रोग प्रतिरक्षण synapses और Kinapse के अध्ययन के गठन के लिए समर्थित Planar bilayers

Biology

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Summary

समर्थित planar bilayers शक्तिशाली उपकरण है कि एक प्रतिरक्षाविज्ञानी synapse में आणविक मुलाकातों मॉडल के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. यहाँ, हम कोशिका आसंजन लिपिड bilyer के ऊपरी पत्रक synapse गठन मिलाना और synapse TIRF माइक्रोस्कोपी का उपयोग गठन कल्पना जाना जाता है प्रोटीन के प्रस्तोता के लिए तरीके दिखा.

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Vardhana, S., Dustin, M. Supported Planar Bilayers for the Formation of Study of Immunological Synapses and Kinapse. J. Vis. Exp. (19), e947, doi:10.3791/947 (2008).

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Abstract

समर्थित planar bilayers शक्तिशाली उपकरण है कि एक प्रतिरक्षाविज्ञानी synapse में आणविक मुलाकातों मॉडल के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. लिम्फोसाइटों और प्रतिजन कोशिकाओं के बीच बातचीत की नकल करने के लिए, हम Ni2 + chelating लिपिड का उपयोग करने के लिए पाली हिस्टडीन टैग के साथ एक bilayer के ऊपरी पत्रक के लिए पुनः संयोजक कोशिका आसंजन और MHC प्रोटीन लंगर. Planar bilayers लिपिड तैयारी, गिलास सतहों जहां bilayer फार्म का होगा इलाज, और फिर एक विशेष कक्ष में एक प्रवाह सेल जहां लिम्फोसाइटों जोड़ा जाएगा युक्त bilayer बनाने के द्वारा उत्पन्न कर रहे हैं. फिर, bilayers नी और अपने टैग पुनः संयोजक प्रोटीन के साथ चार्ज किया जाता है जोड़ रहे हैं. अंत में, लिम्फोसाइटों प्रवाह सेल और TIRF माइक्रोस्कोपी में इंजेक्ट कर रहे हैं छवि synapse गठन और तंत्र के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि नियंत्रण टी सेल हरकत, रिसेप्टर छँटाई की साइटों, और रिसेप्टर गिरावट की साइटों.

Protocol

1. लिपिड तैयारी

  1. आदेश में प्रोटीन एक bilayer के ऊपरी पत्रक से लिंक करने के लिए, हम नी उपयोग 2 + chelating लिपिड, जो पाली हिस्टडीन टैग के साथ पुनः संयोजक प्रोटीन लंगर. कुछ सेल प्रकार के गैर - विशेष रूप से दो नी + लेपित bilayers पालन, लेकिन कर सकते हैं टी कोशिकाओं आम तौर पर नहीं, टी सेल सक्रियण का अध्ययन करने के लिए इस विधि को इष्टतम बनाने.
  2. + chelating लिपिड और क्लोरोफॉर्म - मेथनॉल के 1-2 मिलीलीटर के साथ एक ग्लास ट्यूब में उचित मात्रा में 80% phosphatidylcholine लिपिड bilayer समाधान 20% 2 नी समाधान की तैयारी के द्वारा बनाई गई है.
    1. एक गर्म (30-37 डिग्री सेल्सियस) पानी के स्नान में नाइट्रोजन गैस की एक धारा के अंतर्गत विलायक लुप्त हो जाना. यह आमतौर पर 15 मिनट के आसपास लेता है.
    2. उच्च वैक्यूम के तहत किसी भी शेष विलायक निकालें, 90 मिनट के लिए एक lyophilizer का उपयोग कर.
  3. 2% Tris खारा बफर, जो मिश्रित डिटर्जेंट / फॉस्फोलिपिड micelles का एक समाधान बनाता में एन octyl - glucoside डिटर्जेंट में lipids भंग. अंतिम फॉस्फोलिपिड एकाग्रता 0.4 मिमी होना चाहिए. Liposomes फार्म करने के लिए, Tris - खारा के 3 परिवर्तन डिटर्जेंट और फार्म liposomes हटाने के खिलाफ इस समाधान dialyze. हम आम तौर पर 1 मिलीलीटर के आदेश पर संस्करणों के साथ 6 मिमी व्यास / स्पेक्ट्रा पोर # 10 केडीए के आसपास से एक कट के साथ 2 टयूबिंग के साथ काम करते हैं. हम जब टयूबिंग clamping के लिए किसी भी हवाई बुलबुले एस बाहर के लिए सावधान कर रहे हैं. आम तौर पर हम बाँझ फिल्टर इस समाधान और स्वच्छ शर्तों के तहत डायलिसिस करते हैं, यह 70% इथेनॉल निष्फल दस्ताने का उपयोग कर से निपटने.
  4. यह समाधान क्रिस्टल स्पष्ट किया जाना चाहिए. यह argon के लिए ऑक्सीकरण रोकने गैस के तहत संग्रहीत है. यदि समाधान turbid है, तो बहु दीवारों vesicles उत्पन्न किया गया है, और आप फिर से शुरू करने की आवश्यकता होगी.

2. निर्धारण कितना ICAM-1 और MHC planar bilayer पर जमा कर रहे हैं

  1. आदेश में प्रयोग सेट करने के लिए, यह पहली बार कितना ICAM-1 और MHC दिया नी 2 के chelating + bilayer सतह क्षेत्र पर घुलनशील प्रोटीन का एक दिया एकाग्रता में जमा कर रहे हैं निर्धारित करने के लिए आवश्यक है. ऐसा करने के लिए, जमा bilayers 5 सुक्ष्ममापी व्यास ग्लास मनकों पर, शर्तों के तहत प्रोटीन समाधान के साथ ग्लास मनकों सेते हैं कि अनुमानित प्रवाह इमेजिंग के लिए इस्तेमाल किया कोशिकाओं में उन, और बाहर प्रवाह immunofluorometric परख द्वारा बाध्य प्रोटीन का घनत्व पढ़ा.
  2. Fluorescein प्रति अणु की ज्ञात संख्या के साथ FITC लेबल एंटीबॉडी सतह बाध्य प्रोटीन का पता लगाने के लिए उपयोग किया जाता है. Fluorescein मानक मोती प्रवाह microfluorimeter जांचना उपयोग किया जाता है.
  3. हम स्थितियों स्थापित करेगा कि लगभग उन पर प्रतिजन पेश कोशिकाओं के साथ 200 ICAM-1 molecules/μm2 और मैं एक - MCC91-103 जटिल के molecules/μm2 0.2-20.

3. Planar bilayers बनाने के लिए कांच के कवर फिसल जाता है सफाई

  1. Planar bilayers अनायास फार्म जब liposomes गिलास फ्यूज, लेकिन सिर्फ अगर गिलास ठीक से साफ किया जाता है.
  2. जब पिरान्हा के साथ काम कर रहे हैं, हम पूर्ण सुरक्षात्मक कपड़े पहनने एक एसिड एप्रन और भारी, एसिड प्रतिरोधी gauntlets सहित. ध्यान से जैविक कचरे से बर्बाद अलग और ठीक से निपटाने.
  3. एसिड पिरान्हा समाधान तैयार करने के लिए, एक सूखी बीकर केंद्रित सल्फ्यूरिक एसिड के 75 मिलीलीटर जोड़ने, और ध्यान से 30% हाइड्रोजन पेरोक्साइड के 25 मिलीलीटर जोड़ें. समाधान तेजी से 100 से अधिक गरमा डिग्री सेल्सियस
  4. 15 मिनट के लिए समाधान में सूखी coverslips विसर्जित कर दिया. समाधान से निकालें और प्रत्येक पक्ष पर एक मिनट के लिए शुद्ध पानी में कुल्ला. एक वैक्यूम स्रोत का उपयोग करने के लिए शुद्ध पानी नाली coverslips सूखी. पिरान्हा समाधान शांत और पिरान्हा बर्बाद कंटेनर, जो टोपी ढीला, अच्छी तरह से धूआं हुड में चिह्नित के साथ छोड़ दिया है को जोड़ने की अनुमति दें. जब liposomes, coverslips, और प्रोटीन के सभी तैयार हैं, प्रतिरक्षाविज्ञानी synapse बनने के लिए तैयार है.

4. Bilayers गठन

  1. Bilayers फार्म करने के लिए, हमारे प्रयोगशाला Bioptechs FCSII कक्षों, जो एकीकृत हीटिंग के फायदे का उपयोग करता है. FCSII प्रणाली एक स्टेनलेस स्टील के आधार पर है कि एक 0.5 मिमी शीर्ष गैसकेट, दूसरी तरफ fluidic नाली के साथ एक सतह पर एक microaqueduct हीटिंग के लिए ईण्डीयुम टिन ऑक्साइड के साथ लेपित स्लाइड, के साथ एक microfluidic कई गुना clamps, धूल से मुक्त 0.25 मिमी गैसकेट कि प्रवाह चैम्बर और पिरान्हा की ऊंचाई को परिभाषित करता है 40 मिमी दौर coverslip जिस पर bilayer बनाई है साफ कर दिया.
  2. जबकि कवर पर्ची, जिस पर bilayer बनाई है अत्यधिक हाइड्रोफिलिक और साफ की जरूरत है, microacqueduct स्लाइड वास्तव में बेहतर काम करता है अगर इसे और अधिक hydrophobic है. Microaqueduct अधिक hydrophobic यह कमरे के तापमान पर 60 मिनट के लिए 1% HSA के साथ इलाज के द्वारा प्राप्त किया है, तो शुद्ध पानी से धोने और इस कंडीशनिंग की प्रक्रिया के बाद पूरी तरह से सुखाने के रूप में उपयोग करता है के बीच. विकृत इस प्रक्रिया द्वारा छोड़ दिया प्रोटीन की कोटिंग liposome निलंबन का 1 μl एक दौर, hemispherica फार्म करने की अनुमति देता हैएल ड्रॉप है कि> 0.25 मिमी अधिक है.
  3. प्रवाह सेल और planar bilayers फार्म इकट्ठा करने के लिए, कई गुना जगह, ऊपर की ओर निर्देशित ट्यूबों के साथ एक फ्लैट सतह पर. फिर, 0 जगह है. Fluidic ट्यूब पर तैनात है, यकीन है कि यह फ्लैट बैठा है बनाने छेद के साथ 5 मिमी गैसकेट. धीरे गैसकेट पर microaqueduct पक्ष fluidic चैनलों के साथ सामना करना पड़ रहा है, जगह और यकीन है कि यह किसी भी नीचे दबाव लागू करने के बिना फ्लैट सीटें है, जब तक पुष्टि करने कि स्लाइड में छेद microfluidic ट्यूबों के साथ संरेखित करें. Microaqueduct स्लाइड के शीर्ष पर एक आयताकार बाहर काट ताकि चैनल fluidic चैनलों के साथ पंक्तिवाला है और वहाँ कोई प्रमुख हवा के रिक्त स्थान हैं के साथ धूल से मुक्त .25 मिमी गैसकेट लेटाओ.
  4. 5 के लिए एक ऐसी है कि केंद्र के लिए केंद्र एक बूंद के बीच की दूरी 2.5 मिमी है पैटर्न में microaqueduct स्लाइड की सतह पर liposome निलंबन के 1 एक्स μl बूँदें प्लेस. 5 liposome बूँदें विभिन्न रचनाओं है सकते हैं, लेकिन इस मामले में हम केवल दो bilayers, एक कोई 2 नी के साथ + chelating lipids और एक 10% नी 2 + chelating लिपिड के साथ है . फार्म का होगा
  5. एक बार इन बूंदों जगह में हैं, ध्यान से जगह कवर एक प्रस्ताव में सतह पर नीचे पर्ची. आधार पर जितनी जल्दी संभव हो दबाना. liposome बूँदें कवर पर्ची के साथ संपर्क करना चाहिए. यह संपर्क टूटा नहीं के बाद से bilayers शायद पहले से ही गठन किया है चाहिए, किसी भी अवरोधों को दोषपूर्ण bilayers में परिणाम कर सकते हैं.
  6. यह महत्वपूर्ण है करने के लिए microacqueduct के लिए माइक्रोस्कोप पर coverslip की स्थिति में सहायता के लिए स्लाइड पर कुछ छोटे स्याही के धब्बे के साथ bilayers की स्थिति निशान याद है. 20 मिनट तक प्रतीक्षा करने के लिए सुनिश्चित करें कि प्रणाली equilibrated है. सभी एक 20 मिलीलीटर लचीला टयूबिंग के बारे में 20 सेमी और एक तीन तरह से पानी निकलने की टोंटी से जुड़े सिरिंज का उपयोग कर समाधान स्थानांतरण. प्रवाह कक्ष के लिए टयूबिंग की एक छोटी लंबाई से पानी निकलने की टोंटी के दूसरे बंदरगाह के लिए पानी निकलने की टोंटी और प्रवाह कक्ष के बीच मृत मात्रा को कम करने के लिए कनेक्ट. खारा मिमी 2 2 MgCl, 1 मिमी CaCl 2, 5 मिमी ग्लूकोज और 1% मानव सीरम albumin युक्त HEPES बफर के साथ सिरिंज भरें .
  7. प्रधानमंत्री टयूबिंग और पानी निकलने की टोंटी तो वहाँ कोई हवाई बुलबुले हैं. प्रवाह कोशिकाओं के लिए इस कनेक्ट और एक प्रस्ताव में 5 मिलीग्राम के माध्यम से धक्का जबकि यकीन है कि कोई हवाई बुलबुले bilayer पर से गुजारें बनाने के लिए देख रहे हैं. अब, आप अपने bilayers होगा.

द्वारा: यह वीडियो लेख "Amoeboid हरकत की थीम पर बदलाव के रूप में रोग प्रतिरक्षण synapses और Kinapses फ़रमर और वापस करने के लिए हंटर "का समर्थन करता है माइकल एल डस्टिन, सेल और विकास जीवविज्ञान की वार्षिक समीक्षा, 24 माप, 2008.

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Comments

3 Comments

  1. Hi guys, thanks for posting this video- very clearly presented. I just have a couple of questions about formation of the bilayers. Firstly, how do the bilayers turn out without the additional lyophilizing step to remove organic solvent? I find the bilayers form well by removing solvent with a nitrogen flow, and wonder how being more thorough improves the outcome. Secondly, how uniform are the bilayers you make? Do you ever have problems with the His-tagged proteins clustering into small domains? The flow cell looks like a great way of washing/adding reagents and cells! Best wishes, Paul Dunne, Department of Chemistry, University of Cambridge

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 3, 2009 - 11:42 AM
  2. Thanks for your interest. Regarding the vacuum step.  I learned this during a rotation with Alan Kleinfeld in 1985 and have done it religiously since then.  We have had some anecdotal experiences where the detergent solubilization step seemed to go poorly when the vacuum was marginal, but have not systematically studied the effect of leaving this step out.  It may depend upon the amount of phospholipid and how good you are at making a very thin film with the solvent evaporation step. His tagged MHCI and II, ICAM-1, PDL1 and CD86 have remained largely monodispersed.  We work at a pretty low density of <500 molecules/um^².  We and others have had many more problems working with GPI anchored proteins in liposomes, although CD48 and CD58 are very well behaved.  In general I think the his tagged proteins are easier to work with and can be cleaned up by gel filtration prior to deposition if the protein forms aggregates in solution.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 20, 2009 - 8:19 AM
  3. Thanks for your response.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    June 9, 2009 - 5:34 AM

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