איסוף מדידת מגשרים nociceptive ועל פצעים דלקתיים כירורגי

Biology

ERRATUM NOTICE

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Carvalho, B., Clark, D. J., Yeomans, D., Angst, M. S. Collecting and Measuring Nociceptive and Inflammatory Mediators in Surgical Wounds . J. Vis. Exp. (20), e962, doi:10.3791/962 (2008).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

מטרות המחקר היו לבחון את הכדאיות של איסוף ומדידת מתווכים ביוכימיים דלקתיים nociceptive באתר כירורגית, כדי להעריך את הקשר בין הפצע רמות, ולקבוע כל קשר בין שחרור המתווך, כאב צריכת כאבים שלאחר ניתוח קיסרי משלוח. עשרים נשים בריאות העובר בניתוח קיסרי אלקטיבי בהרדמה השדרה נרשמו. Exudate הפצע מתווכים בסרום, עשרות הכאב ואת צריכת משככי כאבים נמדדו 1, 6, 24, ו - 48 שעות לאחר ניתוח קיסרי. ב exudate הפצע, 19 מתוך 20 מתווכים התגלו אמין כולל IL-1β, IL-2, IL-4, IL-6, IL-7, IL-8, IL-10, IL-12, IL-13, IL -17, TNFα, INFγ, G-CSF, GM-CSF, MCP-1 ו-MIP 1β, גורם הגדילה העצבי (NGF), פרוסטגלנדין E2 (PG-E2) ואת חומר פ פצע PG-E2 ו ציטוקינים שונים לשיא מוקדם ואילו NGF הראו שחרור מושהה יותר. לא היו מתאמים בין ריכוז לעומת פרופיל זמן של הפצע ציטוקינים בדם. מחקר זה מדגים את הכדאיות של איסוף ומדידת מתווכים nociceptive ו דלקתיים פצעי הניתוח בנקודות זמן מסוימות. חוסר מתאם משמעותי בין רמות הפצע מדגישה את החשיבות של קביעת אתר ספציפי לשחרר אם פתולוגיות מקומי הם להיחקר.

Protocol

Nociceptive ו דלקתי מתווך ביוכימיים אוסף

  1. ב-Q ® PainBuster ® מערכת הסיוע כאב מוכנס לתוך השכבה התת עורית על ידי צוות כירורגי קצר לפני סגירת הפצע. המערכת מספקת ברציפות מלוחים נורמלי (או הרדמה מקומית) תת עורית לתוך הפצע בשיעור של 2 מ"ל / שעה
  2. שסתום משולשת משתלב במערכת זו על מנת לאפשר שאיפה של exudate פצע בנקודות הזמן שצוין.
  3. בנקודות הזמן שצוין על ידי פרוטוקול (למשל, 1, 6, 24, ו - 48 שעות לאחר הלידה בניתוח קיסרי), 1 מ"ל של exudate פצע היא נסוגה לתוך כוס פוליאתילן המכילה 30 μl של מעכבי proteinase.
  4. במרווחים באותו זמן 10 מ"ל של דם נאסף לתוך צינור דם ירוק העליון אוסף המכיל הפרין ליתיום. 300 μl של מעכבי proteinase הוא הוסיף לאחר מכן את דגימות הדם.
  5. תוך שעה 1 של האוסף, דוגמאות לשים קרח centrifuged בסל"ד 3000 עבור 10 דקות.
  6. הסרום ו supranate הפצע מסירים ומניחים צינור microcentrifuge רגיל המאוחסן ב -20 ° C.

Assay ניתוח

  1. לאחר כל הדגימות נאספות, הם הפשירו ולנתח באותו זמן.
  2. ציטוקינים נמדדים מכן באמצעות A17-זמנית צלחת חרוז immunoassay המערך. חיסונית assay הטכנולוגיה מאפשרת Multiplex assaying עד 100 analytes בגוף, כמו דגימות נוזל בנפח קטן כמו μl 50 ו להניב תוצאות דומות לאלה שהושגו עם ELISA. צלחת זו הוא מסוגל למדוד interleukin 1ß (IL-1ß), אינטרלוקין 2 (IL-2), אינטרלוקין 4 (IL-4), אינטרלוקין 5 (IL-5), אינטרלוקין 6 (IL-6), אינטרלוקין 7 (IL -7), interleukin 8 (IL-8), אינטרלוקין (IL-10), אינטרלוקין 12 (IL-12), אינטרלוקין 13 (IL-13), אינטרלוקין 17 (IL-17), גידול גורם נמק α (TNFα) , אינטרפרון α (INFα), גורם המושבה granulocyte מגרה (G-CSF), granulocyte-macrophage המושבה גורם מגרה (GM-CSF), חלבון chemoattractant מונוציטים 1 (MCP-1) וחלבון macrophage דלקתיות 1 (MIP-1β).
  3. גורם הגדילה של העצב נמדדת עם נוגדן NGF DY256 ידי הוספתו צלחת 17-Plex עם סיוע של ערכת Bio-Plex צימוד אמין.
  4. כל מדידה נעשית כפילויות בהתאם למפרט היצרן. עקומות סטנדרט אנליטי עבור כל מופקות באמצעות analytes התייחסות שסופקו על ידי היצרנים בריכוזים של 0.20, 0.78, 3.13, 12.5, 50, 200, 800, 3200 pg / ml פלוס (מלח רגיל בלבד) אפס סטנדרטי. עקומות סטנדרט כלולים לרוץ בכל ריכוזי המדגם חושבו עם התוכנה Bio-Plex מנהל.
  5. פרוסטגלנדין E2 ו-P חומר נמדדים באמצעות רגישות מאוד ערכות ELISA כל assay מתבצע בשני עותקים בהתאם למפרט היצרן.

    איור 1
    איור 1

    איור 1: רמות Exudate ו בסרום של הציטוקינים הפרו ואנטי דלקתיים שונים (interleukin 1ß (IL-1ß), אינטרלוקין 2 (IL-2), אינטרלוקין 4 (IL-4), אינטרלוקין 5 (IL-5), interleukin 6 (IL-6), אינטרלויקין 7 (IL-7), interleukin 8 (IL-8), אינטרלוקין (IL-10), אינטרלוקין 12 (IL-12), אינטרלוקין 13 (IL-13), אינטרלוקין 17 (IL -17), גידול גורם נמק α (TNF-α), אינטרפרון γ (INFγ), granulocyte המושבה גורם מגרה (G-CSF), granulocyte-macrophage גורם מגרה המושבה (GM-CSF), חלבון chemoattractant מונוציטים 1 (MCP-1 ) וחלבון macrophage דלקתיות 1 (MIP-1ß), גורם הגדילה העצבי (NGF), פרוסטגלנדין E2 (PG-E2) ואת חומר P (SP) רמות (pg / mL) נמדד בתחילת המחקר, 6 ו - 24 שעות שלאחר הלידה בניתוח קיסרי .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

ב-Q ® PainBuster ® System כאב הסיוע צריך להיות מוכנס דרך החתך כולו שכבה תת עורית ממש לפני סגירת הפצע. זה מאפשר שאיפה דרך שסתום תלת אופן על מרווחי זמן מוגדר. ב-Q ® מספקת מערכת ברציפות מלוחים נורמלי מתחת לעור לתוך הפצע בשיעור של 2 מ"ל / שעה זה מונע קרישת הקטטר ומשפר את האמינות של המערכת לייצר דגימות exudate. אם השאיפה של exudate קשה (כ 5% מהמקרים), שקול לשנות את עמדת נושא (למשל, יושב המטופל כלפי מעלה או שוכב להם שטוח), דוחף בעדינות מעל הפצע, בעזרת סומק 0.5-1ml תמיסת מלח רגיל או למשוך את הקטטר 1-2 ס"מ.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgements

עבודתו של ד"ר קרבאליו נתמכת על ידי בניית קריירה הבינתחומי מענק מחקר בריאות נשים מלשכת לחקר בריאות האישה ואת המכון הלאומי לבריאות הילד והתפתחות האדם של המכונים הלאומיים לבריאות (5K12 HD043452). Angst ד"ר קיבלו אספקה ​​(ב-Q ® PainBuster ® מנותחות מערכת הסיוע כאב) ומימון עבור ביצוע מבחני ביוכימיים של תזרים-I (בלייק פורסט, קליפורניה).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
On-Q® PainBuster® Post-Op Pain Relief System I-Flow, Lake Forest, CA
Complete proteinase inhibitor Roche Group
17-multiplex bead immunoassay Bio-PlexTM plate Bio-Rad
Bio-Plex amine coupling kit Bio-Rad
The NGF antibody DY256 R&D Systems
Prostaglandin E2 and substance P ELISA Kits Assay Designs

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Elshal, M. F., McCoy, J. P. Multiplex bead array assays: performance evaluation and comparison of sensitivity to ELISA. Methods. 38, 317-323 (2006).
  2. Heijmans-Antonissen, C., Wesseldijk, F., Munnikes, R. J., Huygen, F. J., van der Meijden, P., Hop, W. C., Hooijkaas, H., Zijlstra, F. J. Multiplex bead array assay for detection of 25 soluble cytokines in blister fluid of patients with complex regional pain syndrome type 1. Mediators Inflamm.. 28398, 1-8 (2006).
  3. Buvanendran, A., Kroin, J. S., Berger, R. A., Hallab, N. J., Saha, C., Negrescu, C., Moric, M., Caicedo, M. S., Tuman, K. J. Upregulation of prostaglandin E2 and interleukins in the central nervous system and peripheral tissue during and after surgery in humans. Anesthesiology. 104, 403-410 (2000).
  4. Holzheimer, R. G., Steinmetz, W. Local and systemic concentrations of pro- and anti-inflammatory cytokines in human wounds. Eur J Med Res. 5, 347-355 (2000).

Erratum

Formal Correction: Erratum: Collecting and Measuring Nociceptive and Inflammatory Mediators in Surgical Wounds
Posted by JoVE Editors on 03/07/2012. Citeable Link.

A correction was made to: Collecting and Measuring Nociceptive and Inflammatory Mediators in Surgical Wounds. A key reference was excluded.

A fifth reference:

5. Carvalho, B., Clark, D. J. & Angst, M. S. Local and Systemic Release of Cytokines, Nerve Growth Factor, Prostaglandin E2, and Substance P in Incisional Wounds and Serum Following Cesarean Delivery. The Journal of Pain : official journal of the American Pain Society 9 (7), 650-657 (2008).

was added. The abstract was updated to :

We describe a methodology by which we are able to collect and measure inflammatory and nociceptive biochemical mediators at the surgical wound site. Collecting site-specific biochemical markers allows us to evaluate the relationship between surgical wound and serum levels; determine any associations between mediator release, pain and analgesic consumption; and evaluate the effect of systemic and peripheral drug administration on surgical wound biochemistry.

This methodology has been applied to healthy women undergoing elective cesarean delivery with spinal anesthesia. Wound exudate and serum mediators, in conjunction with pain scores and analgesics consumption were measured at 1, 6, 24, and 48 hours post-cesarean delivery. Biochemical mediators that were detected included IL-1β, IL-2, IL-4, IL-6, IL-7, IL-8, IL-10, IL-12, IL-13, IL-17, TNFα, INFγ, G-CSF, GM-CSF, MCP-1 and MIP-1β, nerve growth factor (NGF), prostaglandin E2 (PG-E2) and substance P. We found no correlations between wound and serum cytokines concentrations or time-release profiles (J Pain. 2008 Jul 9(7):650-7). This article describes and demonstrates the feasibility of collecting and assaying nociceptive and inflammatory mediators in surgical wounds at specific time points. The lack of significant correlations between serum and wound levels shows the importance of determining site-specific release if surgical wounds and localized pathologies are to be studied.

from

The objectives of this study were to test the feasibility of collecting and measuring inflammatory and nociceptive biochemical mediators at the surgical site; to evaluate the relationship between wound and serum levels; and to determine any associations between mediator release, pain and analgesic consumption post-cesarean delivery. Twenty healthy women undergoing elective cesarean delivery with spinal anesthesia were enrolled. Wound exudate and serum mediators, pain scores and analgesics consumption were measured at 1, 6, 24, and 48 hours post-cesarean. In wound exudate, 19 out of 20 mediators were reliably detected including IL-1β, IL-2, IL-4, IL-6, IL-7, IL-8, IL-10, IL-12, IL-13, IL-17, TNFα, INFγ, G-CSF, GM-CSF, MCP-1 and MIP-1β, nerve growth factor (NGF), prostaglandin E2 (PG-E2) and substance P. Wound PG-E2 and various cytokines peaked early, whereas NGF showed a more delayed release. There were no correlations between the concentration versus time profile of wound and serum cytokines. This study demonstrates the feasibility of collecting and measuring nociceptive and inflammatory mediators in surgical wounds at specific time points. The lack of significant correlations between wound and serum levels emphasizes the importance of determining site-specific release if localized pathologies are to be studied.

Comments

1 Comment

  1. The technique appears robust, even if intuitive. However, as shown in the video paper, the data are collected in the presence of superfusion with local anaesthetic solution (in this case bupivacaine) which is very likely to modify the response and the local concentrations of mediators both as a direct pharmacological action of the local anaesthetic as well as through the fluid diluent effect. Moreover, adsoprtion of the various substances by the medical plastics would need evaluation. Hence a lot of control work needs to be done so that the numerical results obtained can be interpreted correctly. Perhaps the data are semiquantitative at best.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    March 4, 2009 - 6:37 PM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics