İmmünolojik Sinapslar ve Kinapse Eğitim Oluşumu için desteklenen Düzlemsel Bilayers

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

Desteklenen düzlemsel bilayers immünolojik sinaps moleküler etkileşimleri modellemek için kullanılabilir güçlü araçlardır. Burada, lipid bilyer üst broşür sinaps oluşumunu modüle ve sinaps oluşumu TIRF mikroskobu kullanarak görselleştirmek için bilinen hücre adezyon proteinleri demirleme için yöntemler göstermektedir.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Vardhana, S., Dustin, M. Supported Planar Bilayers for the Formation of Study of Immunological Synapses and Kinapse. J. Vis. Exp. (19), e947, doi:10.3791/947 (2008).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Desteklenen düzlemsel bilayers immünolojik sinaps moleküler etkileşimleri modellemek için kullanılabilir güçlü araçlardır. Lenfosit ve antijen sunan hücreler arasındaki etkileşimleri taklit etmek için, poli-histidin etiketleri ile bilayeri üst broşüre rekombinant hücre yapışması ve MHC proteinleri çapa Ni2 + şelat lipidler kullanın. Düzlemsel bilayers, lipid hazırlama, cam yüzeyler bilayeri oluşturacak tedavi ve sonra lenfositler eklenecek bir akış-hücre içeren özel bir odasında bilayeri oluşturan tarafından üretilir. Sonra, bilayers Ni ve onun etiketli rekombinant proteinler ile tahsil edilir eklenir. Son olarak, lenfosit akış hücresi ve TIRF mikroskopi enjekte görüntü sinaps oluşumu ve mekanizmaları kullanılabilir kontrol T hücre hareket, reseptör sıralama siteleri, ve reseptör bozulması siteler.

Protocol

1. Lipidler hazırlanması

  1. Bir bilayeri üst broşüre proteinleri bağlamak için, Ni 2 + şelat lipidler, poli-histidin etiketleri ile rekombinant proteinler çapa. Bazı hücre tipleri, Ni 2 + kaplı bilayers non-spesifik olarak uyması, ancak T-hücrelerinin, T hücre aktivasyonu eğitimi için bu yöntemi en uygun hale yok .
  2. Çift katlı lipid çözümü% 20 Ni 2 bir çözüm hazırlayarak yapılır + şelat lipid ve kloroform-metanol 1-2 ml cam tüp uygun miktarlarda% 80 fosfatidilkolin.
    1. Sıcak (30-37 ° C) su banyosunda azot gazı akışı altında çözücü buharlaşır. Bu genellikle 15 dakika sürer.
    2. 90 dakika için lyophilizer kullanarak, yüksek vakum altında kalan herhangi bir çözücü çıkarın.
  3. % 2 N-oktil-glucoside karışık deterjan / fosfolipid miseller bir çözüm oluşturur Tris-tuzlu tampon, deterjan lipidler çözülür. Son fosfolipid konsantrasyonu 0.4 mM olmalıdır. Lipozomlar formu için, Tris-tuzlu su, deterjan ve form lipozomlar kaldırmak için 3 değişikliklere karşı bu çözüm dialyze. Biz genellikle 1 ml ile 6 mm çapında yaklaşık 10 kDa kapalı bir kesim Spectra / por # 2 tüp sipariş hacimleri ile çalışmak. Biz boru sıkma, herhangi bir hava kabarcığı s dışlamak için dikkatli . Biz genellikle bu çözüm steril filtre ve% 70 etanol steril eldiven kullanarak taşıma, temiz koşullar altında diyaliz.
  4. Bu çözüm, kristal berraklığında olmalıdır. Oksidasyonu önlemek için argon gazı altında saklanır. Çözüm bulanık ise, o zaman çok duvarlı vezikül oluşturulan, yeniden başlatmanız gerekir.

