly pure dendritic cells from mouse bone marrow. J. Immunol. Methods. 223, 77-92 (1999).
  2. Gilboa, E. DC-based cancer vaccines. J. Clin. Invest. 117, 1195-1203 (2007).

Comments

14 Comments

  1. Adherent cells are macrophages not DCs. They are >95% F4/80 positive macrophages.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    December 12, 2008 - 1:21 PM
  2. I confirm that!

    Reply
    Posted by: Imane A.
    October 10, 2012 - 6:12 AM
  3. The expression level of Class II molecules is strong? Have you tested the level of this marker in your cells?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    January 30, 2009 - 10:27 AM
  4. These cells are generally about ²5% MHC II+ and expression is increased >65% after stimulation (ie with LPS)

    Reply
    Posted by: Jeanette B.
    May 6, 2009 - 6:39 PM
  5. How long can dendritic cells be cultured for before use in an experiment? How often should media be changed if you are not using them immediately?

    Reply
    Posted by: Sarah L.
    May 5, 2009 - 3:48 PM
  6. I have never tried to culture them longer than 10 days, but they are healthy at that point. Maybe someone else has? If you do culture them longer, they should be split 1/² or 1/3 (keep the media that they're in and top up with fresh media) and more frequently if the media begins to yellow. They grow quickly at this stage!    

    Reply
    Posted by: Jeanette B.
    May 6, 2009 - 6:43 PM
  7. Do you know if splitting the cells will activate them? I am afraid I'll lose a lot of cells... (not sure if I should expect all of them to re-attach or not...)

    Reply
    Posted by: Anonymous
    May 12, 2010 - 3:43 PM
  8. 14 days.

    Reply
    Posted by: Imane A.
    October 10, 2012 - 6:14 AM
  9. when i culture the cells i often see a few small (maybe 1 or ²mm) of cells. It is visible to the eye and just looks like a clump of cells under the microscope. I use GM-CSF to mature the cells but nothing to stimulate them as i have to do that as part of my experiment at a later date. I was just wondering is it normal for the cells to clump like that if they are not activated?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    June 5, 2009 - 9:48 AM
  10. It is normal to have these small clusters early in the culture period. They should be very rare by day 7 of culture, even after stimulation.

    Reply
    Posted by: Jeanette B.
    June 6, 2009 - 9:30 AM
  11. Hi, just like to ask...Should I just collect the non-adherent cells after GM-CSF differentiation for subsequent culturing if the adherent cells are macrophages?
    I intend to follow the protocol of Lutz and the whole generation of DCs will take a period of 1² days. I hope the cells can survive for a long period.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    June 18, 2009 - 5:30 AM
  12. why do you not use IL-4 + rmGM-CSF?, and why do you use 40 ng/mL of GM-CSF, if Luzt use ²0ng/ml? Where do you mature the DC, in the same plate?

    Reply
    Posted by: paula c.
    August 15, 2009 - 10:38 AM
  13. I work with Sprague Dawley Rats and my experience is that when I use the combination of GMCSF and IL4 the capacity of the cells to stimulate T cell activation/diferrentiation decrease.....in comparisson withthe ones culture just with GMCSF

    Reply
    Posted by: Anonymous
    August 21, 2009 - 9:10 AM
  14. When you replace/change the media...Are you lossed a lot of cells????

    Reply
    Posted by: Anonymous
    August 21, 2009 - 9:13 AM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics