Erken Civciv Embriyolar in situ Hibridizasyon Çift Tüm Dağı

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Bu video in situ hibridizasyon, 2 farklı genler mekansal ve zamansal ifade desen genç civciv embriyolarında görüntülenebilmekte hangi bir yöntem 2-renk tüm montaj göstermektedir. Bu yöntem başlangıçta David Wilkinson, Domingos Henrique, Phil Ingham ve David Ish-Horowicz tarafından tanıtıldı.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Psychoyos, D., Finnell, R. Double Whole Mount in situ Hybridization of Early Chick Embryos. J. Vis. Exp. (20), e904, doi:10.3791/904 (2008).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Civciv embriyo erken embriyonik gelişim çalışmaya değerli bir araçtır. Şeffaflık, erişilebilirlik ve manipülasyon kolaylığı, beyin, nöral tüp, hücre gruplarının ve kalp primordia oluşumu gen ekspresyonu çalışmak için ideal bir araçtır. Bu video 2-renk tüm montaj in situ hibridizasyon farklı adımları gösteriyor; İlk yumurta, embriyo disseke ve paraformaldehid sabit. İkincisi, embriyo prehybridization için işlenir. Embriyo daha sonra iki farklı probları, DIG akuple bir FITC akuple melezleşmiştir. Gecede hibridizasyon, embriyo DIG birleştiğinde antikor ile inkübe edilir. DIG substrat için renk reaksiyonu ve ilgi bölge mavi görünür. Embriyo daha sonra FITC birleştiğinde antikor ile inkübe edilir. Embriyo FITC ile renk reaksiyonu için işlenir ve ilgi bölge kırmızı görünür. Son olarak, embriyo, sabit ve işlenmiş phtograph ve kesit. Bir sorun giderme kılavuzu da sunulmaktadır.

Protocol

Bölüm 1: embriyoların Tespit

  1. Buz depc-PBS ile diseksiyon çanak doldurun. Buz üzerinde tutun. Forseps ile kabuk dokunarak açın ve yumurta kabuğu parçaları çıkarın.
  2. Forseps ile albümin kalın çıkarın. Kaba forseps ile yumurta sarısı kesesi, embriyo yukarı bakacak şekilde yatırın.
  3. Makas kullanarak, yolk kesesi embriyo etrafında bir kare kesti.
  4. Kaşık kullanarak, buz depc-PBS sarısı ve yerden embriyo çıkarın.
  5. Mikroskop altında, membranlar ve yumurta sarısı kaldırmak ve fiksasyon çanak transfer.
  6. Pin depc-PBS kaldırmak. Depc-PBS içinde% 4 PFA ile değiştirin ve 4 O / N düzeltmek ° C
  7. Fiksatif çıkarın. Buz depc-PBS ile değiştirin. Künt sonuna microcapillary iğne veya mikrodiseksiyon bıçak kullanarak, probun yakalama önlemek için, sinir sistemi ve kalp boşluklarında perfore.
  8. 2x 10 milyon depc-PBS% 0.1 Tween-20 (PBT) ile yıkayın. ,% 25,% 50, PBT% 75 metanol her 10 milyon dehydrate. % 100 metanol içinde iki kez embriyolar dehydrate. Metanol -20 ° C'de saklayın.

Bölüm 2: Prehybridization

  1. % 75,% 50 ve% 25 PBT metanol her embriyoların 10 milyon rehidrate. PBT 2x 10 milyon yıkayın.
  2. Bu arada, buz, soğuk fiksatif (PBT içinde% 4 paraformaldehid) hazırlar. Proteinaz K çözüm ([5 g / ml] son ​​PBT 3 ml / flakon) PBT değiştirin. Tüm flakon flakon hafifçe yuvarlayarak proteinaz K çözüm için açık olduğundan emin olun; pozlama süreleri için bkz Sorun Giderme.
  3. RNaz ücretsiz Pasteur pipeti kaldır proteinaz K kullanma ve fiksatif (2 ml) ekleyin. Tam 20 milyon için hemen buz üzerine yerleştirin.
  4. Tüm RT yıkar nutator yapılmaktadır. 2x PBT 10 milyon ve% 50 hibridizasyon tamponu içeren PBT 1x 10mn yıkayın.
  5. Hibridizasyon tamponu 1x yıkayın. 65 inkübe ° C 4-5 saat için 2 ml hibridizasyon tamponu.

