形成免疫突触和Kinapse研究的支持平面双层膜

Biology

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Summary

支持的平面双层功能强大的工具,可以用来模拟在免疫突触的分子间的相互作用。在这里,我们显示锚定细胞粘附蛋白来调节突触的形成脂质bilyer上单张和可视化突触的形成,使用TIRF显微镜的方法。

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Vardhana, S., Dustin, M. Supported Planar Bilayers for the Formation of Study of Immunological Synapses and Kinapse. J. Vis. Exp. (19), e947, doi:10.3791/947 (2008).

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Abstract

支持的平面双层功能强大的工具,可以用来模拟在免疫突触的分子间的相互作用。为了模仿淋巴细胞和抗原提呈细胞之间的相互作用,我们用Ni2 +的螯合血脂重组细胞粘附和MHC蛋白质锚定与聚组氨酸标签双层上层单张。准备血脂,治疗会形成的双层玻璃表面,然后形成了一个专门的包含流量将增加淋巴细胞的细胞室的双层平面双层生成。然后,双层与倪和他的标签的重组蛋白被控加入。最后,淋巴细胞注射到流通池和TIRF显微镜可用于图像的突触的形成和机制,控制T细胞的运动,受体分拣网站,和受体的退化网站。

Protocol

1。准备脂类

  1. 为了连结蛋白双层上层单张,我们使用的是镍 2 +螯合血脂,锚聚组氨酸标签的重组蛋白。某些类型的细胞可能会坚持非特异性Ni 2 +的涂层双层,但T细胞通常不这样做,使这种方法为研究T细胞活化的最佳。
  2. 脂质双分子层的解决方案是由准备解决20%的镍2 +螯合脂质和磷脂1-2毫升氯仿-甲醇在玻璃管的适当数额的80 %。
    1. 溶剂蒸发温暖(30-37 ° C)水浴下氮气流。这通常需要大约15分钟。
    2. 删除任何剩余的溶剂,在高真空冷冻干燥机使用90分钟。
  3. 2%N -辛基-葡萄糖苷的Tris缓冲液,它创建了一个解决方案洗涤剂/磷脂混合胶束的洗涤剂溶解在脂类。最后磷脂浓度应为0.4毫米。要形成脂质体,透析删除的清洁剂和形式脂质体对3的Tris -生理盐水变化的解决方案。我们平时工作与卷1毫升的顺序与光谱/ POR 6毫米直径的2#管切断与一个约10 kDa的。我们仔细排除任何气泡s时夹紧油管。我们通常是无菌过滤器的这种解决方案和清洁的条件下做透析,使用70%乙醇消毒手套进行处理。
  4. 这个解决方案应该是清澈的。它是存储在氩气,以防止氧化。如果溶液混浊,那么多壁囊泡已经产生,您将需要重新开始。

2。确定多少ICAM - 1和MHC存入平面双层

  1. 为了设立了实验,这是首先要确定多少ICAM - 1和MHC在一定浓度的可溶性蛋白沉积的Ni 2 +的螯合剂双层表面积。要做到这一点,存款双层直径5微米的玻璃珠,孵育条件下,蛋白质溶液的玻璃珠,流细胞成像,并宣读了一个流immunofluorometric检测结合蛋白密度。
  2. FITC标记的抗体与荧光素每分子已知的数字是用来检测表面结合的蛋白质。荧光素标准珠用于校准流量microfluorimeter。
  3. 我们将创造条件近似那些抗原呈现细胞ICAM - 1和200molecules/μm20.2-20我的EK - MCC91 - 103复杂molecules/μm2。

3。清洁形成平面双层玻璃盖玻片

  1. 平面双层自发形成的脂质体融合玻璃,但只有当玻璃是正确的清洁。
  2. 食人鱼工作时,我们穿全身防护服,包括酸围裙和重,耐酸笞刑。小心地从有机废物分开的浪费和妥善处置。
  3. 要准备的酸食人鱼溶液,添加75毫升浓硫酸干燥的烧杯中,并精心添加25毫升30%过氧化氢。该解决方案,迅速加热到大于100 ° C。
  4. 沉浸在15分钟的解决方案的干燥盖玻片。从溶液中取出,并在一分钟,每边纯化水冲洗。使用真空源纯净水排水干的盖玻片。允许的Piranha溶液冷却,并加入到食人鱼废物的容器,这是第松散通风柜标记,左。当所有的脂质体,盖玻片和蛋白质,有准备,免疫突触的形成。

4。成型的双层

  1. 要形成双层,我们的实验室使用Bioptechs FCSII商会,集成式加热系统的优点。 FCSII系统是在一个不锈钢底座,夹具一起与一个0.5毫米的垫片,用于加热的铟锡氧化物涂在一个表面的一个microaqueduct幻灯片,与对方的流体槽,的微流体歧管,无粉尘0.25毫米定义的流室和食人鱼高度的垫片,清洗40毫米的圆形盖玻片上形成的双层。
  2. 虽然赖以形成的双层,盖玻片,需要高度的亲水性和清洁,microacqueduct幻灯片实际工作更好,如果它的疏水性。使得microaqueduct疏水性达到1%,在室温下60分钟的人血清白蛋白与治疗,然后用纯净水清洗,并完全干燥后,这个调节过程,以及使用之间。在此过程中留下的变性蛋白质的涂层允许1μL脂质体混悬液,形成一个圆形,hemispherica升下降大于0.25毫米高。
  3. 组装流动细胞和形成平面双层,放置气歧管,管指示向上,后一个平坦的表面。然后,放置在0。 5毫米的垫片孔定位在流体管,确保它是坐在平坦。轻轻地放到垫片microaqueduct一面朝上的流体通道,并确保席位平而不申请任何下调的压力,直到验证,在幻灯片与微管的孔对齐。躺在一个长方形的削减microaqueduct幻灯片的顶部,使通道一字排开的流体通道和没有大的空气空间的无粉尘的0.25毫米的垫圈。
  4. 放置到5 × 1μL脂质体混悬液滴上表面滑动的模式,这样每下降之间的中心到中心的距离是2.5毫米microaqueduct。 5脂质体下降,可能有不同的的成分,但在这种情况下,我们只会形成双层膜,无镍2 +螯合血脂和10%的镍2 +螯合血脂。
  5. 一旦这些下降到位,小心地将盖玻片一项议案表面上。到基地钳尽快。脂质体下降,应与盖玻片接触。这种接触不应该被打破,因为双层有可能已经形成;任何中断可能会导致有缺陷的双层膜。
  6. 重要的是要记住microacqueduct幻灯片,以帮助定位显微镜的盖玻片上的几个小墨点,以纪念双层位置。等待20分钟,以确保该系统已平衡。传输所有的解决方案,用20 ml注射器连接软管约20厘米和3路阀。由短管长度活塞的另外一个端口连接到流通池,以尽量减少之间的活塞和流动池的死体积。 HEPES缓冲液含有MgCl 2的 2毫米,1毫米氯化钙2,5毫米的葡萄糖和1%的人血清白蛋白的填充注射器。
  7. 总理管和活塞,所以有没有气泡。连接流细胞,并推动通过一项议案5毫升,一边看,以确保无气泡在双层传递。现在,你有你自己的双层。

此视频文章支持“猎人收集和返回:免疫突触和Kinapses的变形虫运动的主题变奏曲“迈克尔L。达斯汀,细胞和发育生物学的年度审查,24卷, 2008。

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Comments

3 Comments

  1. Hi guys, thanks for posting this video- very clearly presented. I just have a couple of questions about formation of the bilayers. Firstly, how do the bilayers turn out without the additional lyophilizing step to remove organic solvent? I find the bilayers form well by removing solvent with a nitrogen flow, and wonder how being more thorough improves the outcome. Secondly, how uniform are the bilayers you make? Do you ever have problems with the His-tagged proteins clustering into small domains? The flow cell looks like a great way of washing/adding reagents and cells! Best wishes, Paul Dunne, Department of Chemistry, University of Cambridge

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 3, 2009 - 11:42 AM
  2. Thanks for your interest. Regarding the vacuum step.  I learned this during a rotation with Alan Kleinfeld in 1985 and have done it religiously since then.  We have had some anecdotal experiences where the detergent solubilization step seemed to go poorly when the vacuum was marginal, but have not systematically studied the effect of leaving this step out.  It may depend upon the amount of phospholipid and how good you are at making a very thin film with the solvent evaporation step. His tagged MHCI and II, ICAM-1, PDL1 and CD86 have remained largely monodispersed.  We work at a pretty low density of <500 molecules/um^².  We and others have had many more problems working with GPI anchored proteins in liposomes, although CD48 and CD58 are very well behaved.  In general I think the his tagged proteins are easier to work with and can be cleaned up by gel filtration prior to deposition if the protein forms aggregates in solution.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 20, 2009 - 8:19 AM
  3. Thanks for your response.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    June 9, 2009 - 5:34 AM

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