Programlanabilir Çektirme Patch-pipetler ve Sharp Elektrotlar

Published 10/08/2008
6 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit", you agree to our policies.

 

Summary

Bu video elektrofizyoloji için yama pipetler ve keskin elektrotlar yapmak için programlanabilir çektirmenin nasıl kullanılacağını gösterir. Aynı prosedürü enjeksiyon iğneleri de dahil olmak üzere, çeşitli cam aletleri yapmak için kullanılan olabilir.

Cite this Article

Copy Citation

L. Brown, A., E. Johnson, B., B. Goodman, M. Making Patch-pipettes and Sharp Electrodes with a Programmable Puller. J. Vis. Exp. (20), e939, doi:10.3791/939 (2008).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Cam Mikroelektronlar (pipetler denir), on yıllar boyunca elektrofizyoloji, bir beygir olmuştur. Bugün, pipetler, cam kılcal damarların programlanabilir çektirmenin kullanarak yapılır. Bu tür araçların ısı, bir metal filament veya lazer ve yerçekimi, bir motor veya her ikisini birden kullanarak cam çizmek ya kullanarak kılcal. Intrasellüler kayıt için keskin elektrotlar, ısı, yerçekimi, ve bir motor bir kombinasyonunu kullanabilirsiniz patch-klemp kayıt için Pipetler, sadece ısı ve yerçekimi kullanılarak oluşturulur. , Hücre içi kayıt pipetler yapmak için kullanılan prosedür Crna Xenopus oosit içine enjeksiyon dahil olmak üzere çeşitli uygulamalar için enjeksiyon iğneleri, yapmak için kullanılan benzer. Ise dar cam hücre içi kayıt (dış çapı = 1.0 mm) için kullanılan genel, kılcal cam <1.2 mm çap, pipetler için yama kelepçe kayıt yapmak için kullanılır. Her araç için, çektirmenin biraz farklı programlanmıştır. Bu video kayıt pipetler, önceden belirlenmiş çektirmenin programları kullanarak her iki tür nasıl gösterir.

Protocol

Çekme pipetler

Sutter P-97 Flaming / Kahverengi olarak çektirmesi gibi bir mikroelektrot kullanarak, yaklaşık 10-20 pipetler bir set çekin.

  1. Kılcal cam seçin. Biz borosilikat (Sutter BF150-110-10, 1,5 mm, dış çapı, iç çapı 1.1mm, uzun 10cm) kullanın. Temiz ve tozsuz kalır cam dikkatlice saklayın.
  2. Çekme programı tasarlayın. Biz her aşamasında, ısı ve hızı azalan ve son adım küçük bir çekme, 5 adım programı kullanabilirsiniz. Sutter pipetle yemek kitabı uygun programlar geliştirmek için mükemmel bir referans.
  3. Pipet uçları açılış çap ve pürüzsüzlük belirlemek için mikroskop altında inceleyin. Kaba, düzensiz ya da düzensiz ipuçları atın. Iyi bir çekme protokol, bu nadir sağlamalıdır. Standart patch-klemp kayıt için 1-3 mikron çapında, ucu açıklıklar olmalıdır. Dik konik (künt uçlu) aynı açılması çapı için direncini düşürmek için yol açar. Şekil ve büyüklük basınç parlatma tarafından değiştirilebilir.

Yangın parlatma pipetler

  1. Parlatma teçhizat (microforge), bir ayak pedalı ile kontrol edilen bir platin ısıtma filament ile ayarlayın. Yararlı bir kiti ALA Bilimsel (CPM-2) veya benzer bir aparat parça parça monte edilebilir.
  2. İsteğe Bağlı: Kat kapasitans azaltmak ve gürültü özelliklerini iyileştirmek için bir yalıtkan ile pipet. Biz diş balmumu kullanın. Sylgard 184 ™ (PDMS olarak da bilinen poli-dimetil siloksan elastomer) da bir seçenektir.
  3. Mumu kullanıyorsanız, yakındaki küçük bir erimiş kaynağı tutmak. Pipet girerek mum tutmak için pipet arka tarafında hava basıncı ile sıvı balmumu içine ucu kısaca daldırma ve çıkartın. Sylgard ile mağaza hazırlanmış dondurulmuş alikot elastomer ve mikroskop altında pipet boya. Elastomer tedavisi için ısıtın.
  4. Parlatma cihazı pipet (kaplı ya da değil) koyun ve ucu ~ 50 mikron filamandan getirmek. Isıtıldığında filament genişletmek olacağını aklınızda bulundurun.
  5. Önerilen: en iyi direnç ve bahşiş çapı için pipet şeklini değiştirmek için "baskı parlatma" için ayrı protokol izleyin.
  6. Kısa bir ısı darbe (1-2 saniye), pipet ucu balmumu kaldırmak ve camın pürüzsüz yeterli.
  7. Bitmiş pipet, tozdan korumak için 10 başarılı pipetler için tekrarlamak kapalı bir kutu yerleştirin.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Protokol resimli, elektrofizyoloji laboratuarlarında günlük kullanım hem de hücreler ve hayvanlar için enjeksiyon iğneleri yapmak için kullanılır. Programlanabilir çektirmesi ile, çeşitli kullanımlar için pipetler yapmak kolaydır. Çektirmesi üzerine, dikkat ve itina ile filament bir yıl veya daha uzun sürecek. Denemelerinizin iyi şanslar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgements

Ulusal Sağlık Enstitüleri, Ulusal Bilim Vakfı, Amerikan Kalp Derneği, Müsküler Distrofi Derneği, Donald B. ve Delia E. Baxter Vakfı, Klingenstein Fonu ve McKnight Endowment for Neuroscience için: Biz aşağıdaki finansman kuruluşları ve vakıflar destek için teşekkür ederiz.

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
Micropipette Puller Instrument Sutter Instrument Co. P-97 Or similar instrument (e.g. Sutter P-87 or P-2000)
Glass Capillaries Reagent Sutter Instrument Co. BF150-86-10 Or, similar capillary glass. To make filling the pipette easier, use a capillary with a glass filament.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sutter Instrument, P-97 Pipette Cookbook. Sutter Instrument. http://www.sutter.com/contact/faqs/pipette_cookbook.pdf (2008).

Comments

6 Comments

  1. This video is just misleading any new students that pulling patch pipetts are that simple. In reality, without knowing how to program the puller, how to choose right filaments-box or other types, how to instal and allign the filament..............pipette pulling is really incomplete story. To all students who will watch this video, I encourage to start with cook book and choose right cappilary tubes for your application. Don't take the words for granted that 1-3 micron tip is good for patching. Also, you don't have to always fire polish the capillary. Readymade fire polish capillary are available as well.  

    Reply
    Posted by: Anonymous
    October 31, 2008 - 1:19 AM
  2. Dear Austin L. Brown, Brandon E. Johnson, Miriam B. Goodman, Department of Molecular and Cellular Physiology, Stanford University Thanks for demonstrating the art of pulling and making patch type pipettes. Five things to note: 1) When patching cultured cells, it is best to use BF150-86-10 as you demonstrate in the video. You can use a one line program that loops 4-5 times and it is best to use a midpoint velocity (instructions found on page ²6 in the cookbook) to have a stable and reliable program. If for some reason the tip size or resistance is not exactly as you need, you can then write the program out into a 4 or 5 line program and adjust the heat or velocity on the last line to better control the tip morphology. I personally would not create a program with gradually descending heats and velocities as this seems a bit labor intensive and maybe confusing. It could also introduce some variability. But, if it works, stick with it. There are many roads leading to the same point (so to speak), and as long as your program is stable, you will have a high yield of usable pipettes. ²) When pulling patch pipettes for slice or whole tissue, it is best to use thin walled glass BF150-110-10 and a one line program that loops two times instead of 4-5. This will provide a slightly longer  taper and a more gradual approach to the tip. This more gradual taper is best for inserting the pipette through multiple cell/tissue layers as it reduces damage to the tissue. 3) Always run a ramp test when writing a new program or using a program/puller you are not familiar with. When using a box filament (which is best to generate short tapers and high cone angles), it is best to use the ramp value for the heat setting. When using a trough filament (which generates longer tapers) it is best to use ramp+10 or ramp+15 for your heat setting. 4) The NEW P-1000 pipette puller (which is being shown at the Neuroscience meeting in December ²008 in DC) has a Cookbook feature on the touch screen menu where you can search for and install a cookbook program. Starting programs can be found by designating the filament type, glass size, and application. It will then produce a program with which to get started....so there is less guess work! It also has a "Safe Heat Mode" which will reduce the incidence of burning out the filament. 5) When pulling sharp pipettes, you can go to the General Look Up Tables at the end of the Cookbook. Here you will find Type, A, B, C, D, and E programs. I recommend starting with a Type A for PAtch, and a Type B or C for sharp electrodes where the resistances are >²0 Megohms. If anyone out there need more help, feel free to call Sutter 415-883-01²8 and ask for me (Adair) and I will be happy to help with any additional concerns. Sincerely, Adair

    Reply
    Posted by: Anonymous
    October 31, 2008 - 2:36 PM
  3. To examine the obtained pipette (5-10micrometer radii) under a microscope, is the microscope special properties (stereo, invert, ....)? Could you infrom me about it, please? Thank you.

    Reply
    Posted by: Haluk B.
    February 6, 2009 - 4:20 PM
  4. We use a Leica DM IL inverted microscope with a pl fluotar 100x objective.  The key is to have a high magnification, long-working distance objective.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 6, 2009 - 5:54 PM
  5. Thank you very much Mr. B.Johnson. Sincerely....

    Reply
    Posted by: Haluk B.
    February 7, 2009 - 9:53 PM
  6. Dear authors,
    Thank you for this great video. May I ask which dental wax you are using? Also, what is the temperature of the wax? Your help is greatly appreciated.

    Reply
    Posted by: Taro K.
    September 21, 2014 - 9:03 AM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Video Stats