Bölüm 3: problar ile melez embriyolar

  1. DIG ve Ek FITC birleştiğinde prob sentezi açıklanmıştır. Güçlü bir sinyal vermek için beklenen probu, FITC içeren nükleotidler synhesized; zayıf prob DIG içeren nükleotidler ile sentezlenmiş olmalıdır.
  2. 2 ml flakon kullanarak hibridizasyon tamponu Prewarm probları (500 ng / ml). Derhal, prob çözüm ile hibridizasyon tamponu değiştirin. Embriyoların kuru izin vermeyin. 65 yaşında 16 saat inkübe ° C.
  3. Prob hibridizasyon tamponu, 2 yıkar, 30 milyon 65 ° C ile değiştirin. 65 (1 / 1 v / v /) hibridizasyon tamponu / MABT 15 milyon yıkayın ° C

Bölüm 4: DIG antikor kuluçka ve renk reaksiyonu

  1. MABT 2x20 milyon yıkayın. 1 saat içinde% 2 BBR / MABT yıkayın. % 2% 5 saat yıkayın BBR/20 HISS / MABT (tampon engelleme). Engelleme tampon seyreltilmiş 1:2000 DIG antikor inkübe, 4 O / N ° C nutator üzerinde.
  2. MABT içinde 3x 10 milyon, her biri 1 saat ve 3x MABT içinde her yıkayın.
  3. NTMT 2x 20 milyon yıkayın. 10 ml NTMT 200ul NBT / BCIP substrat ekleyin. Hemen şişeden NTMT kaldırın ve 1-2 ml NBT / BCIP tampon ile değiştirin. Karanlıkta koyun. 20 dk sonra renk reaksiyonu Monitör, ve bundan sonraki 20 milyon aralıklarla.
  4. Renk reaksiyonu (mavi görünmelidir), 10 milyon için PBS içinde yıkayın PBS ile dolu fiksasyon çanak aşağı pin ve PBS içinde% 4 PFA çözüm yerine. 4 O / N ° C Fix
  5. Yeni sintilasyon flakon aktarın. 2x10 milyon (PBS)% 1 Tween-20 PBST yıkayın. MABT 2x 10 milyon yıkayın.
  6. 63 ° C'de MABT 30 milyon inkübe

Bölüm 5: FITC antikor kuluçka ve renk reaksiyonu

  1. Yıkama MABT 2x 10 milyon,% 2 1 saat, 5 saat engelleme tampon BBR / MABT
  2. Alkalen fosfataz çiftli anti-FITC-antikor (1:500) O / N 4 ° C de inkübe
  3. MABT içinde 3x 10 milyon, her biri 1 saat ve 3x MABT içinde her yıkayın.
  4. TBS pH 8.45 ile% 0.1 Tween-20 (TBST) 2x 20 milyon yıkayın.
  5. Vektör Kırmızı çalışma solüsyonu (5 ml) TBST kitinde reaktifler 1,2 ve 3 ile hazırlayın. Hemen şişeden TBST kaldırmak ve Vektör Kırmızı tamponu ile değiştirin. Karanlıkta koyun. 40 milyon renk reaksiyonu sonra ve daha sonra 30 milyon aralıklarla izleyin.
  6. Aşağıdaki renk reaksiyonu (kırmızı görünmelidir), PBS için embriyoların transferi.

Bölüm 6: Fiksasyon ve işleme

  1. PBS içeren fiksasyon çanak Transfer ve 4 RT veya O / N 20 milyon için% 4 PFA düzeltmek ° C.
  2. PBS, 2x 10 milyon yıkayın. Fotoğrafçılığı için işlemek için, PBS içinde% 20 gliserol (bu embriyolar saydam hale getirecek) transfer. Bir oda oluşturmak için, slaytta bunları üst üste, 2 PVC bant şeritler kesin. Merkezi bir bıçak kullanarak bir kare kesin. Kare kullanarak forseps çıkarın.
  3. Balmumu kesit için işlemek için, metanol kademeli serisi (% 25,% 50,% 75 ve% 100 PBS, her biri 10 milyon) kurutmak, PBS, yıkama 2x 10 milyon transferi geri.
  4. Propanol, 3dk ile değiştirin. 1,2,3,4-tetrahydronaphthalene ile değiştirin, 20 milyon Histoclear (2x 1 saat) izledi. 1 saat histoclear / balmumu 1 / 1 (v / v) 60 ° C ile değiştirin. Balmumu bir süreç ile değiştirin.histoloji için.

Bölüm 7: Çözümler

Hibridizasyon tamponu, mağaza -20 ° C Falcon 50 ml: 25 ml formamid; 3.25 ml (20xSSC); 0,5 ml (0,5 M EDTA), 1 ml (% 10 Tween-20), 2.5 ml (% 1'lik SDS) 125 ul (20mg/ml tRNA); 100ul (50 mg / ml heparin) MABT, 100 mM maleik asit hazırlamak, pH 7.5 NaOH ttaneli. 150mm NaCl ve% 0.1 Tween-20 ekleyin.

NTMT kullanımdan hemen önce, 50 ml: 1ml (5M NaCl), 2.5 ml (2M Tris-HCl pH9.5), 1.25 ml (2M MgCl 2), 5 ml (% 10 Tween-20).

TBST: 0.1M Tris-HCl, 0.15m NaCl, pH 8.45,% 0.1 Tween-20.

Bölüm 8: Sorun Giderme

Sorun Neden Çare
Embriyo kadar kıvrılmış Yetersiz dehidratasyon / rehidrasyon Ardışık dehidratasyon / rehidrasyon adımları sırasında 10 milyon aralıklarla koruyun
Prob sinyali yok Probe flakon parçalanır RNaz kirlenme % 1 agaroz jel üzerinde prob çalıştırın tüm flakon adım 2 Proteinaz K çözüm maruz olduğundan emin olun.
Probe etiketler kalp boşlukları bir nöral tüp Probe sıkışıp 2. adımda, delikli mikrodiseksiyon bıçak kullanarak tüm boşluklar olduğundan emin olun veya microcapillary
Embriyo aşağıdaki hibridizasyon (adım 3) parçalandı Proteinaz K adım çok uzun Hibridizasyon sıcaklığı çok yüksek sol Proteinaz K 2 milyon (evre 5 ila 7), 3 milyon (evre 8-10), 4 milyon (evre 11-13), (evre 3 ve 4) 1dk daha uzun bırakılmalıdır olmamalıdır yüksek T o melezleşme etmeyin 65 ° C daha

Bölüm 9: Temsilcilik Sonuçlar

Temsilcisi embriyolar aşağıda gösterilmiştir: (A) Embriyo (evre HH7) DIG-Sox prob (mavi) ve bir FITC-delta-1 probu (kırmızı) ile etiketlenir. (B) Embriyo (evre HH8) DIG Pax6 prob (mavi) ve FITC Shh probu (kırmızı) ile etiketlenir. Nf, sinir kat, ANP, ön nöral plaka, PSM, presomitic mezoderm, n, notokord nt, nöral tüp). Dr, laboratuvarların Probe hediyeler. C. Tabin, M. Goulding, D. Henrique, ve J. Briscoe.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

In situ hibridizasyon yöntemi 2-renk tüm montaj, ilgi duyulan bir ya da iki gen, gen ekspresyonu mekansal ve zamansal desenler belirlemek için kullanılır. Uygulamalar yeni genlerin gen ekspresyonu değerlendirilmesi (örneğin 1,2 yanı sıra, gen ekspresyonu aşağıdaki hakaret değişiklikler (embriyonik manipülasyonlar 3, boncuk 4, ve RNA veya DNA elektroporasyon 5 oluşumlar) içerir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgements

Bu çalışma, Margaret M. RHF Alkek Vakfı tarafından desteklenmiştir.

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
Eggs Animal Charles River Laboratories Premium Fertile
Stereomicroscope Microscope Leica Microsystems MZ9.5
Marsh Automatic Incubator Tool Lyon RX
Hybridization Incubator Tool Hybaid Micro-4
Adams Nutator orbital mixer Tool Fisher Scientific 14-062
Curved Forceps (1) Tool Electron Microscopy Sciences 72991-4C
Fine scissors Tool Fine Science Tools 14161-10
Spoon Tool Fine Science Tools 10370-18
Pasteur Capillary Pipette Electron Microscopy Sciences 70950-12
Microcapillary tube Sigma-Aldrich P1049-1PAK Pull using vertical micropipette puller; blunt end with fine forceps
Microdissecting knife Fine Science Tools 10056-12 Use to puncture cavities prior to in situ hybridization
Minuten pins 0.2mm diam Fine Science Tools 26002-20 Keep pins together using a magnetic stirrer;
Sylgard 184 Silicon Elastomer Curing Agent and Base Reagent Dow Corning 0001986475 Mix 1 part Curing Agent, 9 parts Base; set O/N at 37C
Diethylpyrocarbonate (depc) Reagent Acros Organics 10025025 Add 1ml depc to 1l PBS; shake; autoclave
16% PFA Reagent Electron Microscopy Sciences 15710
Tween-20 Reagent Sigma-Aldrich P1379-100ML
Proteinase K Sigma-Aldrich P2308-5MG Stock at 10 mg/ml in depc-H2O in 10ul aliquots. Store at -20C.
Formamide, deionized Reagent Ambion 9342
Yeast tRNA-25 mg Reagent Invitrogen 15401-011 Stock at 20 mg/ml in depc-H2O in 125ul aliquots. Store at -20C
Heparin Sodium salt Reagent Sigma-Aldrich H4784-250MG Stock at 50 mg/ml in depc-H2O in 100ul aliquots. Store at -20C.
SSC x20 pH5.5 Reagent Fisher Scientific PR-V4261
EDTA (0.5M) PR-V4231 Fisher Scientific
SDS Reagent Fisher Scientific BP166-100
Maleic acid Reagent Fluka 63189
B–hringer Blocking Reagent Reagent Roche Group 11096176001 Use at 2% in MABT. To make, heat with MABT for 20 mn at 60C. Can make a stock and store in 1-5 ml aliquots at 20C.
Heat inactivated sheep serum Reagent Jackson ImmunoResearch 013-000-121 Dissolve in 10 ml H2O; heat 550C, 30 mn. Aliquot at 1ml, -20C.
Anti-Digoxigenin-AP, Fab fragments Reagent Roche Group 11093274910
NBT/BCIP stock solution Reagent Roche Group 11681451001
Anti-Fluorescein-AP, Fab fragments Reagent Roche Group 11426338910
2M Tris BP1759-500 Fisher Scientific
Vector Red Alkaline Phosphatase Substrate Kit Reagent Vector Laboratories SK-5100
1,2,3,4-tetrahydronaphthalene Reagent Sigma-Aldrich 429325-100ML Under hood

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Streit, A., Berliner, A. J., Papanayotou, C., Sirulnik, A., Stern, C. D. Initiation of neural induction by FGF signaling before gastrulation. Nature. 406, 74-78 (2000).
  2. Rodríguez Esteban, C., Capdevila, J., Economides, A. N., Pascual, J., Ortiz, A., Izpisúa Belmonte, J. C. The novel Cer-like protein Caronte mediates the establishment of embryonic left-right asymmetry. Nature. 401, 243-251 (1999).
  3. Psychoyos, D., Stern, C. D. Restoration of the organizer after radical ablation of Hensen's node and the anterior primitive streak in the chick embryo. Development. 122, 3263-3273 (1996).
  4. Kawakami, M., Nakanishi, N. The role of an endogenous PKA inhibitor, PKIalpha, in organizing left-right axis formation. Development. 128, 2509-2515 (2001).
  5. Basch, M. L., Bronner-Fraser, M., Garcia-Castro, M. I. Specification of the neural crest occurs during gastrulation and requires Pax7. Nature. 441, 218-222 (2006).

Comments

1 Comment

  1. comment from author (DP): Pax6 expressed in neural folds and developing neural tube (Results section)

    Reply
    Posted by: Anonymous
    October 28, 2008 - 10:34 AM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics