Первичные культуры нейронов гиппокампа от P0 новорожденных крыс

JoVE Journal
Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Рассечение и роста клеток от отдельной области мозга облегчает исследование клеточных и физиологических параметров. Мы опишем метод культивирования первичных клетка, которая производит нейрона обогащенного культур в свободной от сыворотки среде.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Nunez, J. Primary Culture of Hippocampal Neurons from P0 Newborn Rats. J. Vis. Exp. (19), e895, doi:10.3791/895 (2008).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Физиологических свойств нейронов гиппокампа, как правило, изучения, в особенности из-за участия гиппокампа в процессе обучения и памяти. Первичная гиппокампа культивирования клеток позволяет неврологи изучить деятельность и свойств нейронов на отдельные клетки и одного уровня синапс. В этом видео мы продемонстрируем, как изолировать и выращивать первичные клетки гиппокампа новорожденных крыс. Гиппокампе может быть изолированы друг от новорожденных животных в максимально короткий от 2 до 3 минут, и культуры могут быть сохранены на срок до двух недель. Мы также вкратце показать, как использовать эти нейроны гиппокампа для логометрических изображений кальция. Хотя этот протокол описывает процесс гиппокампа, с практически никаких изменений, он может быть применен в других регионах мозга.

Protocol

До гиппокампа изоляции

Перед началом гиппокампа изоляции, убедитесь, что все инструменты стерильны. Спрей вниз культуры капюшон с 70% этанола и поместить средства внутри капота. Вам нужно будет 6 - и 10-см чашки Петри, стерильные поли-L покрытием покровные стекла, пипетки и советы, одноразовые пипетки и электрических пипетки. С этой точки зрения, не забывайте использовать правильный метод стерильных.

  1. Включите водяной бане и убедитесь, что она нагревается до 37 ° C.
  2. Следующие решения, которые хранятся при температуре 4 ° С, будет необходимо:
    • Измененный Орла Средняя (MEM)
    • Neurobasal
    • Буферный солевой раствор Хэнка решение (HBSS)
    • Борат буферного раствора
    • Раствор натрия пируват
    • Стерильные фильтром 20% раствора глюкозы в дистиллированной воде

    • Убедитесь в том, чтобы распылить все бутылки вниз с 70% этанолом до размещения их в капот.

  3. Возьмите эти замороженные растворы из морозильника и поместить их в ванну нагревают воду:
    • 5 мл аликвоту лошадиной сыворотки
    • 1 мл аликвоту B-27 дополнения
    • 1 мл аликвоту 100X антибиотикам (пенициллин плюс стрептомицин)
    • И 0,5 мл аликвоту L-глютамин
  4. После решения имеют оттаяли, взял их из водяной бани, распылить их вниз с 70% этанола, и поместите их в капот. Теперь покрытие и Neurobasal среды может быть подготовлен.
  5. После решения готовятся, крышка емкости плотно и поместите их в 37 ° С ванну, чтобы разогреть при выполнении гиппокампа изоляции.
  6. Кроме того, возьмите аликвоту протеазы трипсина (2,5%) из морозильника и поместить его в водяной бане. Трипсин переваривает расчлененный гиппокампе, которые будут выделены в следующем шаге.
  7. Возьмите 15 мл коническую трубку, наполнить его HBSS и пометьте его с лечебной группе. Именно здесь изолированных гиппокампе будут собираться в следующий шаг.

Гиппокампа Изоляция

  1. Для начала гиппокампа изоляции, убедитесь, что новорожденные щенки были чистыми и имели их молоко полосы, плаценты и пуповины удалены их мать.
  2. Место щенков в чашке Петри, спрей с 70% этилового спирта для очистки, и поместите их в капот. Животных усыпляют непосредственно перед культивирования.
  3. Для дальнейшей стерилизации взять один щенок от блюда, окуните щенка в 70% этанола, а затем на два моет стерильного HBSS.
  4. Удалите головы от тела с помощью ножниц. Используя те же ножницы, разрезать кожу и череп.
  5. Используя пару тонких пинцет, очистить череп от мозгов и место мозг в небольшой чашке Петри, содержащей небольшое количество стерильного HBSS.
  6. Пил назад полушарий головного мозга. Гиппокамп является небольшим, морские коньки-образной структуры в медиальной височной доле.
  7. Удалить гиппокампе и поместить в 3 мл HBSS в 15 мл трубки. Повторите эти действия с каждым щенком, и место каждой изолированной гиппокампа в 15 мл трубки. Теперь, пришло время отделить ткани отдельных клеток.

Гиппокампа клеточной диссоциации

  1. В конце концов гиппокампе были изолированы, заполнить 15 мл трубки до 4,5 мл HBSS.
  2. Удалить трипсина из водяной бани, спрей с этанолом, и место в капюшон. Добавить 0,5 мл трипсина в трубке, и инкубировать в течение 15 минут при температуре 37 ° C.
  3. В капот, удалять HBSS / трипсина раствор из трубки с стерильную пипетку, стараясь не мешать гиппокампе, которые осели на дне пробирки. Добавьте 5 мл HBSS к трубке и водоворот мягко. Инкубировать при 37 ° С в течение 5 минут.
  4. Повторите этот шаг в два раза, удаляя старые HBSS и заменить свежим раствором.
  5. Возьмите аликвоту ДНКазы я из холодильника. Добавить 0,5 мл ДНКазы в гиппокампе в 4,5 HBSS мл. ДНКазы добавляется способствовать инактивации фермента.
  6. Растирают раствор (или пипетки вверх и вниз), пока не будет однородной. Будьте осторожны, чтобы не вводить пузырей в гомогената.
  7. Определение жизнеспособности клеток за исключением метода трипанового синий.
  8. Возьмите 10 см чашку Петри, содержащей 6 до 8 покровные, и добавить 10 мл покрытие среды. Внести необходимое количество клеток на блюдо с покровные. Swirl мягко расходиться клеток, и убедитесь, что покровные не перекрываются.
  9. Разрешить клетки приложить на 2-4 часа в увлажненные 37 ° C инкубаторе с 5% CO 2. После подтверждения, что клетки жизнеспособны и приложил, передача покровные отдельных блюд, содержащих Neurobasal среды. Место этих блюд обратно в инкубатор.
  10. Один раз в неделю, заменить одну треть среды со свежими Neurobasal средних и экспериментальных методов лечения, по мере необходимости. Теперь, функциональные свойства этих клеток в культуре готовы изучить.

Фура-2 Кальций изображений нейронов гиппокампа

  1. После культурной нейроны гиппокампа были в пробирке в течение 48 часов (но не раньше), эксперименты кальция изображений может начаться. На данный момент, эти нейроны должны начали распространяться процессов. Оптимальный диапазон возраста кальция визуализации изо дня в пробирке 3 до 7.
  2. Нагрузка культур с Фура-2 утра в течение 30 минут при температуре 37 ° С, после чего они могут быть отображены в 20х цель использованием ксеноновой дуговой лампы для возбуждения красителя кальция индикатор и 512 бит ПЗС-камера, которая образцы каждые 150 мс.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Этот протокол был разработан как модификация оригинальной работе Гэри Банкир и Ким Гослин 1. Эта книга является важнейшим ресурсом для всех, кто интересуется культивирования клеток - не только нейрон обогащенного культур описаны в текущем протоколе.

Три наиболее важных факторов культивирования клеток являются: бесплодие, скорость, выбор используемой среды.

Стерильность - ламинарный поток / стерильной капот, асептических условиях, и стерильные инкубатор обязательны для заполнения. Загрязнение на любом этапе наносит ущерб не только к текущему эксперимент над которым вы работаете, но и последующей работы, которые могут быть запланированы. После инкубатор загрязняется, это может занять несколько недель (или месяцев), чтобы получить его очищают и стерильными. Загрязнение, хотя и не сразу видно, на видимом уровне, безусловно, влияют на жизнеспособность клеток и физиологии. Бесплодие является обязательным условием.

Скорость - здоровье культивируемых клеток сильно привязаны к времени клетки не в атмосфере и среднего контролируемой среде. Поэтому очень важно, чтобы количество времени, необходимое для удаления из клетки животного, пока клетки находятся в покрытие среды на минимальном уровне. Потому что многочисленные шаги не могут быть изменены (время в вынашиваются в трипсина или мыли), что может быть изменено это количество времени, необходимое для удаления клеток из мозга. Практика вскрытия часто. Количество времени, необходимое для этого шага должна быть воспроизводимой.

Выбор среды - Есть множество собственных средах, одна из которых является Neurobasal. До дней использования Neurobasal, глиальных кондиционированной среды (которые нужно было сделать по-отдельности - это обсуждается в книге банкира и Гослин 1) не требуется. Несмотря на это, важно, что вы знаете, что есть в среде, которая используется. Наряду с Neurobasal, дополнения, такие как B-27 часто используется. Убедитесь, что составляющие этих средних и добавки, как известно, так как они могут повлиять на свойства клеток. Это стандартная практика в моей лаборатории использовать сыворотки / уголь лишили / фенола красного среде без избегать стероидных гормонов (учитывая, что большая часть работ, выполненных в моей лаборатории расследует действия стероидных гормонов). Эта концепция - знают, что в решения, которые вы используете - имеет решающее значение для всех этапов культивирования клеток.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

JLN была поддержана MH 68347.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Antibiotic antimitotic Invitrogen 15240062
B-27 Supplement Invitrogen 17504044 Serum free
Boric Acid Sigma-Aldrich B6768
Dnase I Sigma-Aldrich DN25
Fura-2, AM cell permeant Molecular Probes, Life Technologies F1221
Glucose Sigma-Aldrich G7528
HBSS (10X) Invitrogen 14185052
HEPES Invitrogen 15630080
L-Glutamine Sigma-Aldrich G7513
MEM Invitrogen 51200038
Neurobasal Invitrogen 12348017 Without phenol red
Poly-L-Lysine Hydrobromide Sigma-Aldrich P6282
Pyruvic Acid Sigma-Aldrich P2256
Sodium Pyruvate Sigma-Aldrich P2256
Sodium Tetraborate Sigma-Aldrich
Trypsin, 2.5% (10X) Invitrogen 15090046

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Banker, G., Goslin, K. Culturing Nerve Cells, 2nd Edition. The MIT Press. (1998).

Comments

45 Comments

  1. Thank you very much for this vedio. I'd want to know how to get rid of  the debris and trash after the enzyme treatment since they are always abundant in the plate and end with ruining the neurons I need.Thanks!

    Reply
    Posted by: Anonymous
    September 30, 2008 - 11:40 AM
  2. I am not sure what enzyme treatment you are refering to. Do you mean the DNase I treatment (step 5)? If you remember, the cells are first plated in plating medium (in a large dish), then moved to smaller, individual dishes that contain the Neurobasal + medium. So if you have trash and debris during the plating, that is fine - you transfer the coverslips to another dish. If you are talking about dead cells after the transfer (such as overnight) - they are usually cleaned up by the cultures themselves. Very rarely do I have any debris what-so-ever in my dishes. 

    Reply
    Posted by: Anonymous
    October 3, 2008 - 8:48 AM
  3.   Thank you very much for your reply!

    Reply
    Posted by: Anonymous
    October 6, 2008 - 8:45 AM
  4. Thank you for producing this video - I am beginning to isoalte mouse cortical and hippocampal and found this video very helpful! I have a question regarding the isolation procedure.  Our animal facility where we breed and dissect the mice, and harvest brain tissue, is about 30 min drive to the laboratory facility where we setup and maintain cultures. Given that time is a critical factor, is there a convenient stopping point in the protocol during which I can transport the cells to the lab without incurring excessive cell damage/death? Thanks very much.  

    Reply
    Posted by: Anonymous
    October 6, 2008 - 12:59 PM
  5. As a postdoctoral fellow, I too performed my tissue dissections in a different location than where we had our incubator. Through much trial and error, we found that transporting cells while in step 1 of the Hippocampal Cell Dissociation portion of the protocol (dissociated cells in 4.5ml of HBSS+) was the best. Truth be told - for us, it was a maximum of 15 minutes, transportation time. Thirty minutes may be a bit long, and you may have some cell loss. Other colleagues have placed the cells in the test tube on ice, and they have told me viability was not an issue. But I would first see if your viability is fine without the need for placing the cells on ice. Good luck.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    October 7, 2008 - 7:59 AM
  6. Thanks very much for the advice - we'll try that, and drive faster!  ; )

    Reply
    Posted by: Anonymous
    October 8, 2008 - 10:39 AM
  7. After you remove the brain, you should put it in the cold solution that was bobbelld with O² and then place the dish on the ice. That should be ok till you get to your lab and then you can start to disect the brain in the lab.  

    Reply
    Posted by: Anonymous
    October 30, 2008 - 3:24 PM
  8. bubbled with O²? that is going to damage the the brain, oxygen radical... use mannitol in your solution...to chelate free oxygen radicals

    Reply
    Posted by: Anonymous
    September 2, 2009 - 11:10 AM
  9. Too long, try to dissect the rats in the lab

    Reply
    Posted by: Anonymous
    September 2, 2009 - 11:08 AM
  10. If the PDMS can be sterilized using UV light and how to prepare the device before using? thanks

    Reply
    Posted by: Anonymous
    October 9, 2008 - 10:48 PM
  11. First off, I do not know what you are refering to by "PDMS." Do you mean plating medium? HBSS+? Neurobasal+ media? If you mean one of those three - no, sterilizing using UV light is not always effective. We used to use UV, because it is quicker, but had issues with contamination. Buy the items sterile and only use them in a sterile hood. For the items that need to be made, sterile filter to make them sterile. And always use pressure sterilized water. And your second point - "how the prepare the device," what device? When I think of a device, I think of some tool. So I do not know what you are refering to, since no advanced tools are used in this procedure. Please respond back and I will try to answer your questions.  

    Reply
    Posted by: Anonymous
    October 11, 2008 - 10:14 PM
  12. Hi Thanks so much for this informative protocol. I just have a few questions. First, you give an extensive list of all the components needed in the particular media, but do not outline the specifc amounts/conc. of each component that make up each buffer. If you could please post the compostion of each buffer used (i.e., conc of each component in the dissection solution, plating media etc) that would be greatly appreciated! Thanks again!

    Reply
    Posted by: Anonymous
    December 2, 2008 - 4:00 PM
  13. I will do that. HBSS+: 1ml of 1M HEPES, pH 7.3 1ml of 100X antibiotic/antimitotic 10ml of 10X HBSS (calcium and magnesium free) 88ml of sterile water   Plating Medium: 86ml of MEM 10ml of horse serum 3ml of ²0% glucose (sterile filtered) 1ml of 100mM pyruvic acid   Neurobasal+: 1ml of B-²7 supplement 1ml of 100X antibiotic/antimitotic 1²5ul of L-glutamine fill to 50ml with Neurobasal (phenol red free)   I hope that is what you needed. Please let me know if you need anything more. Cheers.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    December 5, 2008 - 8:50 AM
  14. Hi: I often have a clumping problem in my mouse hippocampal cultures. Some time after day 5-7 the neurons start getting too close and eventually the soma seem to clumb together. Do you have any idea why this is happening?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    March 24, 2009 - 1:19 AM
  15. Clumping has never been an issue in my cultures. Two things come to mine - 1)the coating of the culture dishes/slides. We use pol-L-lysine, and the cells always stayed on well. They have to, because I do ratiometric imaging and purfuse solution across teh tops of the culltures. Maybe in your cultures, the interactive forces sticking the neurons together is stronger than that sticking the neurons to the dishes. ²) Or it could be that what you are seeing are clumps of glia. For some reason, the glial cells tend to clump. I am very sorry that I cannot be more helpful. Maybe you can send me a tiff image. That may allow for a better "diagnosis." 

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 19, 2009 - 10:04 AM
  16.   Dear Dr. Nunez, What is the purpose of the Acid boric? WHere do you use that? Angelo O. Rosa

    Reply
    Posted by: Anonymous
    May 21, 2009 - 9:44 AM
  17. The boric acid is used in making the borate buffer. The borate buffer is used in making the poly-L-lysine solution. Here is the recipe for the borate buffer: 1.²4g boric acid 1.90g sodium tetraborate Add both to 400ml sterile dH²0   The Poly-L-lysine is made by adding 10mg poly-L-lysine to 1ml of the borate buffer. I hope that helps.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    May 21, 2009 - 12:11 PM
  18. when i see whether the cells have attached to the coverslip after ².5 hrs of incubation, i notice that majority of the cells do attach but on changing the focus i see that a still large number of cells remain in suspension. On transferring to new culture dish with neurobasal medium, i no longer see those large number of unattached cells, but do see quite a few cells attached to the coverslip. My question is, how do I decide whether I need to let the cells attach for more time?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    August 7, 2009 - 6:16 PM
  19. This all depends upon the final density that you are shooting for. For both calcium imaging and Western blot analysis, ².5 hours of time in the plating medium is sufficient. If I plate for 3 hours, the density becomes a little too much for calcium imaging (I like to have some cells separate, and some cells making contacts with one another, and ².5 hours fits this purpose). But I would not go longer than 4 hours - you are probably going to have too high a density of cells. And you can keep the cells in plating medium overnight - some cells will never adhere. Probably because they are dead or just not healthy enough to adhere. But not worries - ².5-3 hours in plating medium is sufficient for most applications.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    August 8, 2009 - 12:55 AM
  20. Thank you very much for your prompt response. As you mentioned I use them for calcium imaging and also for immunostaining after transfection, and mRNA isolation.
    Do you also do any treatment to stop the proliferation of glia cells?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    August 8, 2009 - 4:27 PM
  21. I use ara-C (cytosine arabinoside) to stop unwanted glial cell proliferation.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    August 11, 2009 - 6:46 AM
  22. Dear Dr Nunez,
    What are the differences of a cell culture and a slice hippocampal culture will have on the tissues? Will neurons developed differently? Will neurons grow differently in a cell culture, compared to a slice tissue culture of hippocampus.?DŒs the structure of the hippocampus has any significant impact on neurogenesis and neurons development, compared to cell culture methodology? Thank you.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    September 2, 2009 - 11:17 AM
  23. Cell culture has dispersed cells, while the slice culture keeps the connectivity within the hippocampus. Basically, the cell culture is ripping the hippocampus apart, and plating the individual cells, while the slice culture removes the hippocampus as a slice and grows that whole thing in a dish. Yes, neurons will develop differently between the methods - in cell culture, they grow in the absence of their normal neighbors. If you can, I would suggest slice cultures for looking at normal development and neurogenesis. But if you want to see individual cell properties (independent of neighbors), do the cell cultures. I am sure hippocampal development is more altered in the cell cultures. We do not see much neurogenesis in cell culture, but we do see the normal developmental events in the individual neurons (such as GABA-mediated excitation). Both are great tools, and both have their strengths. I hope that helps. Contact me again if you would like further advice.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    September 4, 2009 - 9:13 AM
  24. It is really useful to have this video at hand, thank you very much. I wanted to ask about a matter not discussed here.
    I am new to primary neuronal cell cultures and I am interested in buying a CO² incubator. How important is the choice of incubator for the culturing of neurons, any thoughts/advice on the subject? It seems that IR sensor is a must, but when it comes to air jacket vs water jacket, fan no fan, UV vs high temperature decontamination I am lost. Any advice on models/reliable companies would be highly appreciated! Thank you in advance!

    Reply
    Posted by: Anonymous
    June 25, 2010 - 3:55 PM
  25. I know it has been a long time since your response - my apologies. Air vs water jacketed is important in the regulation of temperature. The assumption being that water maintains the temp more efficiently than air. The fan is another item that helps with temp maintenance, especially when you are opening and closing the door to the incubator often. I think a fan is a must, and would prefer water jacketed. I know that UV is more effective - we use UV decontamination in our hoods, and the hood people have never told us that high temps are 100% effective. As for model, I love the VWR I have used. I know that you can spend an arm and a leg. But VWR has been great for us.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    March 2, 2012 - 9:36 PM
  26. Thank you very much for this vedio. I am wondering if I know you measure osmolarity of plating media and feeding media?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 25, 2010 - 1:25 PM
  27. I am sorry, but I have never measured the osmolarity of the plating medium or the culture medium.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 30, 2010 - 3:12 PM
  28. DR,Joseph.How to avoid the growth of glial cell.Could you tell me how to use ara-C?I was confused.thanks

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 27, 2010 - 1:52 AM
  29. The ara-C, also called cytosine arabinoside, controls glial cell proliferation. This drug affects dividing cells, and since glial cells are really the only thing dividing, it is potent in killing any dividing glial cells. The ara-C can be added after cells have been in culture. Please let me know as to the confusion - do you mean concentration? Vehicle for the ara-C? How often to administer?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 30, 2010 - 3:18 PM
  30. Thank you for the video. I would like to know protocol to make PDL coated coverslip or dishes. Thanks

    Reply
    Posted by: Anonymous
    January 7, 2011 - 3:35 PM
  31. First rinse the coverslips in dH²O and leave them in nitric acid overnight. Then dip two times in milliQ H²O, and dry in an oven set to 40 degrees. Autoclave the coverslips and allow to cool to room temp. All of the remaining procedures should be performed in a laminar flow hood. Place 4-5 coverslips in a 100mm petri dish. Combine 0.5ml 10X poly-l-lysine and 4.5ml borate buffer. Cover each coverslip with 3-4 drops of the poly-l-lysine/borate buffer solution. place the coverslips overnight in a 37degree C incubator. Rinse twice with sterile H²O. If not using immediately, cover the petri dish with parafilm and store in the fridge for up to one month.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    March 2, 2012 - 9:42 PM
  32. HiA²81;
    Thank you very much for your vedio. Neurons initially grow well, but begin to detach and be broken into pieces after day ²-4; no cell survive past 1 week. Do you have any idea why this is happening? Thanks!

    Reply
    Posted by: Anonymous
    May 4, 2011 - 5:45 AM
  33. My guess is that it is a problem with the poly-L coating of the coverslips. You may want to try fresh poly-L, or another method (some people use poly-D-lysine). I have always had survival of at least 10-14 days.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    May 4, 2011 - 12:18 PM
  34. Thank you for your reply, maybe I can change the time of coating.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    May 6, 2011 - 10:02 AM
  35. What do you mean - change the time of the coating? You mean coat for longer? Or use "fresher" coverslips?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    March 2, 2012 - 9:43 PM
  36. Dr. Joseph Nunez, there are several comments regarding you use of Ara-C to control glial growth in your cultures. I have several questions. When do you first treat your cultures with Ara-C? Do you continue to treat with additional Ara-C and how often? What concentration do you use? I have been trying to use Ara-C in my own cultures but this is resulting in extensive debris. Do you have any further suggestions? Thanks!

    Reply
    Posted by: Anonymous
    May 23, 2011 - 3:57 PM
  37. Honestly, I try to avoid using Ara-C as much as I can because of the debris. I use it 4 days after the day of culturing. I use a concentration of 1uM. I do not continue to use it given I only use my cultures for a maximum of 14 days. My suggestion (please don't take this the wrong way) is to make my initial culturing as glial free as possible. So culturing at an earlier embryonic age, using less steroid containing growth factors, etc, has helped me. Sorry I cannot be more helpful.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    March 2, 2012 - 9:48 PM
  38. Hi, Thank you very much for the video. I am wondering if I know how you make a DNase solution from the powder?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    October 6, 2011 - 11:10 AM
  39. add one vial of DNA powder to 500ul ddH²O

    Reply
    Posted by: Anonymous
    March 2, 2012 - 9:45 PM
  40. Hi, Thank you very much for the video. I am wondering if I know how you make a DNase solution from the powder?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    October 6, 2011 - 11:10 AM
  41. Hello,
    A question completely unrelated to the video. Hope you could help.
    I've just begun neuronal culture experiments with chick embryos.
    I isolated the forebrain portion of the embryo from 8-day old eggs, performed a primary neuron culture isolation procedure and have counted the number of viable cells.
    I would like to know, how I would test the efficiency of my protocol/ the neuronal culture done.
    Please do let me know. Any sort of structural recognition I should be doing? How do I go about the same?
    Thanks.
    P.S: Thank you for the video.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    October 13, 2011 - 12:30 AM
  42. Not sure what you mean by efficiency, but in my lab we also are culturing CFNs from E8 embryos. You can always compare numbers of trypan blue + versus - neurons on the hemacytometer to get a % of viable cells. A very good prep will get you about 10^7 viable
    neurons per ² chick telencephali hemispheres

    Reply
    Posted by: Anonymous
    January 17, 2012 - 10:36 PM
  43. Dr. Joseph Nunez, glad to see you again, I²16;ve solved my problem. Actually, the death of my cells was caused by dissociation. Maybe the dissociation is not enough, so I pipetted up and down so strongly,and
    this may hurt the cell.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    March 5, 2012 - 12:39 AM
  44. A very helpful video protocol. One question, is it ok if we cut the heads of the pups and bring them to culture room. This kind of transportation will take 15 minute, and then isolate the hipocampus for cell or tissue culturing. Instead of isolating the hippocampus straight after choppiing head in the animal facility.

    Reply
    Posted by: Farah S.
    August 21, 2012 - 4:55 AM
  45. What you mentioned was how I (as a postdoc) used to culture when the location of our animal colony, lab and culture room were far from one another. While the best choice is to have the shortest time interval between euthanasia/brain removal and culturing, we had consistently high numbers of viable cells with the method you suggest.

    Reply
    Posted by: Joseph N.
    August 22, 2012 - 10:26 AM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics