הדור של Stable טראנסגנטי C. elegans שימוש Microinjection

Published 8/15/2008
11 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Biology

You must be subscribed to JoVE to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit," you agree to our policies.

 

Summary

וידאו זה מדגים את הטכניקה של microinjection לתוך בלוטת המין של C. elegans כדי ליצור חיות טרנסגניות.

Cite this Article

Copy Citation

Berkowitz, L. A., Knight, A. L., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection. J. Vis. Exp. (18), e833, doi:10.3791/833 (2008).

Please note that all translations are automatically generated through Google Translate.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

טראנסגנטי Caenorhabditis elegans ניתן ליצור בקלות דרך microinjection של פתרון ה-DNA פלסמיד לתוך בלוטת המין 1. ה-DNA פלסמיד מארגן מחדש כדי ליצור concatamers extrachromosomal כי הם ירשו ביציבות, למרות שלא כמו כרומוזומים בפועל 2 עם יעילות זהה. הגן של עניין הוא שיתוף מוזרק עם סמן פנוטיפי ברור, כגון רול-6 או ה-GFP, כדי לאפשר בחירה של בעלי חיים מהונדס תחת מיקרוסקופ לנתח. הגן אקסוגני יכול להיות מבוטא מן האמרגן שלו דובר ללימודי לוקליזציה הסלולר. לחלופין, transgene יכול להיות מונע על ידי האמרגן שונה ברקמות ספציפיות על מנת להעריך את התפקיד של המוצר גנים תא רקמה מסוימת. טכניקה זו יעילה כוננים ביטוי הגן בכל רקמות של C. elegans למעט העובר germline או בתחילת 3. יצירת חיות טרנסגניות הוא מנוצל באופן נרחב עבור מגוון של פרדיגמות הניסוי. וידאו זה מדגים את הליך microinjection לייצר תולעים מהונדס. יתר על כן, הבחירה ותחזוקה של יציבה מהונדס C. elegans קווי מתואר.

Protocol

הביטוי פלסמיד בנייה

שני פלסמידים נדרשים: אחד עבור הביטוי רקמות ספציפיות של הגן ריבית שנייה כסמן שינוי לבחירה.

ניסיוני פלסמיד

  1. בחר האמרגן אשר באה לידי ביטוי סוג רקמה / תא של עניין, למשל, עצב או שריר ספציפי האמרגן. אם אחד הוא להביע גנים מרובים בתוך הרקמה באותו קלטת האמרגן פלסמיד במערכת Gateway (Invitrogen) יכול לשמש. גישה זו מאפשרת החדרת גן כל הזרם עניין של האמרגן על ידי 4 שיבוט recombinational. ככלל, 2-5 קילו של רצפים הזרם מספיקה יש ביטוי נכון ומדויק.

  2. CDNA של הגן של עניין ניתן לשכפל בשתי דרכים:
    1. שיבוט קונבנציונלי באמצעות אנזימי הגבלה.
    2. עבור שיבוט Gateway, הוא מוגבר באמצעות PCR primers המכילים את עו"ד Gateway רצף B recombinational. CDNA הגברה הוא recombined הראשון לתוך pDONR201 התורם וקטור כדי ליצור את וקטור הערך ולאחר מכן הפך E. coli זן DH5a. להלן מבחר של recombinants מוצלח ומיני הכנה הבידוד של ה-DNA, וקטור הכניסה recombined לתוך וקטור המכיל מקדם היעד כדי ליצור את הביטוי פלסמיד. פרטים על שיבוט recombinational זמינים ידנית או Gateway Invitrogen או קולדוול et al. 5.

דה מרקר לבחירה פלסמיד

דוגמאות של פלסמידים סמן מהונדס כוללים רול-6 או שימוש מקדם קיר השרירים בגוף UNC-54 לנהוג ביטוי חלבון פלואורסצנטי. אלה פלסמידים סמן זמינים בדרך כלל מתוך הקהילה מחקר על פי דרישה.

Microinjection של C. elegans

הכנה

  1. ביצוע בידוד DNA של שני פלסמידים, כי הם להיות מוזרק. לכמת אותם ומערבבים יחד ביחס של 1:1 של 50 ng / μl כל אחד.

  2. הכנת כריות אגר:
    1. הפוך את פתרון 2% agarose במים; חום או במיקרוגל עד שהיא נמסה.
    2. הגדר את מספר 22 x 50 מ"מ על המשקפיים לכסות benchtop.
    3. בעזרת פיפטה פסטר, במקום ירידה של agarose נמס על כוס אחת לכסות מיד במקום זכוכית העטיפה השנייה על ירידה בזווית של 90 על הראשונה. חזור על מספר המשקפיים לכסות אחרים. הקוטר של הדיסק שטוח של agarose צריך להיות בין 15-20 מ"מ.
    4. לאחר agarose יש הקרושה (זה לוקח רק רגעים), להסיר את הזכוכית המכסה ולאפשר כרית אוויר יבש לגמרי (כמה שעות בלילה).
    5. חנות כריות בתא זכוכית לכסות בטמפרטורת החדר.

  3. הפוך את מעמיסים מחט פתרון ה-DNA:

    מעמיסים מחט נוצרות 100 צינורות נימי μl כי מחוממים באמצע מעל להבה פתוחה ומשך במהירות אורך כ פעמיים שלהם. שני חצאים הם התיז מלבד פעם את צינור נימי מתקרר. לאגור 10-20 מעמיסים מחט להזרקה. חנות זקוף מתלה צינור microcentrifuge. היזהר שלא לדקור את עצמך על הנקודות.

  4. הפוך את המחטים microinjection:

    המחט עשוי צינור נימי מיוחד המכיל סיב זכוכית פנימית; נימה זו משמשת הפתיל עבור פתרון ה-DNA. אלה משכו במחשב מחט חולץ. אנו משתמשים PP-830 Narishige חולץ עם הגדרה חום של 24.8. כמה מחטים נמשכים בכל פעם מאוחסנים בקופסת פלסטיק קטנה. מחטים מרובות ניתן בקלות "רכוב" על פיסת פלסטלינה עבור אחסון לטווח ארוך.

  5. קצה המחט "פורעי":

    קצה המחט microinjection נמשך קנס כך שהיא למעשה סגורה על זה בסוף וצריך שבור פתוח באמצעות רסיסים קטנים של זכוכית המכסה. אלה מוכנים על ידי לפפה 18 x 18 מ"מ זכוכית לכסות במגבת נייר ובעדינות הפעלת לחץ עד שהוא נשבר לחתיכות מספר. שברי גודל שימושי כ 3 x 4 מ"מ.

  6. לגדול פרא (N2) תולעים סוג לשלב הבגרות המוקדמת להזרקה באמצעות נהלים תקן 6. הכן על 100 מבוים כהלכה תולעים / לבנות מוזרק.

נוהל

  1. פתח את השסתום הראשי על טנק הליום המחובר זרוע microinjection המחט מחזיק. סגור את שסתום הרגולטור על מנת לאפשר הגז כדי להזין את הקו, להביא את הלחץ עד 35 psi. שימו לב כי גז ניתן לשחרר באמצעות דוושת רגל.

  2. הכנס מטעין מחט לתוך צינורות pipetter תקן הפה (נמצא במיכלים של צינורות זכוכית נימי) וכן להכין כמות קטנה של התערובת פלסמיד (~ 1 μl).

  3. מטעין המחט ממוקם בזהירות לתוך האחורי של מחט מזרק ונוסף בעדינות לאורך כל הדרך באורך שלהמחט עד התנגדות מורגשת. לגרש את פתרון ה-DNA על ידי נושבת בעדינות, ולאחר מכן להסיר את מטעין.

  4. הכנס את המחט בזרוע microinjection, נזהר כדי למקם אותה בתוך אטם גומי קטן הפנימי.

  5. מקום שבר מחט שבירת הכוס לכסות על קצה אחד של משטח אגר. מכסים את הרסיס, כמו גם את פני השטח של כל כרית אגר, עם שמן halocarbon. הנח את כרית אגר על הבמה של מיקרוסקופ הפוכה.

  6. מקמו את המחט במרכז השדה צפייה באמצעות המטרה 4X ואת התאורה שדה בהיר, אבל עדיין לא הורידו אותה לתוך השמן. כמו כן, עמדת הקצה הפנימי של רסיס של זכוכית לכסות במרכז, ולאחר מכן להתמקד בה (עדיין משתמש המטרה 4X). מנמיכים את מחט לתוך השמן, להביא אותו לתוך המטוס מוקד כמו רסיס של זכוכית המכסה. תרים את ההגדלה ידי מעבר המטרה 40X. מקדו מחדש על סף שבר ואת למקם את קצה המחט, במידת הצורך.

  7. כדי לפתוח את קצה מחט הזריקה, דחיפה בעדינות את המחט על קצה הזכוכית המכסה שבר, ואילו באותו זמן החלת פולסים קצרים של גז באמצעות דוושת רגל. המחט יהיה שבור מספיק פתוח כאשר טיפות קטנות של נוזל לברוח לסוף המחט. זרימת נוזל עודף בשל פתיחת גדולה מדי אינו רצוי, שכן הוא יהרוג את החיות.

  8. הסר את כרית אגר משלב ידי הרמת את המחט, אבל לא לשנות את ה-X או ציר Y המיקום. החלק את הבמה החוצה מתחת למחט, הסר את פנקס אגר ומניחים אותו על גבי מיקרוסקופ לנתח. העברת תולעת על כרית, מתחת לפני השטח של השמן. אם תולעת מתפתלת, שבץ בעדינות עד שהוא קשר את הפנקס אגר. התולעת לח צריך לדבוק agarose יבש.

  9. הזרקה
    1. במהירות למקום לרפד אגר בחזרה אל הבמה, מרכוז תולעת בתחום התצוגה.
    2. מנמיכים את מחט לתוך המטוס אותו להתמקד כמו התולעת.
    3. החלף את המסננים כדי הופמן תאורה (סוג של מסנן ניגודיות). זה מאפשר פרט המורפולוגי של התולעת להיות גלוי. אם Nomarski / אופטיקה DIC זמינים על היקף הפוך זה יעבוד גם. שימוש המטרה 40X, להתמקד במרכז "מגורען" סינסיציאלי של בלוטת המין התולעת, מתחת דפוס "חלת דבש" של גרעיני נבט (לבחור לפי אשך ממוקם בצד של התולעת מול מחט).
    4. לכוונן את המיקום של המחט עד קצה גם בפוקוס (את המטוס כמו "גרעיניות" את בלוטת המין).
    5. הכנס בעדינות את המחט למרכז אשך ולהחיל הדופק קצרה של לחץ הגז לגרש טיפה או שתיים של דנ"א לתוך הזרוע בלוטת המין. אתה צריך לראות גל של התפשטות הנוזל על פני אשך הדיסטלית. אל תניחו נוזלי יותר הוא טוב יותר, שכן נוזלי מדי יכול לזרום לתוך העיקול הפרוקסימלי של הזרוע בלוטת המין, אשר יכול לסגור ייצור הביצית. במידת האפשר, בהתאם למיקום של התולעת, להזריק הזרוע בלוטת המין השני באותו אופן.
    6. חשוב לעבוד במהירות תוך הזרקת תולעת, כפי שהוא יכול בקלות ליבש. ההחלטה להזרים הזרוע בלוטת המין השני הוא תלוי כמה מהר אתה יכול מחדש לתפקיד תולעת המחט. התהליך כולו רצוי לקחת פחות מ 1-2 דקות.

  10. הסר את מכסה זכוכית משלב ולמקם אותו על היקף הניתוחים. החל 1μl של M9 חיץ (22mm KH 2 PO 4, 42mM Na 2 HPO 4, NaCl 85mm, 1mm MgSO 4) ישירות על גבי התולעת מוזרק (זו עלולה להביא לפעולה והטביע את קצה פיפטה מתחת לפני השטח של הנפט halocarbon). המאגר אמור רעננותם התולעת, הוא יהיה אז לצוף מעל פני השטח משטח agarose. מעבירים את התולעת לצלחת קבוע באמצעות לאסוף תולעת. כרית agarose ניתן לעשות שימוש חוזר כמה פעמים עד שזה יותר הפך רווי מדי עם חיץ התולעים כבר לא לדבוק.

טראנסגנטי בחירה

  1. תולעים מוזרק, דור P 0, מועברים הפרט, צלחות טרי seeded bacterially (60 מ"מ) מותר להתרבות. בדרך כלל, בעלי חיים מוזרק מודגרת על 20 מעלות צלזיוס במשך 2-3 ימים עד הצאצאים להופיע.

  2. הצאצאים 1 F הם נצפו ראיות של הסמן מהונדס (כגון פלואורסצנטי) באמצעות stereomicroscope ניאון. כל נושא ניאון, F 1, בעלי חיים משובטים היא בנפרד לצלחת חדשה (מאז צאצאים של F כל 1 נחשבים קו מובהק). F 1 הרמפרודיטים מותר להתרבות. שוב, זה מתבצע בדרך כלל על 20 מעלות צלזיוס במשך 2-3 ימים עד הצאצאים להופיע.

  3. דור 2 F הוא ציין לבעלי חיים מהונדס גם כן. F 2 חיות ירשו ולהביע את מערך מהונדס נחשבים קו "יציב".

    הערה: לכל 1 F רחובגיל ייתכנו חיים מהונדס רבים, אך הם אינם יציבים. רוב F 1 חיות טרנסגניות לא יופצו לתוך F 2 קווי יציב.

    הערה: כדי לשלוט על השתנות במספר עותק הגן, ליצור מינימום של שלוש שורות יציב עצמאית לכל לבנות מוזרק.

  4. כל שורה יציבה עצמאי צריך להישמר כפי בשורה נפרדת של תולעים. כל שורה יכולה להיות מופצות על ידי העברת בעלי חיים מהונדס מספר לוחית חדשה בכל דור, זה חייב להתבצע באמצעות stereomicroscope פלורסנט אם את הסמן לבחירה הוא פלורסנט.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

כשעושים הליך זה, חשוב לזכור:
- להזריק ישירות למרכז אשך
- לא להזריק יותר מדי נוזלים
- עובדים מהר כדי למנוע dessication.

אם אתה נתקל בבעיות עם מחט, כגון זה נשבר גדול מדי, עדיף מהדורה מחודשת מחט טריים, במקום לנסות להזריק עם מחט פחות אידיאלי.

הדור של תולעים מהונדס יש יישומים רבים, כגון:
- זיהוי של גנים שעברו מוטציה, בשיטה המכונה הצלה שינוי
- מיפוי של תחומים חלבון דרך ביטוי של חלבונים מקוצץ
- אפיון התפקיד של הגן בתהליכים תאיים ומחלות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgements

אנו רוצים להכיר את רוח שיתוף פעולה של כל חברי המעבדה קולדוול. הפרעות תנועה מחקר במעבדה כבר נתמך על ידי דיסטוניה בכמן-Strauss & פרקינסון קרן, קרן הברית פרקינסון, מחלת פרקינסון האגודה האמריקאית, מחלת פרקינסון איגוד אלבמה, ג'יי מייקל פוקס, קרן למחקר פרקינסון מחקר לתואר ראשון.

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
Agarose Ultrapure Invitrogen 15510-027
Halocarbon Oil, Voltalef Hulle 10S elfatochem, France
Coverglass 18x18 mm Fisher Scientific 12-548-A
Coverglass 20x30 mm Fisher Scientific 12-548-5A
Coverglass 22x50 mm Fisher Scientific 12-545-E
100 ul Capillary VWR international 53432-921
Glass Capillary for Needles "Kwik-Fil" World Precision Instruments, Inc. 1B100F-4
Needle Puller Tool Narishige International Model PP-830
microINJECTOR System Tritech Research, Inc. MINJ-1000 Scope, Stage, Manipulator
Dissecting, with Fluorescence Microscope Nikon Instruments SMZ800
Dissecting Microscope Nikon Instruments SMZ645

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Stinchcomb, D. T., Shaw, J. E., Carr, S. H., Hirsh, D. Extrachromosomal DNA transformation of Caenorhabditis elegans. Mol. Cell. Biol. 5, 3484-3496 (1985).
  2. Mello, C. C., Kramer, J. M., Stinchcomb, D., Ambros, V. Efficient gene transfer in C.elegans: extrachromosomal maintenance and integration of transforming sequences. EMBO J. 10, 3959-3970 (1991).
  3. Kelly, W. G., Xu, S., Montgomery, M. K., Fire, A. Distinct requirements for somatic and germline expression of a generally expressed Caenorhabditis elegans gene. Genetics. 146, 227-238 (1997).
  4. Cao, S., Gelwix, C. C., Caldwell, K. A., Caldwell, G. A. Torsin-mediated neuroprotection from cellular stresses to dopaminergic neurons of C. elegans. J Neurosci. 25, 3801-3812 (2005).
  5. Caldwell, G. Integrated Genomics: A Discovery-Based Laboratory Course. John Wiley and Sons. West. Sussex, England. (2006).
  6. Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77, 71-94 (1974).

Comments

11 Comments

  1. Dear Dr. Laura A,   I am very much interested to work with you as a Researcher. Regarding myself, I would like to inform you that I did my Ph.D. degree from the Faculty of Science, Hiroshima University, Japan. I completed my M.Phil. M.Sc. and B.Sc. (Honours) degree from the University of Rajshahi, Bangladesh. Now I am working on toxic response and behavior of C. elegans as a postdoctoral researcher at Pusan National University, S. Korea.    I would be glad if you would kindly accept me as a Researcher in your Laboratory and provide me a fellowship or any financial support.   I look forward to your kind reply at your earliest convenience.   With best regards   Sincerely yours, Dr. M. Golam Mortuza Present Address Postdoctoral Researcher Lab of Ecology and Behavior System Division of Biological Sciences Pusan National University Busan 609-735, S. Korea E-mail: mortuzaru@yahoo.com   Permanent Address Professor Department of Zoology Rajshahi University Rajshahi 6²05, BANGLADESH E-mail: mortuza@ru.ac.bd

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 15, 2009 - 2:41 AM
  2. Hi, i am learning microinjection in C. elegans and am having problems recovering the worms.  They seem to recover fine initially and are thrashing around in the buffer on the plate, but after a day when I look back they have all died on the plate where they were placed.  I don't know what is wrong, do you have any suggestions? Thanks. Jane

    Reply
    Posted by: Anonymous
    May 22, 2009 - 1:57 PM
  3. Dear Jane,
    Death post injection is likely from two causes. The first is that the worms spent too much time stuck down on the agar pad before being hydrated off. Often they will be alive (barely) but then die. Reducing the time they spend stuck down will stop this source of death. As you become more adept and quicker with the process this will improve. The second cause of post injection death is from the worm getting stabbed too much- either from being injected in the wrong place (intestine), being injected too deeply (the &#x²01C;shish-kabob&#x²01D; mistake) or using too big of a needle. Often one can tell if this is the problem when the next day the injected worm has exploded out its guts. Make sure you are using a very tiny, fine tip in the needle and only barely enter under the cuticle into the gonad. Again these will improve with practice.

    One last thought- when you transfer the worm from the injection pad to the plate sometimes oil comes along with it. Gently move the worm out from the oil droplet onto the food. This will help it recover.
    Good luck!

    Laura

    Reply
    Posted by: Anonymous
    May 26, 2009 - 1:18 PM
  4. Hi Laura,
    Thanks so much for replying to my message. I think my problem is that I am always injecting in the wrong place. Occasionally they explode after injection, in which case I know I have injected too much or stabbed too much. My needle is very fine and is penetrating quite easily but only every once in a while dŒs it look like I have hit the gonad. I am trying to line it up so that I can see the nuclei on either side, but I still seem to miss most of the time. It mostly seems to be in the body of the worm. Do you have any tips for how I can improve my accuracy of hitting the gonad?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    May 28, 2009 - 3:20 PM
  5. Dear Jane,
    I was trying to figure out how to help you visualize exactly where to inject. Here are some additional pointers and details from the video.

    I discuss how the dead center best spot for injecting is in the grainy interior of the gonad. Depending on your optics this may be very faint and hard to see. This graininess is like sand compared to the &#x²01C;pebble&#x²01D;-like appearance of the intestine. The gonad interior has also been described as a fine &#x²01C;velvetly&#x²01D; texture.

    If you go back and watch the video at time 8:08 that worm is a little too dry- see how the embryos (which don&#x²019;t dry out) are standing out more.
    In frame 8:²7 a nice view of the gonad with the arrow is shown. You can see an impression of the germ nuclei, but the &#x²01C;graininess&#x²01D; isn&#x²019;t too visible.
    Starting at 8:4² there is also a nice view of the animal and its major features. The lower left portion curving up towards the left is intestine. On the upper side moving towards the right are oocytes from the distal arm of the gonad. In the middle, between the oocytes and the intestine, lies a view of the proximal gonad exactly where it should be injected. At 8:53 the needle seems to be positioned correctly but what you see upon injection is the oocytes expanding outward, indicating that the needle tip wasn&#x²019;t positioned properly.
    At 9:06 shows a perfect gonad hit.

    Also, I try (if possible) to position the worm such that I am injecting closer to parallel to the worm rather than perpendicular to it. The force needed to puncture the cuticle when coming in at a 90o angle to the long axis of the worm is higher and results in a greater chance of going through into the intestine or even &#x²01C;shish-kabob&#x²01D;. I usuall try to position the worm and the needle at 15-30o angles to each other. For example see 8:53 & 9:06 (preferred) vs 8:57

    Hope these will help you.
    Laura

    Reply
    Posted by: Laura B.
    June 15, 2009 - 11:47 AM
  6. Hello!

    I am currently designing an automated system for c.elegans injections that involves circulating worms through microchannel in a PDMS chip and positioning them for injection from a microneedle. One of the important aspects of our design is to fabricate microneedles which can more easily puncture the worm's cuticle due to smaller needle size.

    However, we have been unable to find any reference, print or electronic, that has measured the force needed to puncture the worm. This force is important in choosing how thin our needles can be, and of course the force dŒs vary with needle tip size. We may need to experimentally determine this "puncture strength" ourselves as the first to ever do so, but I am wondering if you might know of anyone who has measured similar parameters that we can at least get a ballpark place to start.

    Thanks so much!

    -- Andrew

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 22, 2009 - 5:52 PM
  7. Andrew,

    We are not aware of the type of precise information on puncture strength or penetration forces required for C. elegans, as we are molecular biologists, but your question reminded me of a method I remembered (and once tried without success) from the late 1990s. The technology you describe is likely much improved or can be. Check out this paper and maybe contact the authors regarding your question.

    Genetic transformation of nematodes using arrays of micromechanical piercing structures.
    Hashmi S, Ling P, Hashmi G, Reed M, Gaugler R, Trimmer W.
    Biotechniques. 1995 Nov;19(5):766-70.

    Best of luck with your experiments. If you are ever interested in us to beta-test something as collaborators, please let us know.

    Guy

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 22, 2009 - 8:38 PM
  8. Hello,

    I am currently trying to inject double stranded DNA as an alternative approach to do tissue specific knockdown. I am following a protocol in which DNA sense and antisense fused to tissue specific promoter are injected together with a marker. According to the protocol, I should inject the PCR product directly and at the concentration of 100 ng/ul. However, when I injected this mixture into the gonad, most of the worms don't survive more than one day, which is not the case with the normal injection for generating the transgenic line.

    DŒs someone have any experience with this and can suggest me something that I should change or incorporate in my protocol to make the injection work?

    Thanks before,
    Yemima

    Reply
    Posted by: Anonymous
    June 6, 2011 - 12:21 PM
  9. We would like to start doing microinjections in our lab and I am would like to know where you acquired the halocarbon oil. In the Wormbook microinjection protocol, Series 700 Halocarbon oil from Halocarbon Products in NJ was used. Do you know how this compares to the Voltalef halocarbon oil that you used?

    Thank you very much for your help and for the wonderful instructional video!

    -Erin

    Reply
    Posted by: Erin M.
    March 13, 2013 - 1:40 PM
  10. Dear Erin,
    We no longer can get the Voltalef oil and have too switched to using Halocarbon oil 700 (but ours is from Sigma). It is a bit thinner than the Voltalef, but it works as well, if not even a little better. Glad you like the video. Good luck with the injections. --Laura

    Reply
    Posted by: Laura B.
    March 13, 2013 - 2:59 PM
  11. Thank you so much!

    -Erin

    Reply
    Posted by: Erin M.
    March 17, 2013 - 11:51 AM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Video Stats