2. ICAM-1 ve MHC düzlemsel bilayeri yatırılır ne kadar belirleme

  1. Deney kurmak için, ICAM-1 ve MHC çözünür protein belirli bir konsantrasyonda verilen Ni 2 + şelat çift katlı bir yüzey alanı ne kadar yatırılan belirlemek için ilk gerekli. Bunu yapmak için, mevduat bilayers 5 mikrometre çapındaki cam boncuklar, protein çözümleri ile cam boncuk koşullar altında inkübe yaklaşık görüntüleme için kullanılan akış hücreleri, ve bir akış immunofluorometric yöntemi ile bağlı protein yoğunluğu yüksek sesle okudum.
  2. Floresein başına molekülünün bilinen numaraları ile FITC etiketli antikorlar bağlı yüzey proteinleri tespit etmek için kullanılır. Floresein standart boncuk akışını microfluorimeter kalibre etmek için kullanılır.
  3. Biz koşulları kuracak yaklaşık bu antijen sunan hücrelerin ICAM-1 200 molecules/μm2 ve I-Ek-MCC91-103 kompleksi 0,2-20 molecules/μm2.

3. Düzlemsel bilayers oluşturulması için cam kapak fişleri Temizleme

  1. Düzlemsel bilayers lipozomlar cam sigorta kendiliğinden oluşması, ancak cam sadece düzgün bir şekilde temizlenir.
  2. Piranha ile çalışırken, biz bir asit önlük ve ağır, aside dayanıklı eldiven dahil olmak üzere tam koruyucu kıyafet giyin. Dikkatlice organik atıklar, atık ayırma ve düzgün atmayın.
  3. Asit Piranha çözüm hazırlamak için, kuru bir behere 75 ml konsantre sülfürik asit ekleyin ve dikkatlice 25 ml% 30 hidrojen peroksit ekleyin. Çözümü hızla 100 daha fazla ısınır ° C
  4. 15 dakika boyunca çözüm kuru lamelleri bırakın. Çözüm çıkar ve her iki tarafta bir dakika için arıtılmış su ile durulayın. Arıtılmış su boşaltmak için bir vakum kaynağı kullanarak lamelleri Kuru. Piranha çözümü soğuk ve davlumbaz işaretlenmiş kapağı gevşek, sol Piranha çöp konteyneri, eklemek için izin ver. Lipozomlar, lamelleri ve proteinlerin tüm hazırlanır, immunolojik sinaps kurulacak hazırdır.

4. Bilayers Şekillendirme

  1. Bilayers formu için, laboratuvar Bioptechs FCSII odaları, entegre ısıtma avantajlara sahip kullanır. FCSII sistemi paslanmaz çelik bir kaide üzerinde birlikte kelepçeler, diğer tarafta akışkan oluk ile 0.5 mm üst conta, ısıtma için indiyum kalay oksit ile kaplanmış bir yüzey üzerinde microaqueduct slayt, mikroakışkan manifoldu, tozsuz bir 0.25 mm akış odası ve Piranha yüksekliği tanımlar conta bilayeri oluşan 40 mm yuvarlak lamel temizlenmelidir.
  2. Bilayeri oluşan edildiği kapak kayma, yüksek hidrofilik ve temiz olması gerekir iken daha hidrofobik ise, microacqueduct slayt aslında daha iyi çalışır. Microaqueduct daha fazla hidrofobik, daha sonra saf su ile yıkama ve soğutma işleminden sonra tamamen bu kuruma yanı kullanır arasında, oda sıcaklığında 60 dakika süreyle% 1 HSA ile tedavi sağlanır yapma. Bu yordamı sola denatüre proteinlerin kaplama lipozom süspansiyon 1 ul yuvarlak, hemispherica formu sağlar> 0.25 mm yüksekliğinde l bırakın.
  3. Düz bir yüzey üzerine, yukarı doğru yönlendirilmiş tüpleri ile, akış hücresi ve form düzlemsel bilayers monte manifoldu yerleştirin. Sonra, 0 yerleştirin. 5 mm düz oturduğundan emin olmak için, akışkan tüpleri üzerine yerleştirilmiş delikli conta. Yavaşça microaqueduct tarafı yukarı bakacak şekilde akışkan kanalları ile conta üzerine yerleştirin ve slayt delikleri mikroakışkan tüpleri ile uyum doğrulayarak kadar, herhangi bir aşağı doğru basınç uygulayarak düz koltuklar emin olun. Kanal akışkan kanalları ile dizilmiş ve büyük hava boşlukları vardır böylece microaqueduct slayt üstüne bir dikdörtgen kesim ile tozsuz 0.25 mm conta yatırın.
  4. Her damla merkez-merkez arasındaki mesafe 2.5 mm böyle bir model microaqueduct slayt yüzeyinde 5 x 1 lipozom süspansiyon ul damla yukarı bakacak şekilde yerleştirin. 5 lipozom damla farklı kompozisyonlar olabilir, ancak bu durumda sadece iki bilayers hiçbir Ni 2 + şelat lipidler ve% 10 Ni 2 + şelat lipidler. Oluşturacak
  5. Bu damla sonra, kapağı tek hareketle yüzeyi aşağı kayma dikkatlice yerleştirin. Mümkün olduğunca çabuk tabanı üzerine sıkıştırın. Lipozom damla kapak kayma ile temas yapmalıdır. Bu kişi bilayers muhtemelen önceden oluşmuş beri, kırık; herhangi bir kusurlu bilayers kesintileri neden olabilir.
  6. Mikroskop lamel konumlandırmaya yardımcı olması için microacqueduct slayt üzerinde birkaç küçük mürekkep lekeleri ile bilayers konumları işaretlemek için hatırlamak önemlidir. Sistem dengelenmiş olduğundan emin olmak için 20 dakika bekleyin. Esnek borular yaklaşık 20 cm ve 3-way stopcock bağlı 20 ml şırınga kullanarak tüm çözümler aktarın. Stopcock ve akış hücresi arasında ölü hacim en aza indirmek için kısa bir boru uzunluğu akış hücresi, stopcock başka bir bağlantı noktası. 2 mM MgCl 2, 1 mM CaCl 2, 5 mM glukoz ve% 1 insan serum albümin içeren tuzlu Hepes tamponlu şırınga doldurun.
  7. Hiçbir hava kabarcıkları vardır, böylece Başbakan tüp ve stopcock. Akış hücreleri bağlayın ve hiç hava kabarcığı bilayeri üzerinden geçmek emin olun izlerken tek hareketle 5 ml ile itin. Şimdi, size bilayers olacaktır.

: Bu video makale "Amoeboid Locomotion Tema Üzerine Çeşitlemeler olarak İmmünolojik Sinapslar ve Kinapses Toplayıcı ve Geri Hunter" destekler Michael L. Dustin , Hücre ve Gelişim Biyolojisi Annual Review , Cilt 24, 2008.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Comments

3 Comments

  1. Hi guys, thanks for posting this video- very clearly presented. I just have a couple of questions about formation of the bilayers. Firstly, how do the bilayers turn out without the additional lyophilizing step to remove organic solvent? I find the bilayers form well by removing solvent with a nitrogen flow, and wonder how being more thorough improves the outcome. Secondly, how uniform are the bilayers you make? Do you ever have problems with the His-tagged proteins clustering into small domains? The flow cell looks like a great way of washing/adding reagents and cells! Best wishes, Paul Dunne, Department of Chemistry, University of Cambridge

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 3, 2009 - 11:42 AM
  2. Thanks for your interest. Regarding the vacuum step.  I learned this during a rotation with Alan Kleinfeld in 1985 and have done it religiously since then.  We have had some anecdotal experiences where the detergent solubilization step seemed to go poorly when the vacuum was marginal, but have not systematically studied the effect of leaving this step out.  It may depend upon the amount of phospholipid and how good you are at making a very thin film with the solvent evaporation step. His tagged MHCI and II, ICAM-1, PDL1 and CD86 have remained largely monodispersed.  We work at a pretty low density of <500 molecules/um^².  We and others have had many more problems working with GPI anchored proteins in liposomes, although CD48 and CD58 are very well behaved.  In general I think the his tagged proteins are easier to work with and can be cleaned up by gel filtration prior to deposition if the protein forms aggregates in solution.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 20, 2009 - 8:19 AM
  3. Thanks for your response.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    June 9, 2009 - 5:34 AM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics