جمع وقياس وسطاء Nociceptive والتهاب في الجروح الجراحية

Biology

ERRATUM NOTICE

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Carvalho, B., Clark, D. J., Yeomans, D., Angst, M. S. Collecting and Measuring Nociceptive and Inflammatory Mediators in Surgical Wounds . J. Vis. Exp. (20), e962, doi:10.3791/962 (2008).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

وكانت أهداف هذه الدراسة لاختبار جدوى جمع وقياس وسطاء التهابات والبيوكيميائية nociceptive في موقع الجراحة ، وتقييم العلاقة بين الجرح ومستويات المصل ، وتحديد أي علاقة بين الافراج عن الوسيط والألم واستهلاك المسكنات بعد القيصرية التسليم. تم تسجيل عشرين امرأة سليمة تمر الولادة القيصرية الاختيارية مع التخدير الشوكي. تم قياس الافرازات الجرح وسطاء المصل ، درجات الألم والمسكنات الاستهلاك بنسبة 6 ، 1 ، 24 ، و 48 ساعة بعد القيصرية. في الافرازات الجرح ، تم الكشف عن 19 من أصل موثوق بها وسطاء بينهم 20 IL - 1β ، IL - 2 ، IL - 4 ، IL - 6 ، IL - 7 ، IL - 8 ، IL - 10 ، IL - 12 ، IL - 13 ، IL -17 ، TNFα ، INFγ ، G - CSF ، جنرال موتورز CSF ، 1 - MCP وMIP 1β ، عامل نمو الاعصاب (NGF) ، E2 البروستاجلاندين (PG - E2) ، وبلغت ذروتها مادة P. بالجروح PG - E2 والسيتوكينات المختلفة في وقت مبكر ، في حين أظهرت NGF بيان تأخر أكثر. لم تكن هناك علاقة بين تركيز مقابل التعريف وقت الجرح والسيتوكينات المصل. هذه الدراسة تدل على جدوى جمع وقياس وسطاء nociceptive والتهابات في الجروح الجراحية في نقطة زمنية محددة. عدم وجود ارتباط كبير بين مستويات المصل الجرح ويؤكد على أهمية تحديد مواقع محددة بالإفراج عنه إذا المترجمة هي الأمراض التي يتعين دراستها.

Protocol

Nociceptive والتهابات جمع الوسيط البيوكيميائية

  1. يتم إدراج على سؤال الألم ® ® PainBuster نظام الإغاثة في طبقة تحت الجلد من قبل الفريق الجراحي فقط قبل اغلاق الجرح. نظام يسلم باستمرار المالحة العادي (أو مخدر موضعي) تحت الجلد في الجرح بمعدل 2 مل / ساعة.
  2. أدرج ألف محبس ثلاثي في ​​هذا النظام للسماح للتطلع الافرازات الجرح عند نقاط زمنية محددة.
  3. في نقطة زمنية محددة بواسطة بروتوكول (على سبيل المثال ، 1 ، 6 ، 24 عاما ، وبعد 48 ساعة من الولادة القيصرية) ، يتم سحب 1 مل من الافرازات الجرح في فنجان يحتوي على 30 مادة البولي ايثيلين ميكرولتر من بروتين مثبط.
  4. في فترات الوقت نفسه يتم جمع 10 مل من الدم إلى أعلى خضراء تحتوي على جمع الدم أنبوب الهيبارين الليثيوم. ثم يتم إضافة 300 ميكرولتر من بروتين مثبط للعينات الدم.
  5. في حدود 1 ساعة لجمع ، يتم وضع العينات في الثلج وطرد في 3000 دورة في الدقيقة لمدة 10 دقيقة.
  6. تتم إزالة المصل وsupranate الجرح ومكان في أنبوب microcentrifuge القياسية وتخزينها في -20 درجة مئوية.

تحليل مقايسة

  1. حالما يتم جمع كل العينات ، وإذابة وتحليلها في الوقت نفسه.
  2. ومن ثم يتم قياس السيتوكينات باستخدام A17 - الصفيف متعددة المناعه حبة لوحة. مقايسة المناعية متعددة تتيح تقنية المعايرة يصل إلى 100 analytes في الجسم عينات من السائل كما صغير في الحجم إلى 50 ميكرولتر وتحقيق نتائج قابلة للمقارنة مع تلك التي حصلنا عليها مع إليسا. هذا الطبق هو قادر على قياس انترلوكين 1ß (IL - 1ß) ، انترلوكين 2 (IL - 2) ، انترلوكين 4 (IL - 4) ، انترلوكين 5 (IL - 5) ، وانترلوكين 6 (IL - 6) ، 7 انترلوكين (IL -7) ، انترلوكين 8 (IL - 8) ، انترلوكين (IL - 10) ، انترلوكين 12 (IL - 12) ، انترلوكين 13 (IL - 13) ، انترلوكين 17 (IL - 17) ، وعامل نخر الورم α (TNFα) ، انترفيرون α (INFα) ، عامل تحفيز مستعمرة الكريات البيضاء (G - CSF) ، محببة ، عامل تحفيز مستعمرة البلاعم (GM - CSF) ، البروتين الوحيدات جاذب كيميائي 1 (MCP - 1) والبلاعم بروتين الالتهابي 1 (MIP - 1β).
  3. يقاس عامل نمو الأعصاب مع الضد NGF DY256 عن طريق إضافته إلى لوحة 17 - نوع plex مع المعونة من المجموعة الأمينات الحيوية اقتران الصفيف.
  4. يتم القياس في كل التكرارات وفقا لمواصفات الشركة المصنعة. يتم إنشاؤها المنحنيات القياسية لكل تحليلها باستخدام analytes المرجعية المقدمة من قبل الشركات المصنعة في تركيزات 0.20 ، 0.78 ، 3.13 ، 12.5 ، 50 ، 200 ، 800 ، 3200 جزء من الغرام / مل زائد صفر القياسية (العادية المالحة فقط). وترد في كل المنحنيات القياسية تشغيل وحسبت تركيزات عينة مع برنامج إدارة الصفيف الحيوية.
  5. تقاس البروستاغلاندين E2 و ف مادة شديدة الحساسية باستخدام أطقم ELISA مقايسة يتم تنفيذ كل من نسختين وفقا لمواصفات الشركة المصنعة.

    الشكل 1
    الشكل 1

    الشكل 1 : مستويات المصل والافرازات المختلفة السيتوكينات المؤيدة والمضادة للالتهابات (انترلوكين 1ß (IL - 1ß) ، انترلوكين 2 (IL - 2) ، انترلوكين 4 (IL - 4) ، انترلوكين 5 (IL - 5) ، وانترلوكين 6 (IL - 6) ، 7 انترلوكين (IL - 7) ، انترلوكين 8 (IL - 8) ، انترلوكين (IL - 10) ، انترلوكين 12 (IL - 12) ، انترلوكين 13 (IL - 13) ، انترلوكين 17 (IL -17) ، عامل نخر الورم α (TNF - α) ، الإنترفيرون γ (INFγ) ، عامل تحفيز مستعمرة الكريات البيضاء (G - CSF) ، محببة ، عامل تحفيز مستعمرة البلاعم (GM - CSF) ، والبروتين الوحيدات جاذب كيميائي 1 (MCP - 1 ) والبلاعم بروتين الالتهابي 1 (MIP - 1ß) ، عامل النمو العصبي (NGF) ، E2 البروستاجلاندين (PG - E2) والجوهر P (SP) المستويات (بيكوغرام / مل) يقاس في الأساس ، 6 و 24 ساعة بعد الولادة القيصرية .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

وينبغي أن تدرج على سؤال الألم ® ® PainBuster نظام الإغاثة عبر شق في طبقة تحت الجلد بأكمله فقط قبل اغلاق الجرح. يسهل هذا الطموح من خلال محبس ثلاثي في ​​فترات زمنية محددة. وعلى سؤال ® نظام يسلم باستمرار المالحة تحت الجلد الطبيعي في الجرح بمعدل 2 مل / ساعة. هذا يمنع تخثر القسطرة ويحسن من الاعتمادية في منظومة لإنتاج عينات من الافرازات. إذا تطلع الافرازات صعب (حوالي 5 ٪ من الحالات) ، والنظر في تغيير الموقف هذا الموضوع (على سبيل المثال ، يجلس المريض لأعلى أو الكذب عليهم الشقة) ، ودفع برفق فوق الجرح ، وذلك باستخدام 0.5 1ml تدفق المياه المالحة العادي أو سحب القسطرة 1-2 سم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgements

ويدعم عمل الدكتور كارفالو في وظائف عن طريق البناء المتعدد التخصصات في صحة المرأة منحة بحثية من مكتب بحوث صحة المرأة والمعهد الوطني لصحة الطفل والتنمية البشرية التابع لمعاهد الصحة القومية (5K12 HD043452). استقبل الدكتور أنغست اللوازم (وعلى سؤال PainBuster ® ® تخفيف الآلام بعد العملية النظام) والتمويل لإجراء فحوصات البيوكيميائية من تدفق - I (بحيرة الغابات ، كاليفورنيا).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
On-Q® PainBuster® Post-Op Pain Relief System I-Flow, Lake Forest, CA
Complete proteinase inhibitor Roche Group
17-multiplex bead immunoassay Bio-PlexTM plate Bio-Rad
Bio-Plex amine coupling kit Bio-Rad
The NGF antibody DY256 R&D Systems
Prostaglandin E2 and substance P ELISA Kits Assay Designs

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Elshal, M. F., McCoy, J. P. Multiplex bead array assays: performance evaluation and comparison of sensitivity to ELISA. Methods. 38, 317-323 (2006).
  2. Heijmans-Antonissen, C., Wesseldijk, F., Munnikes, R. J., Huygen, F. J., van der Meijden, P., Hop, W. C., Hooijkaas, H., Zijlstra, F. J. Multiplex bead array assay for detection of 25 soluble cytokines in blister fluid of patients with complex regional pain syndrome type 1. Mediators Inflamm.. 28398, 1-8 (2006).
  3. Buvanendran, A., Kroin, J. S., Berger, R. A., Hallab, N. J., Saha, C., Negrescu, C., Moric, M., Caicedo, M. S., Tuman, K. J. Upregulation of prostaglandin E2 and interleukins in the central nervous system and peripheral tissue during and after surgery in humans. Anesthesiology. 104, 403-410 (2000).
  4. Holzheimer, R. G., Steinmetz, W. Local and systemic concentrations of pro- and anti-inflammatory cytokines in human wounds. Eur J Med Res. 5, 347-355 (2000).

Erratum

Formal Correction: Erratum: Collecting and Measuring Nociceptive and Inflammatory Mediators in Surgical Wounds
Posted by JoVE Editors on 03/07/2012. Citeable Link.

A correction was made to: Collecting and Measuring Nociceptive and Inflammatory Mediators in Surgical Wounds. A key reference was excluded.

A fifth reference:

5. Carvalho, B., Clark, D. J. & Angst, M. S. Local and Systemic Release of Cytokines, Nerve Growth Factor, Prostaglandin E2, and Substance P in Incisional Wounds and Serum Following Cesarean Delivery. The Journal of Pain : official journal of the American Pain Society 9 (7), 650-657 (2008).

was added. The abstract was updated to :

We describe a methodology by which we are able to collect and measure inflammatory and nociceptive biochemical mediators at the surgical wound site. Collecting site-specific biochemical markers allows us to evaluate the relationship between surgical wound and serum levels; determine any associations between mediator release, pain and analgesic consumption; and evaluate the effect of systemic and peripheral drug administration on surgical wound biochemistry.

This methodology has been applied to healthy women undergoing elective cesarean delivery with spinal anesthesia. Wound exudate and serum mediators, in conjunction with pain scores and analgesics consumption were measured at 1, 6, 24, and 48 hours post-cesarean delivery. Biochemical mediators that were detected included IL-1β, IL-2, IL-4, IL-6, IL-7, IL-8, IL-10, IL-12, IL-13, IL-17, TNFα, INFγ, G-CSF, GM-CSF, MCP-1 and MIP-1β, nerve growth factor (NGF), prostaglandin E2 (PG-E2) and substance P. We found no correlations between wound and serum cytokines concentrations or time-release profiles (J Pain. 2008 Jul 9(7):650-7). This article describes and demonstrates the feasibility of collecting and assaying nociceptive and inflammatory mediators in surgical wounds at specific time points. The lack of significant correlations between serum and wound levels shows the importance of determining site-specific release if surgical wounds and localized pathologies are to be studied.

from

The objectives of this study were to test the feasibility of collecting and measuring inflammatory and nociceptive biochemical mediators at the surgical site; to evaluate the relationship between wound and serum levels; and to determine any associations between mediator release, pain and analgesic consumption post-cesarean delivery. Twenty healthy women undergoing elective cesarean delivery with spinal anesthesia were enrolled. Wound exudate and serum mediators, pain scores and analgesics consumption were measured at 1, 6, 24, and 48 hours post-cesarean. In wound exudate, 19 out of 20 mediators were reliably detected including IL-1β, IL-2, IL-4, IL-6, IL-7, IL-8, IL-10, IL-12, IL-13, IL-17, TNFα, INFγ, G-CSF, GM-CSF, MCP-1 and MIP-1β, nerve growth factor (NGF), prostaglandin E2 (PG-E2) and substance P. Wound PG-E2 and various cytokines peaked early, whereas NGF showed a more delayed release. There were no correlations between the concentration versus time profile of wound and serum cytokines. This study demonstrates the feasibility of collecting and measuring nociceptive and inflammatory mediators in surgical wounds at specific time points. The lack of significant correlations between wound and serum levels emphasizes the importance of determining site-specific release if localized pathologies are to be studied.

Comments

1 Comment

  1. The technique appears robust, even if intuitive. However, as shown in the video paper, the data are collected in the presence of superfusion with local anaesthetic solution (in this case bupivacaine) which is very likely to modify the response and the local concentrations of mediators both as a direct pharmacological action of the local anaesthetic as well as through the fluid diluent effect. Moreover, adsoprtion of the various substances by the medical plastics would need evaluation. Hence a lot of control work needs to be done so that the numerical results obtained can be interpreted correctly. Perhaps the data are semiquantitative at best.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    March 4, 2009 - 6:37 PM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics