Сбор и измерения Ноцицептивная и медиаторов воспаления в хирургических ран

Biology

ERRATUM NOTICE

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Carvalho, B., Clark, D. J., Yeomans, D., Angst, M. S. Collecting and Measuring Nociceptive and Inflammatory Mediators in Surgical Wounds . J. Vis. Exp. (20), e962, doi:10.3791/962 (2008).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Целью данной работы было проверить возможности сбора и измерения воспалительных и ноцицептивных биохимических посредников на место операции, оценить отношения между раны и сыворотке крови, а также определить какие-либо связи между посредником освобождения, боль и обезболивающий потребления после кесарева сечения доставки. Двадцать здоровых женщин, перенесших плановое родоразрешение кесарево со спинальной анестезией были зачислены. Экссудата раны и сыворотки посредников, боль десятки и анальгетики потребления были измерены при 1, 6, 24 и 48 часов после кесарева сечения. В ране экссудата, 19 из 20 посредников были надежно обнаружены в том числе ИЛ-1β, IL-2, ИЛ-4, ИЛ-6, IL-7, IL-8, ИЛ-10, Ил-12, Ил-13, ИЛ -17, ФНО, INFγ, G-CSF, GM-CSF, MCP-1 и MIP-1β, фактора роста нервов (ФРН), простагландина Е2 (ПГ-Е2) и вещества П. Рана ПГ-Е2 и различные цитокины пика рано , тогда как NGF показала более замедленным высвобождением. Существовали нет корреляции между концентрацией в зависимости от времени профиля раны и сыворотки цитокинов. Это исследование демонстрирует возможности сбора и измерения ноцицептивных и медиаторов воспаления при хирургических ран в определенные моменты времени. Отсутствие значимых корреляций между раны и сыворотке крови подчеркивает важность определения конкретных участков освобождении, если локализованной патологии должны быть изучены.

Protocol

Ноцицептивная и воспалительных биохимических коллекции посредника

  1. По-Q ® ® PainBuster облегчения боли Система вводится в подкожном слое путем хирургической команде незадолго до закрытия раны. Система постоянно доставляет физиологического раствора (или местной анестезией) подкожно в рану со скоростью 2 мл / ч.
  2. Трехходовой кран включен в эту систему, чтобы стремление раны экссудат в определенные моменты времени.
  3. В то время пунктах, указанных в протоколе (например, 1, 6, 24 и 48 часов после кесарева сечения), 1 мл раневого экссудата изымается в полиэтиленовый чашку, содержащую 30 мкл ингибитора протеиназ.
  4. В то же время интервалы 10 мл крови собирается в зеленой верхней трубы для сбора крови, содержащие литий гепарин. 300 мкл ингибитора протеиназ будет добавлен в пробы крови.
  5. В течение 1 часа после сбора, образцы ставятся на льду и центрифугировали при 3000 оборотов в минуту в течение 10 мин.
  6. Сыворотке крови и раны supranate удаляется и место в стандартной трубки микроцентрифужных и хранится при температуре -20 ° C.

Пробирного анализа

  1. После того как все образцы собираются, они оттаивают и проанализированы в то же время.
  2. Цитокины затем измеряется с помощью А17-мультиплекс бусинка пластины иммуноанализа массива. Мультиплекс иммуно-анализа технология позволяет опробования до 100 аналитов в теле жидкости образцов небольшого объема до 50 мкл и давать результаты сопоставимы с результатами, полученными с ИФА. Эта пластинка способна измерять интерлейкина 1ß (IL-1ß), интерлейкин 2 (IL-2), интерлейкина 4 (IL-4), интерлейкина 5 (IL-5), интерлейкина 6 (IL-6), интерлейкина 7 (IL -7), интерлейкин 8 (IL-8), интерлейкин (IL-10), интерлейкина 12 (IL-12), интерлейкина 13 (IL-13), интерлейкина 17 (IL-17), фактор некроза опухолей α (ФНО) , интерферон α (INFα), гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (G-CSF), гранулоцитов и макрофагов колониестимулирующий фактор (GM-CSF), моноцитов белка хемоаттрактант 1 (MCP-1) и макрофагов воспалительный белок 1 (MIP-1β).
  3. Фактор роста нервов измеряется с NGF антител DY256, добавив его в 17-сложной пластинку с помощью Bio-Plex комплект связи амин.
  4. Каждое измерение производится в двух экземплярах и в соответствии со спецификацией производителя. Стандартные кривые для каждого анализируемого генерируются с помощью ссылки аналитов поставляются производителями в концентрации 0,20, 0,78, 3,13, 12,5, 50, 200, 800, 3200 пг / мл плюс нулевой стандарт (физиологический раствор только). Стандартные кривые входят в каждой серии и образцом концентрации рассчитывались с Bio-Plex менеджер программного обеспечения.
  5. Е2 и простагландина субстанция Р измеряются с помощью высокой чувствительности ИФА наборов Каждое определение проводится в двух экземплярах в соответствии со спецификацией производителя.

    Рисунок 1
    Рисунок 1

    Рисунок 1: экссудата и сывороточные уровни различных про-и противовоспалительных цитокинов (интерлейкин 1ß (IL-1ß), интерлейкин 2 (IL-2), интерлейкина 4 (IL-4), интерлейкин-5 (IL-5), интерлейкин 6 (ИЛ-6), интерлейкина 7 (IL-7), интерлейкин 8 (IL-8), интерлейкин (IL-10), интерлейкина 12 (IL-12), интерлейкина 13 (IL-13), интерлейкина 17 (IL -17), фактор некроза опухолей α (ФНО-α), интерферон γ (INFγ), гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (G-CSF), гранулоцитов и макрофагов колониестимулирующий фактор (GM-CSF), моноцитов хемоаттрактант белка 1 (МСР-1 ) и макрофагов воспалительный белок 1 (MIP-1ß), фактор роста нервов (ФРН), простагландина Е2 (ПГ-Е2) и субстанция Р (SP) уровнях (пг / мл) измеряли в начале исследования, 6 и 24 часов после кесарева сечения .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

По-Q ® ® PainBuster облегчения боли системы должны быть вставлены по всей разрез в подкожном слое незадолго до закрытия раны. Это способствует стремление с помощью трехходового крана на определенные промежутки времени. По-Q ® система постоянно обеспечивает физиологического раствора подкожно в рану со скоростью 2 мл / ч. Это предотвращает свертывание катетер и повышает надежность системы для получения экссудата образцов. Если стремление экссудата трудно (примерно в 5% случаев), рассмотреть вопрос об изменении позиции субъекта (например, сидя пациента до или лежа них квартиры), толкая мягко выше раны, используя 0,5-1мл физиологического раствора флеш или снятия катетера 1-2 см.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgements

Работа д-ра Карвальо поддерживается Строительство Междисциплинарный Карьера в охране здоровья женщин исследовательский грант от Управления исследований в области здоровья женщин и Национального института детского здоровья и человеческого развития Национальных Институтов Здоровья (5K12 HD043452). Доктор Angst получил поставок (С-Q ® ® PainBuster послеоперационных болей System) и финансирования для проведения биохимических анализов из I-Flow (Лейк-Форест, Калифорния).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
On-Q® PainBuster® Post-Op Pain Relief System I-Flow, Lake Forest, CA
Complete proteinase inhibitor Roche Group
17-multiplex bead immunoassay Bio-PlexTM plate Bio-Rad
Bio-Plex amine coupling kit Bio-Rad
The NGF antibody DY256 R&D Systems
Prostaglandin E2 and substance P ELISA Kits Assay Designs

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Elshal, M. F., McCoy, J. P. Multiplex bead array assays: performance evaluation and comparison of sensitivity to ELISA. Methods. 38, 317-323 (2006).
  2. Heijmans-Antonissen, C., Wesseldijk, F., Munnikes, R. J., Huygen, F. J., van der Meijden, P., Hop, W. C., Hooijkaas, H., Zijlstra, F. J. Multiplex bead array assay for detection of 25 soluble cytokines in blister fluid of patients with complex regional pain syndrome type 1. Mediators Inflamm.. 28398, 1-8 (2006).
  3. Buvanendran, A., Kroin, J. S., Berger, R. A., Hallab, N. J., Saha, C., Negrescu, C., Moric, M., Caicedo, M. S., Tuman, K. J. Upregulation of prostaglandin E2 and interleukins in the central nervous system and peripheral tissue during and after surgery in humans. Anesthesiology. 104, 403-410 (2000).
  4. Holzheimer, R. G., Steinmetz, W. Local and systemic concentrations of pro- and anti-inflammatory cytokines in human wounds. Eur J Med Res. 5, 347-355 (2000).

Erratum

Formal Correction: Erratum: Collecting and Measuring Nociceptive and Inflammatory Mediators in Surgical Wounds
Posted by JoVE Editors on 03/07/2012. Citeable Link.

A correction was made to: Collecting and Measuring Nociceptive and Inflammatory Mediators in Surgical Wounds. A key reference was excluded.

A fifth reference:

5. Carvalho, B., Clark, D. J. & Angst, M. S. Local and Systemic Release of Cytokines, Nerve Growth Factor, Prostaglandin E2, and Substance P in Incisional Wounds and Serum Following Cesarean Delivery. The Journal of Pain : official journal of the American Pain Society 9 (7), 650-657 (2008).

was added. The abstract was updated to :

We describe a methodology by which we are able to collect and measure inflammatory and nociceptive biochemical mediators at the surgical wound site. Collecting site-specific biochemical markers allows us to evaluate the relationship between surgical wound and serum levels; determine any associations between mediator release, pain and analgesic consumption; and evaluate the effect of systemic and peripheral drug administration on surgical wound biochemistry.

This methodology has been applied to healthy women undergoing elective cesarean delivery with spinal anesthesia. Wound exudate and serum mediators, in conjunction with pain scores and analgesics consumption were measured at 1, 6, 24, and 48 hours post-cesarean delivery. Biochemical mediators that were detected included IL-1β, IL-2, IL-4, IL-6, IL-7, IL-8, IL-10, IL-12, IL-13, IL-17, TNFα, INFγ, G-CSF, GM-CSF, MCP-1 and MIP-1β, nerve growth factor (NGF), prostaglandin E2 (PG-E2) and substance P. We found no correlations between wound and serum cytokines concentrations or time-release profiles (J Pain. 2008 Jul 9(7):650-7). This article describes and demonstrates the feasibility of collecting and assaying nociceptive and inflammatory mediators in surgical wounds at specific time points. The lack of significant correlations between serum and wound levels shows the importance of determining site-specific release if surgical wounds and localized pathologies are to be studied.

from

The objectives of this study were to test the feasibility of collecting and measuring inflammatory and nociceptive biochemical mediators at the surgical site; to evaluate the relationship between wound and serum levels; and to determine any associations between mediator release, pain and analgesic consumption post-cesarean delivery. Twenty healthy women undergoing elective cesarean delivery with spinal anesthesia were enrolled. Wound exudate and serum mediators, pain scores and analgesics consumption were measured at 1, 6, 24, and 48 hours post-cesarean. In wound exudate, 19 out of 20 mediators were reliably detected including IL-1β, IL-2, IL-4, IL-6, IL-7, IL-8, IL-10, IL-12, IL-13, IL-17, TNFα, INFγ, G-CSF, GM-CSF, MCP-1 and MIP-1β, nerve growth factor (NGF), prostaglandin E2 (PG-E2) and substance P. Wound PG-E2 and various cytokines peaked early, whereas NGF showed a more delayed release. There were no correlations between the concentration versus time profile of wound and serum cytokines. This study demonstrates the feasibility of collecting and measuring nociceptive and inflammatory mediators in surgical wounds at specific time points. The lack of significant correlations between wound and serum levels emphasizes the importance of determining site-specific release if localized pathologies are to be studied.

Comments

1 Comment

  1. The technique appears robust, even if intuitive. However, as shown in the video paper, the data are collected in the presence of superfusion with local anaesthetic solution (in this case bupivacaine) which is very likely to modify the response and the local concentrations of mediators both as a direct pharmacological action of the local anaesthetic as well as through the fluid diluent effect. Moreover, adsoprtion of the various substances by the medical plastics would need evaluation. Hence a lot of control work needs to be done so that the numerical results obtained can be interpreted correctly. Perhaps the data are semiquantitative at best.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    March 4, 2009 - 6:37 PM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics