외과 듀엣으로 Nociceptive 및 염증성 중재자를 수집 및 측정

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Carvalho, B., Clark, D. J., Yeomans, D., Angst, M. S. Collecting and Measuring Nociceptive and Inflammatory Mediators in Surgical Wounds . J. Vis. Exp. (20), e962, doi:10.3791/962 (2008).

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Abstract

본 연구의 목적은 외과 사이트에서 염증 및 nociceptive 생화 학적 중재자를 수집 및 측정의 타당성을 테스트했고, 상처와 혈청 수준 사이의 관계를 평가 및 중재자 릴리스, 통증과 진통 소비 후 cesarean 사이의 연관 관계를 결정하는 배달. 척추 마취로 선택 cesarean 전달을받은 스물​​ 건강한 여성 등록되었습니다. 상처 exudate 및 혈청 중재자, 통증 점수와 진통제 소비는 1, 6, 24, 그리고 48시간 후 cesarean에서 측정되었다. 상처 exudate에서 20 중재자 19 밖은 안정적으로 IL - 1β, IL - 2, IL - 4, IL - 6, IL - 7, IL - 8, IL - 10, IL - 12, IL - 13, IL을 포함 발견되었습니다 -17, TNFα, INFγ, G - CSF, GM - CSF, MCP - 1, MIP - 1β, 신경 성장 인자 (NGF), 프로 스타 글란딘 E2 (PG - E2)와 물질 P. 상처 PG - E2와 다양한 크린 시토킨 일찍 만족 , NGF보다 지연 릴리스를 보여주 반면. 농도 비교 상처와 혈청 크린 시토킨 시간 프로파일 사이 상관 관계가 없었다. 이 연구는 특정 시간 지점에서 수술 상처에 nociceptive 및 염증 중재자를 수집 및 측정의 가능성을 보여줍니다. 상처와 혈청 수준 사이에 상당한 상관 관계의 부족화된 pathologies가 연구해야하는 경우 특정 사이트 릴리스 결정의 중요성을 강조하고 있습니다.

Protocol

Nociceptive 및 염증성 생화 학적 매개체 모음

  1. 온 - Q ® PainBuster ® 통증 시스템은 폐쇄 상처에 직전 수술 팀에 의해 피하 층에 삽입됩니다. 이 시스템은 지속적으로 subcutaneously 2 ML / H.의 속도로 상처에 정상적인 생리 (또는 국소 마취제) 제공
  2. 세 방향 꼭지는 지정된 시간 지점에서 상처 exudate의 뜻을 허용하려면이 시스템에 통합됩니다.
  3. 프로토콜 (예, 1, 6, 24, 및 cesarean 배달 후 48 시간)에 의해 지정된 시간 지점에서, 상처 exudate 1 ML은 proteinase 억제제 30 μl를 포함하는 폴리에틸렌 컵에 철회합니다.
  4. 같은 시간 간격으로 혈액의 10 ML은 리튬 헤파린이 들어있는 그린 톱 혈액 수집 관으로 수집됩니다. proteinase 억제제 300 μl 그런 다음 혈액 샘플에 추가됩니다.
  5. 컬렉션 1 시간 이내, 샘플이 얼음에 부착 할 것입니다 10 분 3,000 rpm으로 centrifuged.
  6. 혈청과 상처에 supranate이 제거 장소 표준 microcentrifuge 관과 -20 ° C.에 저장됩니다

분석 분석

  1. 모든 샘플이 수집되면, 그들은 해동과 동시에 분석할 수 있습니다.
  2. 크린 시토킨 그런 다음 A17 - 멀티 플렉스 비드 어레이 면역 플레이트를 사용하여 측정하고 있습니다. 멀티 플렉스 단백질 분석 기술을 50 μl와 엘리사와 얻은 사람과 비교 결과를 같은 볼륨에서와 같이 작은 몸 - 액체 샘플 100 analytes까지 시금 수 있습니다. 이 플레이트는 인터루킨 1ß (IL - 1ß), 인터루킨 2 (IL - 2), 인터루킨 4 (IL - 4), 인터루킨 5 (IL - 5), 인터루킨 6 (IL - 6), 인터루킨 7 (IL 측정할 수있다 -7), 인터루킨 8 (IL - 8), 인터루킨 (IL - 10), 인터루킨 12 (IL - 12), 인터루킨 13 (IL - 13), 인터루킨 17 (IL - 17), 종양 괴사 인자 α (TNFα) , 인터페론 α (INFα), 과립구 콜로니 자극 인자 (G - CSF), 과립 세포 대식 세포 콜로니 자극 인자 (GM - CSF), 단핵구 chemoattractant 단백질 1 (MCP - 1)과 대식 세포 염증 단백질 1 (MIP - 1β).
  3. 신경 성장 인자는 바이오 플렉스 아민 커플링 키트의 지원과 함께 17 플렉스 판에 추가하여 NGF 항체 DY256로 측정됩니다.
  4. 각 측정은 중복 만든 제조 업체의 사양에 따라 것입니다. 각 analyte 표준 곡선은 0.20의 농도, 0.78, 3.13, 12.5, 50, 200, 800, 3200 PG / ML 플러스 제로 표준 (정상 생리에만 해당)에서 제조 업체가 제공하는 참조 analytes를 사용하여 생성됩니다. 표준 곡선은 각 실행에 포함되어 있으며, 샘플 농도는 바이오 플렉스 관리자 소프트웨어와 함께 계산되었습니다.
  5. 스타 글란딘 E2의와 물질 P는 각 분석은 제조 업체의 사양에 따라 중복으로 수행되는 높은 감도 엘리사 키트를 사용하여 측정하고 있습니다.

    그림 1
    그림 1

    그림 1 : 다양한 프로 및 안티 - 염증성 크린 시토킨 (인터루킨 1ß (IL - 1ß), 인터루킨 2 (IL - 2), 인터루킨 4 (IL - 4), 인터루킨 5 (IL - 5), 인터루킨의 Exudate와 혈청 수준 6 (IL - 6), 인터루킨 7 (IL - 7), 인터루킨 8 (IL - 8), 인터루킨 (IL - 10), 인터루킨 12 (IL - 12), 인터루킨 13 (IL - 13), 인터루킨 17 (IL -17), 종양 괴사 인자 α (TNF - α), 인터페론 γ (INFγ), 과립구 콜로니 자극 인자 (G - CSF), 과립 세포 대식 세포 콜로니 자극 인자 (GM - CSF), 단핵구 chemoattractant 단백질 1 (MCP - 1 )와 대식 세포 염증 단백질 1 (MIP - 1ß), 신경 성장 인자 (NGF), 프로 스타 글란딘 E2 (PG - E2)와 물질 P (SP) 수준 (PG / ML)이 기준에서 측정, 6, 24 시간 후 cesarean 전달 .

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Discussion

온 - Q ® PainBuster ® 통증 시스템은 폐쇄 상처에 직전 피하 층의 전체 절개를 통해 삽입한다. 이것은 지정된 시간 간격으로 세 방향 꼭지를 통해 뜻을 용이하게합니다. 온 - Q ® 시스템은 지속적으로 2 ML / H.의 속도로 상처에 subcutaneously 정상적인 생리를 제공합니다 이것은 카테 테르가 응고 방지 및 exudate 샘플을 생산하는 시스템의 안정성을 향상시킵니다. exudate의 열망이 (가지 경우 약 5 %) 어려운 경우, (예를 들어, 환자를 앉은 자세로? 아니면 그들이 드러 누어) 주제의 위치를​​ 변경 상처 위에 부드럽게 밀고, 0.5 - 1ml 정상적인 생리 플러시를 사용하거나 카테 테르를 철수 고려 1~2cm.

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Acknowledgements

박사 카발로의 작품은 여성의 건강과 아동 건강 및 보건 국립 연구소 (5K12 HD043452)의 인간 개발 국립 연구소에 대한 연구의 사무실에서 여성 건강 연구 부여에있는 한 건물 학제간 채용에 의해 지원됩니다. 드르 불안감은 대한 공급 (온 - Q ® PainBuster ® 수술 통증 시스템)와 자금을받은 I - 흐름에서 (레이크 포레스트, CA) 생화학 assays를 수행.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
On-Q® PainBuster® Post-Op Pain Relief System I-Flow, Lake Forest, CA
Complete proteinase inhibitor Roche Group
17-multiplex bead immunoassay Bio-PlexTM plate Bio-Rad
Bio-Plex amine coupling kit Bio-Rad
The NGF antibody DY256 R&D Systems
Prostaglandin E2 and substance P ELISA Kits Assay Designs

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References

  1. Elshal, M. F., McCoy, J. P. Multiplex bead array assays: performance evaluation and comparison of sensitivity to ELISA. Methods. 38, 317-323 (2006).
  2. Heijmans-Antonissen, C., Wesseldijk, F., Munnikes, R. J., Huygen, F. J., van der Meijden, P., Hop, W. C., Hooijkaas, H., Zijlstra, F. J. Multiplex bead array assay for detection of 25 soluble cytokines in blister fluid of patients with complex regional pain syndrome type 1. Mediators Inflamm.. 28398, 1-8 (2006).
  3. Buvanendran, A., Kroin, J. S., Berger, R. A., Hallab, N. J., Saha, C., Negrescu, C., Moric, M., Caicedo, M. S., Tuman, K. J. Upregulation of prostaglandin E2 and interleukins in the central nervous system and peripheral tissue during and after surgery in humans. Anesthesiology. 104, 403-410 (2000).
  4. Holzheimer, R. G., Steinmetz, W. Local and systemic concentrations of pro- and anti-inflammatory cytokines in human wounds. Eur J Med Res. 5, 347-355 (2000).

Erratum

Formal Correction: Erratum: Collecting and Measuring Nociceptive and Inflammatory Mediators in Surgical Wounds
Posted by JoVE Editors on 03/07/2012. Citeable Link.

A correction was made to: Collecting and Measuring Nociceptive and Inflammatory Mediators in Surgical Wounds. A key reference was excluded.

A fifth reference:

5. Carvalho, B., Clark, D. J. & Angst, M. S. Local and Systemic Release of Cytokines, Nerve Growth Factor, Prostaglandin E2, and Substance P in Incisional Wounds and Serum Following Cesarean Delivery. The Journal of Pain : official journal of the American Pain Society 9 (7), 650-657 (2008).

was added. The abstract was updated to :

We describe a methodology by which we are able to collect and measure inflammatory and nociceptive biochemical mediators at the surgical wound site. Collecting site-specific biochemical markers allows us to evaluate the relationship between surgical wound and serum levels; determine any associations between mediator release, pain and analgesic consumption; and evaluate the effect of systemic and peripheral drug administration on surgical wound biochemistry.

This methodology has been applied to healthy women undergoing elective cesarean delivery with spinal anesthesia. Wound exudate and serum mediators, in conjunction with pain scores and analgesics consumption were measured at 1, 6, 24, and 48 hours post-cesarean delivery. Biochemical mediators that were detected included IL-1β, IL-2, IL-4, IL-6, IL-7, IL-8, IL-10, IL-12, IL-13, IL-17, TNFα, INFγ, G-CSF, GM-CSF, MCP-1 and MIP-1β, nerve growth factor (NGF), prostaglandin E2 (PG-E2) and substance P. We found no correlations between wound and serum cytokines concentrations or time-release profiles (J Pain. 2008 Jul 9(7):650-7). This article describes and demonstrates the feasibility of collecting and assaying nociceptive and inflammatory mediators in surgical wounds at specific time points. The lack of significant correlations between serum and wound levels shows the importance of determining site-specific release if surgical wounds and localized pathologies are to be studied.

from

The objectives of this study were to test the feasibility of collecting and measuring inflammatory and nociceptive biochemical mediators at the surgical site; to evaluate the relationship between wound and serum levels; and to determine any associations between mediator release, pain and analgesic consumption post-cesarean delivery. Twenty healthy women undergoing elective cesarean delivery with spinal anesthesia were enrolled. Wound exudate and serum mediators, pain scores and analgesics consumption were measured at 1, 6, 24, and 48 hours post-cesarean. In wound exudate, 19 out of 20 mediators were reliably detected including IL-1β, IL-2, IL-4, IL-6, IL-7, IL-8, IL-10, IL-12, IL-13, IL-17, TNFα, INFγ, G-CSF, GM-CSF, MCP-1 and MIP-1β, nerve growth factor (NGF), prostaglandin E2 (PG-E2) and substance P. Wound PG-E2 and various cytokines peaked early, whereas NGF showed a more delayed release. There were no correlations between the concentration versus time profile of wound and serum cytokines. This study demonstrates the feasibility of collecting and measuring nociceptive and inflammatory mediators in surgical wounds at specific time points. The lack of significant correlations between wound and serum levels emphasizes the importance of determining site-specific release if localized pathologies are to be studied.

Comments

1 Comment

  1. The technique appears robust, even if intuitive. However, as shown in the video paper, the data are collected in the presence of superfusion with local anaesthetic solution (in this case bupivacaine) which is very likely to modify the response and the local concentrations of mediators both as a direct pharmacological action of the local anaesthetic as well as through the fluid diluent effect. Moreover, adsoprtion of the various substances by the medical plastics would need evaluation. Hence a lot of control work needs to be done so that the numerical results obtained can be interpreted correctly. Perhaps the data are semiquantitative at best.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    March 4, 2009 - 6:37 PM

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