Immunoprécipitation de la chromatine des cellules souches embryonnaires humaines

Biology
 

Summary

La différenciation de l'ESC coïncide avec un type de cellule des changements spécifiques dans la structure et la composition de la chromatine. La détection de ces changements fournit de précieuses indications sur les mécanismes qui définissent stemcellness et la différenciation cellulaire. Immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) représente une méthode utile pour disséquer les mécanismes moléculaires qui sous-tendent la différenciation des cellules souches.

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Bertani, S., Kan, A., Sauer, F. Chromatin Immunoprecipitation from Human Embryonic Stem Cells. J. Vis. Exp. (17), e780, doi:10.3791/780 (2008).

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Abstract

La complexité structurale et fonctionnelle de la myriade de cellules dans les organismes métazoaires découle d'un petit nombre de cellules souches. Les cellules souches sont caractérisées par deux propriétés fondamentales: l'auto-renouvellement et multipotence qui permet à une cellule souche à se différencier en n'importe quel type de cellule 1. Les cellules souches à la progression de cellules différenciées est caractérisée par une perte de change multipotence, structurelles et morphologiques et l'activité hiérarchique des facteurs de transcription et de molécules de signalisation, dont les activités établir et de maintenir un type de cellule spécifique l'expression des gènes. Au niveau moléculaire, la différenciation des cellules implique des changements dynamiques de la structure et la composition de la chromatine et la détection de ces changements dynamiques peuvent fournir des informations précieuses sur les caractéristiques fonctionnelles des cellules souches et le processus de différenciation cellulaire 2,3. La chromatine est une très compact ADN-protéines complexes qui se forme lorsque l'ADN chromosomique des cellules package avec des protéines, principalement histones 4. Stemcellness et la différenciation cellulaire a été corrélée avec la présence de tableaux spécifiques des protéines régulatrices telles que les facteurs épigénétiques, des variants d'histones et des facteurs de transcription 2,3,5.


Immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) fournit une méthode utile pour surveiller la présence d'ARN, de protéines, et les modifications des protéines dans la chromatine 6,7. La comparaison de la chromatine des différents types de cellules peut élucider les changements dynamiques dans les associations de protéines de chromatine qui se produisent pendant la différenciation cellulaire.

Immunoprécipitation de la chromatine implique la purification de l'in vivo réticulé chromatine. La chromatine isolée est réduite à des fragments plus petits par digestion enzymatique ou une force mécanique. Des fragments de chromatine sont précipitées à l'aide d'anticorps spécifiques pour cibler des protéines ou des protéines et des modifications de l'ADN. L'ADN ou l'ARN précipité est purifié et utilisé comme matrice pour la PCR ADN ou des dosages puces basées. Prérequis pour une puce de succès sont des anticorps de haute qualité à l'antigène désiré et la disponibilité de la chromatine des cellules de contrôle qui n'expriment pas la molécule cible. ChIP peut corréler la présence de protéines, des protéines et des modifications d'ARN et l'ARN avec l'ADN cible spécifique, et selon le choix de l'outil outread, détecte l'association de molécules cibles au niveau des gènes cibles spécifiques ou dans le cadre d'un génome complet. La comparaison de la répartition des protéines dans la chromatine des cellules différenciées peuvent élucider les changements dynamiques de la composition de la chromatine qui coïncident avec la progression des cellules le long d'une lignée cellulaire.

Protocol

Les cellules ES Décongélation (ne figure pas dans la vidéo)

Les cellules ES sont congelés dans un milieu contenant 10% de DMSO. Depuis le DMSO peut induire la différenciation des cellules ES, il peut être possible de dégel, les cellules en fin de journée et ainsi de changer le milieu, le lendemain matin afin de minimiser les effets du DMSO résiduel.

  1. Enduire une plaque de 6 puits de culture tissulaire avec 0,1% de gélatine pendant au moins 15 min et aspirer immédiatement avant de cellules de la plaque sur le.
  2. Décongelez les cellules ES (environ 5 × 10 6 cellules, équivalent à une confluence de 6 puits) dans un bain d'eau à 37 ° C et diluer dans 10 ml de milieu cellules ES préchauffée.
  3. Pellet les cellules en faisant tourner pendant 10 minutes à 1000 rpm dans une centrifugeuse de paillasse clinique.
  4. Aspirer délicatement les cellules moyennes et remettre en suspension dans 10 ml de 37 ° C moyenne préchauffée.
  5. Suspension de cellules de transfert à la plaque de 6 puits et de croître à 37 ° C dans un incubateur humidifié à 5% de CO 2 incubateur.
  6. Changement moyen le lendemain pour enlever les cellules mortes et le DMSO résiduel.

Passage et l'expansion des cultures de cellules ES

Les cellules ES sont régulièrement repiquées tous les 2 / 3 jours, et le milieu est changé tous les deux jours. Ainsi, les cellules ES requièrent une attention quotidienne. Dans notre expérience, chargeur indépendant cellules ES croître rapidement et rapidement acidifier le milieu, tournant dans le jaune. Permettant aux cellules d'acidifier le milieu (en ne changeant pas les médias tous les jours ou par passage des cellules à trop basse dilution) va provoquer des cellules de subir la crise, déclenchant une différenciation excessive et la mort des cellules, après quoi leur totipotence ne peut être garantie. Cellules de placage à une densité trop faible, la dispersion insuffisante des cellules au cours du passage, ou le placage inégale peut causer des problèmes similaires, comme les cellules vont former des amas de grandes avant d'atteindre la confluence et des cellules au sein de ces touffes se différencier ou mourir. Germinale de transmission est significativement réduite dans une des cellules qui ont été maltraités, même quand ils semblent en bonne santé au moment de l'injection.

  1. Pour une confluence de 6 puits plaque de cellules ponction moyenne et laver avec 2-3 ml de 37 ° C PBS préchauffé, il pipetage loin des cellules.
  2. Couvrir les cellules avec 1 ml d'une solution de trypsine × pendant 3-4 minutes ou jusqu'à ce que les cellules sont uniformément dispersés dans de petites touffes.
  3. Ajouter 1 ml de milieu pour inactiver la trypsine.
  4. Recueillir les cellules trypsinisées et cellules de la plaque (en général 2 / 5 de bien) à un fraîchement gélatinisé 6-même assiette.

Les cellules ES de congélation

  1. Trypsiniser une confluence de 6 puits plaque (environ 1 × 10 7 cellules), comme décrit ci-dessus.
  2. Recueillir les cellules trypsinisées dans 9 ml de milieu et de culot pendant 5 minutes à 1000 rpm.
  3. Aspirer moyen et cellulaire resuspendre le culot dans 1 ml de milieu de congélation fraîchement préparés. Aliquote de 0,5 ml de cellules en deux cryotubes.
  4. Congelez les flacons à -80 ° C pendant la nuit et transfert à l'azote liquide pour stockage à long terme.

ChIP-on-chip PROCÉDURE

Immunoprécipitation

  1. Cellules réticulation formaldéhyde (pour cellules en suspension)
    1. Utilisez 5 x 10 7 - 1 x 10 8 cellules pour chaque immunoprécipitation.
    2. Ajouter formaldéhyde frais à la suspension cellulaire à une concentration de 1%.
    3. Incube les cellules avec la solution de formaldéhyde pendant 10 minutes à température ambiante.
    4. Ajouter 1 / 10 volume de 1,25 M de glycine pour étancher formaldéhyde.
    5. Rincer les cellules deux fois avec 10 ml de PBS 1x.
    6. Piscine cellules dans 50 ml tubes coniques et centrifuger à 700g pendant 5 min à 4 ° C. Jeter le surnageant et remettre le culot dans 1,5 ml de tampon de lyse. Transfert des cellules dans un tube de 1,5 ml.
  2. Flash-gel de trois cellules reprises dans l'azote liquide et d'utiliser un broyeur de tissus pour briser les cellules. Une fois que les cellules sont réticulés, ils peuvent être conservés congelés à -80 ° C indéfiniment.

Préparation des billes magnétiques (étapes sont toutes réalisées à 4 ° C)

  1. Ajouter 50 ul de billes Dynal à 1,5 ml microtubes de rétention faibles. Mettre en place 1 tube de perles par immunoprécipitation. Ajouter une solution de bloc ml.
  2. Recueillir des perles Dynal MPC aide. Placer les tubes dans le rack magnétique. Autoriser des perles à recueillir sur le côté du tube. Cela devrait prendre environ 15 s. Inverser la porte à deux reprises pour aider à recueillir des perles. Retirer le surnageant avec pipette.
  3. Ajouter 1 ml de solution bloc et perles délicatement enlever remettre en suspension dans la bande magnétique de la grille et en inversant le rack, avec les tubes encore en place - soit 10-20 fois, ou jusqu'à ce que les perles sont une suspension uniforme. Recueillir des perles comme ci-dessus (étape 2). Retirer le surnageant avec pipette.
  4. Lavez perles dans 1,5 ml de solution bloc, comme dans l'étape 3, une fois de plus.
  5. Remettre les billes en 750 Solution bloc ul et ajouter 10 ug d'anticorps. Incuber à 4 ° C pendant un minimum de 6h, ou toute la nuit, sur un rotateur.
  6. Lavez perles trois times dans une solution de bloc ml, comme décrit dans l'étape 3.

Sonication cellulaire

  1. Retirer culots cellulaires congelés entre -80 C et le transfert de cellules ° à tubes pour sonication. Nous avons actuellement préfèrent utiliser le fond d'un polupropylene standard, tube de 15 ml conique pour sonication. Nous avons coupé le tube en deux morceaux à la marque de 5 ml et jeter la moitié supérieure. Les tubes peuvent être recouverts de parafilm ou avec le bouchon du tube lors de la configuration.
  2. Utilisation d'un rack tube de centrifugeuse, le tube de position afin de la sonde se trouve à environ 0.5 à 1.0 sonicateur cm au dessus du fond du tube. Veillez à ce que la sonde est centrée et ne contacte pas les côtés du tube. (Positionnement de la sonde peuvent affecter que les mousses solution ou non pendant la sonication. Typiquement, le moussage indique que l'ADN soniqué sera mal rasé.)
  3. Soniquer suspension de six fois pendant 20 s. Les échantillons doivent être conservés dans un bain d'eau glacée pendant la sonication. Pour diminuer le moussage, initialement fixé puissance de sortie à 0 et augmenter manuellement la puissance finale au cours de première rafale. (S'il n'y est significatif moussant, toutes les bulles peuvent être éliminés par centrifugation à 20.000 g suivie de la remise en suspension douce de tout le matériel, ne laissant aucune bulles de la mousse.)
  4. Centrifuger à 20000 g pendant 10 min à 4 ° C à granulés de débris et de récolter le surnageant dans un tube de 1,5 ml.
  5. Économisez 50 ul de lysat cellulaire de chaque échantillon de l'ADN d'entrée. Conserver à -20 ° C. Au moins une partie aliquote d'ADN d'entrée doivent être conservés par lot de lysat soniquer. Notez que les effets des effets de la sonication et la distribution de tailles de fragments résultant ne peuvent être vérifiés après le renversement réticulent et la purification de l'ADN.

Immunoprécipitation de la chromatine

  1. Ajouter la quantité de la chromatine équivalent de 5 x 10 7 - 1 x 10 8 cellules par sonication cellulaire, étape 4 pour les 50 ul d'anticorps / mélange de billes magnétiques de la préparation des billes magnétiques, étape 6 avec un volume final de 1 ml (Il peut être possible d'ajuster avec le tampon de lyse, si jamais). Incuber une nuit sur les rotateurs à 4 ° C.

Laver

  1. Recueillir des perles Dynal MPC aide. Placer les tubes dans le rack. Autoriser des perles à recueillir sur le côté du tube. Cela devrait être de prendre environ 20 s. Inverser la porte à deux reprises pour aider à recueillir toutes les billes. Retirer le surnageant avec pipette, en changeant des conseils entre les échantillons.
  2. Ajouter 1 ml de tampon de lyse dans chaque tube et perles délicatement resuspendre. Cela peut être fait en retirant la bande magnétique de la grille et en inversant la grille, avec des tubes encore en place - 10-20 fois ou jusqu'à ce que les billes sont remises en suspension homogène. Recueillir des perles. Retirer le surnageant par pipetage. Répéter ce lavage 5 fois plus, en changeant des conseils entre les lavages.
  3. Lavez perles 6 fois dans 1 ml de tampon IP1, comme décrit dans l'étape 2.
  4. Lavez perles 6 fois dans 1 ml de tampon IP2, comme décrit dans l'étape 2.
  5. Lavez perles 6 fois dans 1 ml de TE Buffer 8.0, comme décrit dans l'étape 2.
  6. Centrifuger à 960 g pendant 3 min à 4 ° C et enlever tout résidu de tampon TE.

Élution

  1. Ajouter ul 210 de tampon d'élution et le matériel éluer à partir de perles en incubant les tubes dans un bain d'eau à 65 ° C pendant 15 min. Vortex brièvement toutes les 2 min. Cette incubation peut être prolongée aussi longtemps que 30 minutes, ce qui peut aider à améliorer la récupération de l'éluat.
  2. Isoler perles à 16.000 g pendant 1 min à température ambiante.
  3. Retirer 200 pl de surnageant et transférer dans un nouveau tube. Le matériel peut être congelé à -20 ° C et stockée pendant la nuit.

Inversion Crosslink

  1. Réticulent inverse de l'ADN à partir d'élution immunoprécipitation, l'étape 3 par incubation à 65 ° C pendant un minimum de 6 h et un maximum de 15 h (temps plus longs de l'inversion réticulent entraînent généralement une augmentation du bruit dans l'analyse des microréseaux). Cette incubation peut être fait dans un four afin que le tube est chauffé uniformément et il ya moins de condensation formées.
  2. Dégeler 50 pl de l'ADN d'entrée réservée après sonication (étape 13), ajouter 150 ul (3 volumes) de tampon d'élution et mélanger. Inverse réticulent cet ADN d'entrée en incubant à 65 ° C comme inversion Crosslink, l'étape 1. De ce point, tous les tubes d'immunoprécipitation ou de l'ADN d'entrée est considéré comme un tube séparé ou d'un échantillon pour un traitement ultérieur étapes.

DNA Purification

  1. Ajouter 8 ul de 10 mg ml-1 RNaseA (0,2 mg de concentration ml-1 final), mélanger en inversant le tube fois plusieurs et incuber à 37 ° C pendant 2 h.
  2. Ajouter 4 pi de 20 mg ml-1 protéinase K (0,2 pg ml-1 concentration finale) et mélanger en retournant le tube plusieurs fois et incuber à 55 ° C pendant 2 h.
  3. Ajouter 400 ul de phénol: chloroforme: alcool isoamylique (P: C: IA), vortex et phases distinctes avec 2 ml Phaselock tubes lourds (suivre les instructions fournies par Eppendorf).
  4. Si le P: C: solution IA est ancienne ou à faible pH, il y aura degradation de l'ADN, provoquant du bruit dans l'analyse de puces à ADN et la perte de détection de cibles valides.
  5. Transfert couche aqueuse à tube à centrifuger contenant 16 nouvelles ul de NaCl 5M (200 mM) en concentration finale) et 1,5 l de 20 μ ul-1 glycogène (30 au total pg).
  6. Ajouter 800 ul EtOH. Incuber pendant la nuit à -20 ° C ou 30 min à -80 ° C.
  7. Centrifuger à 20000 g pendant 10 min à 4 ° C à culot d'ADN. Lavez boulettes en ajoutant 500 ul d'EtOH 80%, vortex pour resuspendre granulés et la filature à nouveau à 20000 g pendant 5 min à 4 ° C.
  8. Retirez tout EtOH 80% restants. Faites tourner les tubes brièvement pour ramasser tout liquide restant et enlever le liquide avec une pipetteman, en évitant le culot. Laisser l'air sec jusqu'à des tubes granules sont à peine secs: pellets doit toujours conserver un aspect humide. Resuspendre chaque pastille dans 70 ul de 10 mM Tris-HCI, pH 8,0.
  9. Surséchage de ces pastilles peuvent les rendre difficiles à remettre en suspension, ou susceptibles d'en flocons et de décoller du côté du tube.
  10. En option: Enregistrer 15 ul d'échantillon immunoprécipitation pour une utilisation future. Ce matériau peut être utilisé pour effectuer des gènes spécifiques de confirmation des résultats de la PCR biopuces.
  11. Quantifier la concentration par absorption UV (260 nm).

NB: Les étapes suivantes, y compris la préparation de bibliothèques et de l'amplification d'utiliser un kit de modification GenomePLex WGA avec Mix Amp 10X de Sigma, sans dNTPs:

Préparation de la Bibliothèque

Disponible dans le kit GenomePLex WGA avec Mix Amp 10X de chez Sigma

  1. Ajouter 2 ul de tampon 1X Préparation Bibliothèque à 10 ul d'échantillon d'ADN de l'ADN Purification, étape 11 dans un tube PCR.
  2. Ajouter 1 ml de solution de stabilisation de la bibliothèque.
  3. Vortex à fond, de consolider par centrifugation, et les placer dans le thermocycleur à 95 ° C pendant 2 minutes.
  4. Refroidir l'échantillon sur la glace, de consolider par centrifugation par centrifugation, puis retour à la glace.
  5. Ajouter 1 pl de préparation enzymatique Bibliothèque, vortex soigneusement, puis centrifuger brièvement.
  6. Placer l'échantillon dans un cycleur thermique et incuber comme suit:
    • 16 ° C pendant 20 minutes
    • 24 ° C pendant 20 minutes
    • 37 ° C pendant 20 minutes
    • 75 ° C pendant 5 minutes
    • 4 ° C détiennent
  7. Retirer les échantillons de thermocycleur et centrifuger brièvement. Les échantillons peuvent être amplifiés immédiatement ou conservés à 20 ° C pendant trois jours.

D'amplification

Disponible dans le kit GenomePLex WGA avec Mix Amp 10X de chez Sigma

  1. Un mélange maître est préparé en ajoutant les réactifs suivants à la réaction 15 pl de l'étape 3, ci-dessous:
    • 7,5 l de Mix Amp 10X (sans dNTP)
    • 5,0 l de WGA ADN polymérase
    • 3,0 pi d'un dNTP 10 mM (chacun) stock (concentration finale 0,4 mM)
    • Amener le volume final de réaction de 75 ul avec une eau sans nucléase
  2. Vortex à fond. Centrifuger brièvement, et de commencer thermocyclage.
    • Dénaturation initiale à 95 ° C pendant 3 minutes
    • Effectuer 14 cycles comme suit:
    • Dénaturer 94 ° C pendant 15 secondes
    • Recuit / Étendre 65 ° C pendant 5 minutes
    Après le cyclisme est complète, de maintenir les réactions à 4 ° C ou conserver à -20 ° C jusqu'au moment de l'analyse ou la purification.
  3. Purifier l'ADN avec PCR Purification Kit ® de Quiagen conformément aux instructions du fabricant et de quantifier la concentration par absorption UV (260 nm).
  4. Effectuer à nouveau un cycle d'amplification de la Préparation Bibliothèque, étape 1 à l'amplification, l'étape 2, avec les adaptations suivantes.

    • Concernant la quantité d'ADN nécessaire à l'étape 3, ci-dessus, d'engager le processus de fragmentation: Si la concentration d'ADN est d'environ 200-300 pg / ml, utiliser 2,5 l de l'échantillon et ajuster avec de l'eau pour un volume final de 10 pl.
    Si la concentration d'ADN est environ 50-60 pg / ml, utiliser 5 ul d'échantillon et ajuster avec de l'eau pour un volume final de 10 pl.


    • Dans ce processus d'amplification seconde, avec des dNTP dTTPs pour le mélange maître est l'échange d'un mélange comprenant 10 mM, 10 mM de dATP dGTP, dCTP et 10 mM dTTP 8 mM et 2 mM dUTP à la même concentration que le mélange précédent.

  5. Mesurer l'ADN en utilisant un spectrophotomètre UV-visible (260 nm). Normalement, plus de 9 pg d'ADN amplifié est obtenu à partir de chaque réaction.

    NB: Le marquage des cibles ADN est effectué avec le GeneChip ® WT double brin Kit étiquetage ADN d'Affymetrix Terminal selon les instructions du fabricant, comme décrit ci-dessous:

Cibles fragment amplifié

  1. Fragment les échantillons en utilisant le tableau approprié ci-dessous en fonction de ce type array, la cible sera hybrideindustrialisés d'.

    Tableau 1. Mélanger la fragmentation des réseaux uniques
    Volume Composant / Montant dans une Rxn
    ADN double brin 7,5 pg
    10X fragmentation ADNc 4,8 ul
    UDG, 10 U / pl 1,5 pl
    APE 1, 100 U / ul ul 2,25
    Eau sans nucléase jusqu'à 48 ul
    Disponible dans les GeneChip ® WT double brin Kit étiquetage ADN d'Affymetrix Terminal

    Tableau 2. Mélanger la fragmentation pour le multi-ensemble fixe
    Volume Composant / Montant dans une Rxn
    ADN double-brin 9 pg
    10X fragmentation ADNc 4,8 ul
    UDG, 10 U / pl 1,5 pl
    APE 1, 100 U / ul ul 2,25
    Eau sans nucléase jusqu'à 48
    Disponible dans les GeneChip ® WT double brin Kit étiquetage ADN d'Affymetrix Terminal
  2. Mettre en place mélangez la fragmentation selon les tableaux ci-dessus soit. Flick-mix et spin bas des tubes.
  3. Incuber les réactions à l'adresse:
    • 37 ° C pendant 1 h.
    • 93 ° C pendant 2 min.
    • 4 ° C pendant au moins 2 minutes.
  4. Flick-mix, ralentit les tubes, et le transfert 45 pl de l'échantillon dans un nouveau tube.
  5. Retirer 2 ul de chaque échantillon pour l'analyse de gel changement.

Étiquette fragmenté ADN double-brin

  1. Préparer le mélange d'ADN double brin étiquetage tel que décrit dans le tableau ci-dessous:

    Tableau 3. Composition du double brin d'ADN Mix étiquetage
    Volume Composant / Montant dans une Rxn
    5X tampon TdT 12 ul
    TdT 2 pl
    Réactif étiquetage ADN, 5 mM 1 pl
    Le volume total 15 pi
    Disponible dans les GeneChip ® WT double brin Kit étiquetage ADN d'Affymetrix Terminal
  2. Ajouter 15 ul du Mix ADN double-brin d'étiquetage pour les échantillons d'ADN, feuilletez-mix, et les spin-down.
  3. Incuber les réactions à l'adresse:
    • 37 ° C pendant 60 min.
    • 70 ° C pendant 10 min.
    • 4 ° C pendant au moins 2 min.
  4. Retirer 2 ul de chaque échantillon pour l'analyse de gel changement.

Gel-analyse de changement

  1. Préparer un gel agarose à 4%.
  2. Incuber les échantillons à partir des cibles fragment amplifié, étape 5 et Label fragmenté ADN double-brin, étape 4 à 65 ° C pendant 2 min.
  3. Ajouter 10 ul de streptavidine (1 mg / ml), et des échantillons incuber à température ambiante pendant 5 min.
  4. Exécuter des échantillons provenant de l'étape 3 sur une 4% de gel d'agarose (Gel-Shift analyse, étape 1) pour vérifier la migration déplacement des produits d'étiquetage.

L'hybridation tableau & tableau à laver

Interprété par le Centre de génomique de l'Université de Californie Riverside.

Analyse tableau

Interprété par l'analyse informatique.

Compositions de tampon:

Bloc Solution: PBS + 0,5% albumine sérique bovine (BSA).

Tampon de lyse: 50 mM HEPES-KOH, pH 7,5
140 mM de NaCl
EDTA 1 mM
1% de Triton X-100
SDS 0,1%
1mM de PMSF
Le pH final 7,5

IP1: Lysis Buffer + 500 mM de NaCl

IP2: 10 mM Tris-HCl
250 mM de LiCl
EDTA 1 mM
0,5% de NP-40
Dioxycholat sodium à 0,5%
Le pH final 8,0

TE: Tris 10 mM, pH 7,4
EDTA 1 mM

Le pH final 8,0
Tampon d'élution: tampon TE + 1% de SDS.

Discussion

Immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) propose une technique précieuse pour la dissection de la chromatine au cours des processus basés sur la différenciation cellulaire. Conditions préalables à la réussite de cette méthode sont des anticorps bien et la disponibilité de la chromatine des cellules de contrôle ou de tissus qui n'ont pas l'antigène d'intérêt. En combinant à puce avec des puces à ADN de la technologie, de vastes quantités d'informations peuvent être obtenues. La validation des résultats ChIP dépend de la disponibilité de systèmes de test approprié qui peut lier l'association dynamique des protéines, des modifications des protéines et / ou d'ARN à l'exécution des processus biologiques au cours du développement cellulaire.

Acknowledgements

Le travail présenté est soutenu par une subvention (RS1-00477-1) du California Institute for Regenerative Medicine (CIRM) à FS

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
Poteinase-K Reagent Roche Group #EO0491
RNase-A Reagent Fermentas #EN0531
formaldehyde 37% Reagent EMD Millipore FX040-13
Chloroform Reagent EMD Millipore 3150
Ethanol Reagent Goldshield
phenol:chloroform:isoamyl alcohol Reagent Invitrogen 15593-031
SA, fraction V Reagent EMD Millipore 2930
Dubecco’s Phosphate Buffered Saline Reagent GIBCO, by Life Technologies 14190
HEPES Reagent EMD Millipore 5330
Sodium Chloride Reagent Fisher Scientific S271-10
EDTA Reagent EMD Millipore 4050
Triton X-100 Reagent EMD Millipore 9410
Sodium Dodecyl Sulfate Reagent JT Baker 4095-02
Lithium chloride Reagent EMD Millipore 5910
Tris-HCl Reagent EMD Millipore 9230
NP-40 Reagent Calbiochem 492015
Deoxycholic acid, sodium salt Reagent Fisher Scientific BP349-100
Ammonium acetate Reagent Applichem 631-61-8
Glycine Reagent EMD Millipore 4840
Glycine Reagent EMD Millipore 4840
dynalbeads, protein A Reagent Invitrogen 100.02D
dynalbeads, protein G Reagent Invitrogen 100.04D
1.5ml Low Retention Microtubes, Xtreme Other Phenix Research Products MAX-815S
Phase Lock Gel Light, 2.0 ml Reagent Eppendorf 955154037

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Evans, M. J., Kaufman, M. H. Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos. Nature. 292, 154-156 (1981).
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Comments

5 Comments

  1. how to prepare ChIp-DNA sample for sequencing?( single-End; solexa)

    Reply
    Posted by: Anonymous
    July 30, 2008 - 9:17 AM
  2. Hi
    Thanks for the protocol. Do you have any protocol for less than 10,000 cells?
    Ramji

    Reply
    Posted by: Anonymous
    September 8, 2008 - 7:27 PM
  3. hi, search in Nature protocols as microChIP. This protocol was made for up to minimun of 100 cells or more. This is great protocol best wishes

    Reply
    Posted by: Anonymous
    March 21, 2009 - 8:56 PM
  4. what is a good positive control antibody to show that the procedure works?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    May 18, 2010 - 3:47 PM
  5. It is a very general question, but you can use histone antibodies as positive controls.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    May 18, 2010 - 5:01 PM

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