Generazione di Stabile transgenici C. elegans Utilizzando Microiniezione

Published 8/15/2008
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Biology

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Summary

Questo video mostra la tecnica di microiniezione nella gonade di C. elegans per creare animali transgenici.

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Berkowitz, L. A., Knight, A. L., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection. J. Vis. Exp. (18), e833, doi:10.3791/833 (2008).

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Abstract

Transgenici Caenorhabditis elegans possono essere facilmente create tramite microiniezione di una soluzione di DNA plasmidico in gonade 1. Il DNA plasmidico riorganizza per formare concatamers extracromosomico che sono stabilmente ereditato, anche se non con la stessa efficienza di cromosomi effettivo 2. Un gene di interesse è co-iniettata con un marker fenotipici evidenti, come ad esempio rol-6 o GFP, per consentire la selezione di animali transgenici sotto un microscopio da dissezione. Il gene esogeno può essere espresso dal suo promotore nativo per gli studi di localizzazione cellulare. In alternativa, il transgene può essere guidata da un diverso tessuto-specifica promotore di valutare il ruolo del prodotto genico in quella cella particolare o tessuto. Questa tecnica di guida in modo efficiente l'espressione genica in tutti i tessuti del C. elegans, tranne per l'embrione linea germinale o ai primi 3. Creazione di animali transgenici è ampiamente utilizzata per una vasta gamma di paradigmi sperimentali. Questo video mostra la procedura di microiniezione di generare vermi transgenici. Inoltre, la selezione e la manutenzione di stabili transgenici C. elegans linee è descritto.

Protocol

Espressione Costruzione plasmidi

Due plasmidi sono necessari: uno per espressione tessuto-specifica del gene di interesse e un secondo come marcatore trasformazione selezionabili.

Sperimentale plasmidi

  1. Selezionare un promotore che si esprime nel tessuto / cellula tipo di interesse, ad esempio, un nervo o muscolo-specifico promotore. Se uno è di esprimere geni multipli all'interno del tessuto stesso, una cassetta promotore plasmide nel sistema Gateway (Invitrogen) può essere utilizzato. Questo approccio consente l'inserimento di un gene di interesse a valle del promotore di 4 clonazione ricombinazione. Generalmente, 2-5 kb di sequenze a monte è sufficiente disporre di espressione corretta e precisa.

  2. Il cDNA del gene di interesse può essere clonato in due modi:
    1. Clonazione convenzionale utilizzando enzimi di restrizione.
    2. Gateway per la clonazione, è amplificato mediante PCR utilizzando primers che contengono il Gateway att sequenza B ricombinazione. Il cDNA amplificato viene prima ricombinato nel pDONR201 vettore donatore per creare il vettore di ingresso e poi trasformato in E. coli ceppo DH5a. A seguito di selezione dei ricombinanti successo e mini-prep isolamento del DNA, il vettore di ingresso viene ricombinato nel promotore contenenti vettore destinazione per creare il plasmide di espressione. Dettagli sulla clonazione ricombinazione sono disponibili sia dal manuale Gateway Invitrogen o in Caldwell et al. 5.

Marker selezionabile plasmidi

Esempi di plasmidi marcatore transgenici sono rol-6 o utilizzo del promotore muscolo del corpo muro unc-54 per guidare l'espressione di proteine ​​fluorescenti. Questi plasmidi marker sono generalmente disponibili all'interno della comunità scientifica su richiesta.

Microiniezione di C. elegans

Preparazione

  1. Procedere all'isolamento del DNA dei due plasmidi che devono essere iniettati. Quantificare loro e si mescolano in un rapporto 1:1 di 50 ng / mL ciascuno.

  2. Preparare pastiglie agar:
    1. Fare una soluzione al 2% di agarosio in acqua, calore o microonde fino alla dissoluzione.
    2. Sono di varie 22 x 50 bicchieri di copertura mm su un banco.
    3. Utilizzando una pipetta Pasteur, una goccia di agarosio fuso su una copertura in vetro e collocare immediatamente un secondo bicchiere coprire il calo a 90 alla prima. Ripetere l'operazione per diversi bicchieri coprire altre. Il diametro del disco appiattito di agarosio deve essere compreso tra 15-20 mm.
    4. Dopo l'agarosio si è solidificato (questo richiede solo momenti), togliere il vetro di copertura e permettere al pad per asciugare completamente (diverse ore a notte).
    5. Conservare le pastiglie in una scatola di vetro di copertura a temperatura ambiente.

  3. Fai caricatori aghi per soluzione di DNA:

    Caricatori aghi vengono creati da 100 microlitri tubi capillari che vengono riscaldate in mezzo su una fiamma aperta e rapidamente tirato a circa il doppio della loro lunghezza. Le due metà sono scattato a parte una volta che il tubo capillare si raffredda. Accumulo 10-20 caricatori ago per l'iniezione. Conservare in posizione verticale in un rack provetta. Prestare attenzione per non impalare se stessi i punti.

  4. Fai aghi microiniezione:

    L'ago è costituito da un tubo capillare speciale che contiene un filamento interno in vetro, questo filamento funge da stoppino per la soluzione del DNA. Questi sono tirati su un ago-estrattore macchina. Usiamo un Narishige PP-830 estrattore con una regolazione di calore di 24,8. Aghi diversi sono tirati alla volta e sono memorizzati in una scatola di plastica di piccole dimensioni. Aghi multipli possono essere facilmente "montata" su una striscia di plastilina per la conservazione a lungo termine.

  5. La punta dell'ago "interruttori":

    La punta dell'ago microiniezione viene tirato così fine che in realtà è chiuso a finire e deve essere rotto aperto con frammenti di piccole di vetro di copertura. Questi sono preparati avvolgendo una x 18 18 vetro di copertura mm in un tovagliolo di carta e delicatamente applicando una pressione fino a quando si rompe in vari pezzi. Frammenti di dimensioni utili sono circa 3 x 4 mm.

  6. Crescono wild type (N2) vermi allo stadio adulto in anticipo per iniezione utilizzando le procedure standard 6. Preparare adeguatamente messo in scena circa 100 worm / costruire iniettato.

Procedura

  1. Aprire la valvola principale di un serbatoio di elio che è collegato ad un braccio l'ago microiniezione e supporto. Chiudere la valvola di regolazione per consentire al gas di entrare nella linea, portando la pressione a 35 bar. Si noti che il gas può essere rilasciato con un pedale.

  2. Inserire un caricatore ago in una tubazione tradizionale pipetter bocca (che si trova in contenitori di vetro, tubi capillari) e redige una piccola quantità di miscela plasmide (~ 1 ml).

  3. Il caricatore ago è accuratamente inserito nel back-end di un ago per l'iniezione e delicatamente inserito tutto il percorso attraverso la lunghezza dell'ago fino ad avvertire resistenza. Espellere la soluzione di DNA da parte soffia dolcemente, quindi rimuovere il caricatore.

  4. Inserire l'ago nel braccio microiniezione, avendo cura di collocarla all'interno della guarnizione di gomma interno.

  5. Inserire un ago-rottura scheggia di vetro di copertura su un bordo di un pad agar. Coprire il frammento, così come tutta la superficie del pad agar, con olio alocarburi. Posizionare il pad agar sul palcoscenico di un microscopio invertito.

  6. Posizionare l'ago nel centro del campo visivo con l'obiettivo di 4X e di illuminazione in campo chiaro, ma non ancora la più bassa nell'olio. Inoltre, la posizione del bordo interno del frammento di copertura in vetro del centro, per poi focalizzarsi su di esso (ancora con obiettivo 4X). Abbassare l'ago nel petrolio, portandola nello stesso piano focale, come il frammento di vetro di copertura. Sollevare l'ingrandimento passando per l'obiettivo 40X. Ridefinire sul bordo del frammento e riposizionare la punta dell'ago, se necessario.

  7. Per aprire la punta di un ago per l'iniezione, DELICATAMENTE spingere l'ago contro il bordo del coperchio in vetro coccio, mentre allo stesso tempo, applicando un breve impulso di gas attraverso il pedale. L'ago sarà sufficientemente rotto aperto quando piccole gocce di liquido sfuggire alla fine l'ago. Eccesso di flusso di liquido a causa di un'apertura troppo grande non è auspicabile, in quanto uccidono gli animali.

  8. Rimuovere il tampone di agar dal palco sollevando l'ago, ma non cambiare la X o Y. posizione. Far scorrere il palco fuori da sotto l'ago, rimuovere il pad agar e mettetelo su un microscopio da dissezione. Trasferire un worm sul pad, sotto la superficie dell'olio. Se il verme si contorce, DELICATAMENTE accarezzarlo finché non tocca la tastiera agar. Il worm umido dovrebbe aderire al secco agarosio.

  9. Iniezione
    1. Rapidamente posto sul retro pad agar sul palco, centrando il verme nel campo visivo.
    2. Abbassare l'ago nel stesso piano di messa a fuoco come il verme.
    3. Passa i filtri per Hoffman illuminazione (un tipo di filtro di contrasto). Questo permette dettaglio morfologico del worm per diventare visibili. Se Nomarski / DIC ottica sono disponibili sulla portata rovesciata che funziona altrettanto bene. Utilizzando l'obiettivo 40X, si concentrano sul centro "sgranata" sinciziale della gonade verme, sotto il pattern "a nido d'ape" dei nuclei germinali (scegliere quale gonade è posizionato sul lato del worm verso l'ago).
    4. Ottimizzare la posizione dell'ago fino a quando la punta è messa a fuoco (sullo stesso piano della gonade "granulosità").
    5. Inserire delicatamente l'ago nel centro della gonade e applicare un breve impulso di pressione del gas per espellere una goccia o due di DNA nel braccio gonade. Si dovrebbe osservare un'onda di diffusione in tutto il liquido gonade distale. Non assumere più liquidi è meglio, in quanto il liquido troppo può fluire nel piegare prossimale del braccio gonade, che può fermare la produzione di ovociti. Se possibile, a seconda della posizione del worm, iniettare l'altro braccio gonade nello stesso modo.
    6. E 'importante lavorare velocemente, mentre l'iniezione di un verme, come si può facilmente essiccare. La decisione di iniettare il secondo braccio gonade dipende da quanto velocemente si può riposizionare l'ago e worm. L'intero processo è effettuato, a meno di 1-2 minuti.

  10. Togliere il vetro di copertura dal palco e posizionarlo su una portata dissezione. Applicare 1ml di M9 tampone (22mm KH 2 PO 4, 42mm Na 2 HPO 4, 85mm NaCl, 1 mM MgSO 4) direttamente sul verme iniettato (questo potrebbe comportare immergendo la punta della pipetta sotto la superficie del petrolio alocarburi). Il buffer dovrebbe reidratare il worm, che sarà poi galleggiare sulla superficie pad agarosio. Trasferimento al worm di un piatto normale con un pick verme. Il pad agarosio può essere riutilizzato più volte fino a quando non è diventato troppo saturo di buffer e il worm non aderire.

Selezione transgenici

  1. Vermi iniettato, il P 0 generazione, vengono trasferiti ai singoli fresca, piatti batteri seminati (60 mm) e ha permesso di riprodurre. Tipicamente, gli animali iniettati vengono incubate a 20 ° C per 2-3 giorni fino a quando la prole apparire.

  2. Il 1 prole F sono osservati per la prova del marcatore transgenici (come fluorescenza) utilizzando uno stereomicroscopio a fluorescenza. Ogni fluorescente, vettore F 1, animale è clonato separatamente su una piastra di nuovo (in quanto discendenti da ogni F 1 sono considerati una linea distinta). La F 1 ermafroditi sono autorizzati a riprodurre. Di nuovo, questo è tipicamente effettuata a 20 ° C per 2-3 giorni fino a quando la prole apparire.

  3. La generazione F 2 è osservato per gli animali transgenici pure. F 2 animali che hanno ereditato ed esprimere l'array transgenici sono considerati una linea di "stabile".

    NOTA: Al 1 ° Fetà ci possono essere molti animali transgenici, ma non sono stabili. La maggior parte degli F 1 animali transgenici non saranno diffusi in F 2 linee stabili.

    NOTA: Per controllare la variabilità del numero di copie del gene, generare un minimo di tre linee indipendenti stabile per costruire iniettato.

  4. Ogni linea indipendente stabile dovrebbe essere mantenuto come una linea separata di vermi. Ogni linea può essere propagato con il trasferimento di diversi animali transgenici per un piatto di nuovo ad ogni generazione, questo deve essere eseguita utilizzando uno stereomicroscopio a fluorescenza se il marcatore è fluorescente.

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Discussion

Quando si esegue questa procedura, è importante ricordarsi di:
- Iniettare direttamente nel centro della gonade
- Non iniettare liquidi troppo
- Lavorare velocemente per evitare essiccazione.

Se si verificano problemi con l'ago, come si è rotto troppo grande, è meglio rifare un ago fresco, piuttosto che cercare di iniettare con meno di aghi ideale.

La generazione di vermi transgenici ha molte applicazioni quali:
- Identificazione di geni mutanti, nel metodo chiamato soccorso trasformazione
- Mappatura di domini di proteine ​​attraverso l'espressione di proteine ​​troncate
- Caratterizzazione del ruolo di un gene nei processi cellulari e le malattie.

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Acknowledgements

Vogliamo riconoscere lo spirito di cooperazione di tutti i membri Lab Caldwell. Disturbi del movimento di ricerca in laboratorio è stato sostenuto dalla Bachmann-Strauss Fondazione Parkinson e distonia, Regno Parkinson Foundation, American Parkinson Disease Association, il morbo di Parkinson Associazione dell'Alabama, Michael J. Fox Foundation for Parkinson Research, e una ricerca di laurea.

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
Agarose Ultrapure Invitrogen 15510-027
Halocarbon Oil, Voltalef Hulle 10S elfatochem, France
Coverglass 18x18 mm Fisher Scientific 12-548-A
Coverglass 20x30 mm Fisher Scientific 12-548-5A
Coverglass 22x50 mm Fisher Scientific 12-545-E
100 ul Capillary VWR international 53432-921
Glass Capillary for Needles "Kwik-Fil" World Precision Instruments, Inc. 1B100F-4
Needle Puller Tool Narishige International Model PP-830
microINJECTOR System Tritech Research, Inc. MINJ-1000 Scope, Stage, Manipulator
Dissecting, with Fluorescence Microscope Nikon Instruments SMZ800
Dissecting Microscope Nikon Instruments SMZ645

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References

  1. Stinchcomb, D. T., Shaw, J. E., Carr, S. H., Hirsh, D. Extrachromosomal DNA transformation of Caenorhabditis elegans. Mol. Cell. Biol. 5, 3484-3496 (1985).
  2. Mello, C. C., Kramer, J. M., Stinchcomb, D., Ambros, V. Efficient gene transfer in C.elegans: extrachromosomal maintenance and integration of transforming sequences. EMBO J. 10, 3959-3970 (1991).
  3. Kelly, W. G., Xu, S., Montgomery, M. K., Fire, A. Distinct requirements for somatic and germline expression of a generally expressed Caenorhabditis elegans gene. Genetics. 146, 227-238 (1997).
  4. Cao, S., Gelwix, C. C., Caldwell, K. A., Caldwell, G. A. Torsin-mediated neuroprotection from cellular stresses to dopaminergic neurons of C. elegans. J Neurosci. 25, 3801-3812 (2005).
  5. Caldwell, G. Integrated Genomics: A Discovery-Based Laboratory Course. John Wiley and Sons. West. Sussex, England. (2006).
  6. Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77, 71-94 (1974).

Comments

11 Comments

  1. Dear Dr. Laura A,   I am very much interested to work with you as a Researcher. Regarding myself, I would like to inform you that I did my Ph.D. degree from the Faculty of Science, Hiroshima University, Japan. I completed my M.Phil. M.Sc. and B.Sc. (Honours) degree from the University of Rajshahi, Bangladesh. Now I am working on toxic response and behavior of C. elegans as a postdoctoral researcher at Pusan National University, S. Korea.    I would be glad if you would kindly accept me as a Researcher in your Laboratory and provide me a fellowship or any financial support.   I look forward to your kind reply at your earliest convenience.   With best regards   Sincerely yours, Dr. M. Golam Mortuza Present Address Postdoctoral Researcher Lab of Ecology and Behavior System Division of Biological Sciences Pusan National University Busan 609-735, S. Korea E-mail: mortuzaru@yahoo.com   Permanent Address Professor Department of Zoology Rajshahi University Rajshahi 6²05, BANGLADESH E-mail: mortuza@ru.ac.bd

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 15, 2009 - 2:41 AM
  2. Hi, i am learning microinjection in C. elegans and am having problems recovering the worms.  They seem to recover fine initially and are thrashing around in the buffer on the plate, but after a day when I look back they have all died on the plate where they were placed.  I don't know what is wrong, do you have any suggestions? Thanks. Jane

    Reply
    Posted by: Anonymous
    May 22, 2009 - 1:57 PM
  3. Dear Jane,
    Death post injection is likely from two causes. The first is that the worms spent too much time stuck down on the agar pad before being hydrated off. Often they will be alive (barely) but then die. Reducing the time they spend stuck down will stop this source of death. As you become more adept and quicker with the process this will improve. The second cause of post injection death is from the worm getting stabbed too much- either from being injected in the wrong place (intestine), being injected too deeply (the &#x²01C;shish-kabob&#x²01D; mistake) or using too big of a needle. Often one can tell if this is the problem when the next day the injected worm has exploded out its guts. Make sure you are using a very tiny, fine tip in the needle and only barely enter under the cuticle into the gonad. Again these will improve with practice.

    One last thought- when you transfer the worm from the injection pad to the plate sometimes oil comes along with it. Gently move the worm out from the oil droplet onto the food. This will help it recover.
    Good luck!

    Laura

    Reply
    Posted by: Anonymous
    May 26, 2009 - 1:18 PM
  4. Hi Laura,
    Thanks so much for replying to my message. I think my problem is that I am always injecting in the wrong place. Occasionally they explode after injection, in which case I know I have injected too much or stabbed too much. My needle is very fine and is penetrating quite easily but only every once in a while dŒs it look like I have hit the gonad. I am trying to line it up so that I can see the nuclei on either side, but I still seem to miss most of the time. It mostly seems to be in the body of the worm. Do you have any tips for how I can improve my accuracy of hitting the gonad?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    May 28, 2009 - 3:20 PM
  5. Dear Jane,
    I was trying to figure out how to help you visualize exactly where to inject. Here are some additional pointers and details from the video.

    I discuss how the dead center best spot for injecting is in the grainy interior of the gonad. Depending on your optics this may be very faint and hard to see. This graininess is like sand compared to the &#x²01C;pebble&#x²01D;-like appearance of the intestine. The gonad interior has also been described as a fine &#x²01C;velvetly&#x²01D; texture.

    If you go back and watch the video at time 8:08 that worm is a little too dry- see how the embryos (which don&#x²019;t dry out) are standing out more.
    In frame 8:²7 a nice view of the gonad with the arrow is shown. You can see an impression of the germ nuclei, but the &#x²01C;graininess&#x²01D; isn&#x²019;t too visible.
    Starting at 8:4² there is also a nice view of the animal and its major features. The lower left portion curving up towards the left is intestine. On the upper side moving towards the right are oocytes from the distal arm of the gonad. In the middle, between the oocytes and the intestine, lies a view of the proximal gonad exactly where it should be injected. At 8:53 the needle seems to be positioned correctly but what you see upon injection is the oocytes expanding outward, indicating that the needle tip wasn&#x²019;t positioned properly.
    At 9:06 shows a perfect gonad hit.

    Also, I try (if possible) to position the worm such that I am injecting closer to parallel to the worm rather than perpendicular to it. The force needed to puncture the cuticle when coming in at a 90o angle to the long axis of the worm is higher and results in a greater chance of going through into the intestine or even &#x²01C;shish-kabob&#x²01D;. I usuall try to position the worm and the needle at 15-30o angles to each other. For example see 8:53 & 9:06 (preferred) vs 8:57

    Hope these will help you.
    Laura

    Reply
    Posted by: Laura B.
    June 15, 2009 - 11:47 AM
  6. Hello!

    I am currently designing an automated system for c.elegans injections that involves circulating worms through microchannel in a PDMS chip and positioning them for injection from a microneedle. One of the important aspects of our design is to fabricate microneedles which can more easily puncture the worm's cuticle due to smaller needle size.

    However, we have been unable to find any reference, print or electronic, that has measured the force needed to puncture the worm. This force is important in choosing how thin our needles can be, and of course the force dŒs vary with needle tip size. We may need to experimentally determine this "puncture strength" ourselves as the first to ever do so, but I am wondering if you might know of anyone who has measured similar parameters that we can at least get a ballpark place to start.

    Thanks so much!

    -- Andrew

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 22, 2009 - 5:52 PM
  7. Andrew,

    We are not aware of the type of precise information on puncture strength or penetration forces required for C. elegans, as we are molecular biologists, but your question reminded me of a method I remembered (and once tried without success) from the late 1990s. The technology you describe is likely much improved or can be. Check out this paper and maybe contact the authors regarding your question.

    Genetic transformation of nematodes using arrays of micromechanical piercing structures.
    Hashmi S, Ling P, Hashmi G, Reed M, Gaugler R, Trimmer W.
    Biotechniques. 1995 Nov;19(5):766-70.

    Best of luck with your experiments. If you are ever interested in us to beta-test something as collaborators, please let us know.

    Guy

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 22, 2009 - 8:38 PM
  8. Hello,

    I am currently trying to inject double stranded DNA as an alternative approach to do tissue specific knockdown. I am following a protocol in which DNA sense and antisense fused to tissue specific promoter are injected together with a marker. According to the protocol, I should inject the PCR product directly and at the concentration of 100 ng/ul. However, when I injected this mixture into the gonad, most of the worms don't survive more than one day, which is not the case with the normal injection for generating the transgenic line.

    DŒs someone have any experience with this and can suggest me something that I should change or incorporate in my protocol to make the injection work?

    Thanks before,
    Yemima

    Reply
    Posted by: Anonymous
    June 6, 2011 - 12:21 PM
  9. We would like to start doing microinjections in our lab and I am would like to know where you acquired the halocarbon oil. In the Wormbook microinjection protocol, Series 700 Halocarbon oil from Halocarbon Products in NJ was used. Do you know how this compares to the Voltalef halocarbon oil that you used?

    Thank you very much for your help and for the wonderful instructional video!

    -Erin

    Reply
    Posted by: Erin M.
    March 13, 2013 - 1:40 PM
  10. Dear Erin,
    We no longer can get the Voltalef oil and have too switched to using Halocarbon oil 700 (but ours is from Sigma). It is a bit thinner than the Voltalef, but it works as well, if not even a little better. Glad you like the video. Good luck with the injections. --Laura

    Reply
    Posted by: Laura B.
    March 13, 2013 - 2:59 PM
  11. Thank you so much!

    -Erin

    Reply
    Posted by: Erin M.
    March 17, 2013 - 11:51 AM

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