上丘の表面上にフッ素金の適用により網膜神経節細胞の逆行性標識法

Biology

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Summary

このビデオでは、上丘(SC)の表面にフッ素金(FG)を適用することで、RGCの逆行性標識法の方法を説明します。テクニックは、頭蓋骨をドリル皮質を吸引し、SCの全体の背側表面上にゼラチンスポンジを適用する必要があります。

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Chiu, K., Lau, W., Yeung, S., Chang, R. C., So, K. Retrograde Labeling of Retinal Ganglion Cells by Application of Fluoro-Gold on the Surface of Superior Colliculus. J. Vis. Exp. (16), e819, doi:10.3791/819 (2008).

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Abstract

網膜神経節細胞(RGC)計数は、特に緑内障の網膜変性を評価するために不可欠です。信頼性のRGCのラベリングは、任意の治療の効果を評価するための基本です。ラットでは、RGCsの約98%は対側上丘(SC)(フォレスターとピーターズ、1967)に投影することが知られている。我々は緑内障で、この最も脆弱な網膜神経細胞に集中できるように、SCの表面にフッ素金(FG)を適用することは、ほとんどすべてのRGCsにラベルを付けることができます。 FGは、網膜神経節細胞の軸索終末に取り込まれ、両側網膜におけるSOMAのために逆行性に輸送される。 2日間transected視神経の切り株でFGを入れておけば、RGCの逆行性標識法と比較し、RGC生存の干渉が最小限に抑えられます。汚れのRGCs、アマクリン細胞と網膜神経節細胞層での血管の内皮細胞は、この標識法はRGCに対してより特異的であることをクレシルバイオレット染色と比較してください。このビデオでは、SCの表面にFG適用することにより、RGCの逆行性標識法の方法を説明します。 SCを公開する皮質を吸引し、SCの全体の背側表面上にゼラチンスポンジを適用して表示され、外科的手技は、頭蓋骨をドリル含まれています。 SCの巨大な頭蓋内出血と誤嚥を避けるための有用なヒントが与えられている。

Protocol

  1. ケタミン(80mg/kg)とキシラジン(8mg/kg)(2:1体積比)の腹腔内注射によってラットをAnaesthetize。手術中に角膜の乾燥を防ぐために無菌の目の潤滑剤の軟膏を適用します。
  2. 頭の毛皮を(目から耳のレベルに)ひげをそると、ヘッドクランプして、ヘッドステージにヘッドを固定し、切歯のバーでその歯を設定します。
  3. 消毒操作の70%アルコールで10%のポビドンヨード溶液によるエリア。
  4. 皮膚と頭蓋骨と縫合(矢状、冠状および横縫合)(図1)を公開する筋肉をカット。切開のエリアへのスプラッシュ(2 mg / kg体重を超えてはならない)として鎮痛剤、bupivicaineを適用します。
  5. 矢状縫合の各側の頭蓋骨の穴(φ2 × 2 mmの矢状及び横縫合の両方から0.5mm)ドリル。髄膜の破裂や縫合糸の下に横たわって洞を避けてください。

    生きているラットの頭蓋骨に特徴。
    図1。生きているラットの頭蓋骨に特徴。

  6. 春のはさみで髄膜を切り開く、涙を避ける。
  7. 真空ポンプによって慎重に上丘の背側表面上に位置し、3つのチェックポイントを観察することができる脳のコンテンツを吸引除去する。
    1. 灰色から白に灰色の脳組織の色が変わります
    2. 無色の脳脊髄液が出てくる時に吸引を停止します
    3. 慎重に硬膜で覆わ黄色上丘を公開するために水平に最低吸引レベルを拡大
  8. SCの4辺を直接顕微鏡で観察できるようになるまで、SC上の脳の内容を吸引除去する。削除された大脳皮質の部分は、望ましくない副作用(例えば、運動機能障害)を避けるために最小限に抑える必要があります。洞に触れないように注意してください。
  9. できるだけSCの表面が乾いたように微細な滅菌綿のストライプで穴に水分を吸収する。その後、ゼラチンスポンジの薄層を配置し、事前に浸したSCの表面上に6%フルオロゴールド(FGは網膜神経節細胞の軸索末端で取り込まれ、両側網膜におけるSOMAのために逆行性に輸送される)と。
  10. gelfoamで穴を埋め、縫合クリップで皮膚の傷を閉じます。
  11. 動物は暖かい保つために白熱灯の下で回復させた。鎮痛、ブプレノルフィン(100mcg/kg)は、SCの標識後の5日間飲料水で経口適用されます。

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Discussion

  1. なぜ網膜神経節細胞数のためにこの手術方法を使うのか?

    ラットでの網膜神経節細胞(RGC)の約98%は対側上丘(SC)に投影することが知られています。我々は緑内障で、この最も脆弱な網膜神経細胞に集中できるように、SCの表面にフッ素金を適用するには、RGCsのほぼすべてのラベルを付けることができます。 2日間transected視神経の切り株でFGを入れておけば、RGCの逆行性標識法と比較し、RGC生存の干渉が最小限に抑えられます。網膜神経節細胞層で血管の汚れはアマクリン細胞、RGCおよび内皮細胞、このメソッドはRGCに対してより特異的であることをクレシルバイオレット染色と比較してください。

  2. 過度の出血を回避する方法?

    最初に、ラットでは筋緊張と角膜の反射をチェックして適切に麻酔していることを確認してください。不十分な麻酔では、広範な出血の原因となります。第二に、このような縫合に近すぎるドリルや副鼻腔の壁に髄膜の断裂などの副鼻腔を損傷することがある操作を避ける。第三に、硬膜は、特に鼻の領域でSCをそのままに、表面的に横たわっているように十分注意してください。

  3. RGCsがラベル付けされるまでどのくらい時間がかかりますか?

    SCの標識後の四日間、RGCは、ラベルを付けることができます。私は通常は良い​​結果は7日間を待ちます。

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Acknowledgements

著者はアメリカの健康アシスタント財団のナショナル緑内障のプログラムからの支援を感謝したいと思います。

References

  1. Ahmed, A. K. M. F., Dong, K., Sugioka, K., Yamadori, T. Retrograde double labeling of retinal ganglion cells in the newborn and adult albino rat. Neurosci. Protocols. 1, 1-11 (1996).
  2. Chan, H. C., Chang, R. C. C., Ip, A. K. C., Chiu, K., Yuen, W. H., Zee, S. Y., So, K. F. Neuroprotective effects of Lycium barbarum Lynn on protecting retinal ganglion cells in an ocular hypertension model of glaucoma. Experimental Neurology. 203, 269-273 (2007).
  3. Forrester, J., Peters, A. Nerve fibers in the optic nerve of rat. Nature. 214, 245-247 (1967).
  4. Ji, J. Z., Elyaman, W., Yip, H. K., Lee, V. W. H., Yick, L. W., Hugon, J., So, K. F. CNTF promotes survival of retinal ganglion cells after induction of ocular hypertension in rats: the possible involvement of STAT3 pathway. European Journal of Neuroscience. 19, 265-272 (2004).
  5. Li, R. S., Chen, B. Y., Tay, D. K., Chan, H. H. L., Pu, M. L., So, K. F. Melanopsin-Expressing Retinal Ganglion Cells Are More Injury-Resistant in a Chronic Ocular Hypertension Model. Investigative. Ophthalmology & Visual Science. 47, 2951-2958 (2006).

Comments

3 Comments

  1. Thank you for a step by step information.
    It would be nice to lecture us how to count(Tips and pitfall) the RGC in another movie.

    Reply
    Posted by: yoshimichi m.
    March 20, 2010 - 10:52 AM
  2. Thank you for a step by step information.
    Could you lecture us how to count(Tips and pitfall) the RGC?

    Reply
    Posted by: yoshimichi m.
    March 20, 2010 - 10:56 AM
  3. Thank you for a step by step information.
    Could you lecture us how to count(Tips and pitfall) the RGC?

    Reply
    Posted by: yoshimichi m.
    March 20, 2010 - 10:59 AM

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