אבולוציה מולקולרית של recombinase Tre

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

כאן אנו מדווחים על דור של Tre recombinase דרך האבולוציה, בבימויו מולקולרית. Tre recombinase מזהה רצף מוגדר מראש היעד בתוך רצפי LTR provirus של HIV-1, וכתוצאה מכך כריתה לבין מיגור provirus מ תאים אנושיים נגועים. אמנם עדיין בחיתוליו, אבולוציה מולקולרית מכוונת תאפשר יצירה של אנזימים אישית שישמש כלי הניתוח המולקולרי ורפואה מולקולרית.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Buchholz, F. Molecular Evolution of the Tre Recombinase. J. Vis. Exp. (15), e791, doi:10.3791/791 (2008).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

כאן אנו מדווחים על דור של Tre recombinase דרך האבולוציה, בבימויו מולקולרית. Tre recombinase מזהה רצף מוגדר מראש היעד בתוך רצפי LTR provirus של HIV-1, וכתוצאה מכך כריתה לבין מיגור provirus מ תאים אנושיים נגועים.

התחלנו עם Cre, recombinase 38-kDa, אשר מזהה 34-bp פעמיים תקועים רצף הדנ"א המכונה loxP. מכיוון Cre יכול למעשה לחסל רצפי הגנום, יצאנו חייט recombinase שיכול להסיר את רצף בין 5'-LTR ו-LTR 3'provirus של HIV-1 משולב. כצעד ראשון זיהינו רצפים בתוך האתרים LTR כי היו דומים loxP ונבדק לפעילות רקומבינציה. בתחילה Cre ו mutagenized ספריות Cre לא recombine האתרים loxLTR נבחר provirus של HIV-1. כמו התחלה של תהליך מכוון כל אבולוציה מולקולרית דורש לפחות פעילות שיורית, רצפים המקורי loxLTR אסימטרית חולקו תת ונבדקו שוב לפעילות רקומבינציה. מתנהג כמו ביניים, פעילות רקומבינציה הוצגה עם תת. בשלב הבא, ספריות recombinase היו מועשר באמצעות מחזורי האבולוציה reiterative. כתוצאה מכך, ספריות מועשר היו טרף recombined. השילוב של מוטציות שונות הוכיח סינרגיסטי recombinases נוצרו כי היו מסוגלים recombine loxLTR1 ו loxLTR2. זו היתה הוכחה לכך אסטרטגיה אבולוציונית דרך ביניים יכול להיות מוצלח. לאחר סך של 126 מחזורים האבולוציה recombinases הפרט נותחו תפקודית מבנית. Recombinase הפעילים ביותר - טרה - לה 19 שינויים חומצת אמינו לעומת Cre. Tre recombinase הצליח בלו provirus HIV-1 מתוך הגנום HIV-1 תאים נגועים הלה (ראה "HIV-1-DNA כריתה Proviral שימוש recombinase התפתח", Hauber ג', היינריך Pette-המכון ניסיוני וירולוגיה ואימונולוגיה, המבורג, גרמניה). אמנם עדיין בחיתוליו, אבולוציה מולקולרית מכוונת תאפשר יצירה של אנזימים מותאם אישית ישמש כלי של "ניתוח מולקולרי" ורפואה מולקולרית.

Comments

3 Comments

  1. Dr. Frank Buchholz,

    Its nice to listen to the talk. I have some queries about Tre recombinase.,
     
    1, to excise a fragment using cre or tre i guess, there should be two loxp sites if you are targeting HIV LTR region it should be very specific region rather conserved region. So what happens if the LTR regions tend to mutate ?
    ², Isn't molecular evolution a long process to create such an recombinase ?

    3, There are "zinc finger nuclease" which are custom made enzyme which make specific cuts at DNA. It has the ability to bind to any piece of DNA. So will this technique be useful  for making "Zinc Finger Recombinase", which has the ability to bind LTR region and excise the whole or part of HIV genome.

    Hoping for your comments

    Roshan Padmanabhan
    India  

    Reply
    Posted by: Anonymous
    June 26, 2008 - 12:40 PM
  2. TRE can eradiction Lentiviral Vector from transducted cell fully? if Yes you can find different beatween Tat-Dependent and Tat-Independent LV as target for eradiction 5LTR-LTR3 from genome integrated sit? Sincerely

    Reply
    Posted by: Anonymous
    September 22, 2008 - 7:24 AM
  3. Hello Dr. Frank Bucholz,
    Have you sequenced the host cell genome in the wild type control vs. the HIV-1 infected vs Tre recombinase cells to
    definitively show where the HIV-1 genome is inserting, and that it is removed? Much evidence points to nonrandom insertion
    of the HIV-1 genome.
    Doug Cork
    MHRP/HJF (dcork@hivresearch.org)

    Reply
    Posted by: Anonymous
    October 21, 2009 - 10:06 AM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics