手術創における侵害受容性および炎症性メディエーターを収集し、測定

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Carvalho, B., Clark, D. J., Yeomans, D., Angst, M. S. Collecting and Measuring Nociceptive and Inflammatory Mediators in Surgical Wounds . J. Vis. Exp. (20), e962, doi:10.3791/962 (2008).

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Abstract

本研究の目的は、手術部位での炎症と侵害受容生化学的メディエーターを収集し、測定の実現可能性をテストすることだった;傷と血清中濃度との関係を評価する、とメディエーター遊離、痛みと鎮痛剤の消費の後の帝王切開の間の任意の関連付けを決定する配達。脊椎麻酔による選択的帝王切開分娩を受けて二十健康な女性が在籍していた。創傷滲出液および血清中メディエーター、疼痛スコアおよび鎮痛剤の消費量は、1、6、24、および48時間後に帝王切開で測定した。創傷滲出液では、20メディエーターのうち19は確実にIL -1β、IL - 2、IL - 4、IL - 6、IL - 7、IL - 8、IL - 10、IL - 12、IL - 13、ILを含む検出された-17、TNFα、INFγ、G - CSF、GM - CSF、MCP - 1及びMIP -1β、神経成長因子(NGF)、プロスタグランジンE2(PG - E2)と物質は、P.傷PG - E2と様々なサイトカインは、初期のピーク、NGFは、より多くの遅延放出を示したのに対し。傷および血清サイトカインの濃度対時間のプロファイルの間には相関はなかった。本研究では、特定の時点で手術創の侵害受容と炎症性メディエーターを収集し、測定の実現可能性を示しています。傷や血清レベルの間に有意な相関の欠如は、ローカライズされた病理学が研究される場合は、サイト固有のリリースを決定することの重要性を強調している。

Protocol

侵害受容性および炎症の生化学的メディエーターコレクション

  1. オン- Q ® PainBuster ®痛みを軽減するシステムは、閉鎖を巻かする直前に外科チームによって皮下層に挿入されます。システムは、連続して皮下を2ml / hの速度で傷に(または局所麻酔薬)生理食塩水を提供
  2. 三方活栓は、指定された時点で傷からの滲出液の吸引を可能にするためにこのシステムに組み込まれています。
  3. プロトコル(例えば、1、6、24、および帝王切開分娩後48時間)で指定された時点で、傷からの滲出液の1mlをプロテイナーゼ阻害剤30μlを含むポリエチレンカップに撤回される。
  4. 同じ時間間隔で血液10mlをリチウムヘパリンを含む緑のトップ採血管に集められます。プロテイナーゼ阻害剤の300μlをして血液サンプルに追加されます。
  5. コレクションの1時間以内に、サンプルは氷上に置いているし、10分間3000rpmで遠心分離。
  6. 血清と創傷supranateは削除され、代わりに標準的なマイクロ遠心チューブに、-20℃で保存され

アッセイの分析

  1. すべてのサンプルが収集されると、それらを解凍し、同時に分析されています。
  2. サイトカインは、A17 -マルチプレックスビーズアレイのイムノアッセイプレートを用いて測定している。マルチプレックス免疫アッセイ技術は、50μlおよびELISAで得られたものと同等の結果を生み出すようなボリュームのような小さな体流体のサンプルで100検体までアッセイできます。このプレートは、インターロイキン1SS(IL -1β)、インターロイキン2(IL - 2)、インターロイキン4(IL - 4)、インターロイキン5(IL - 5)、インターロイキン6(IL - 6)、インターロイキン7(ILを測定することができます-7)、インターロイキン8(IL - 8)、インターロイキン(IL - 10)、インターロイキン12(IL - 12)、インターロイキン13(IL - 13)、インターロイキン17(IL - 17)、腫瘍壊死因子α(TNFα) 、インターフェロンα(INFα)、顆粒球コロニー刺激因子(G - CSF)、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM - CSF)、単球走化性タンパク質1(MCP - 1)およびマクロファージ炎症性タンパク質1(MIP -1β)。
  3. 神経成長因子を、Bio - Plexのアミンカップリングキットの助けを借りて17 -プレックスにプレートを追加することでNGF抗体DY256で測定されます。
  4. 各測定値は、重複で作られ、製造業者の仕様に従ってれている。各分析のための標準曲線は、0.20の濃度が、0.78、3.13、12.5、50、200、800、3200 pg / mLのプラスゼロ標準(生理食塩水のみ)でのメーカーによって供給される基準の分析対象物を使用して生成されます。標準曲線は、各ランに含まれており、サンプルの濃度を、Bio - Plexのマネージャソフトウェアで計算した。
  5. プロスタグランジンE2およびサブスタンスPは、それぞれのアッセイは、メーカーの仕様に応じて重複して行われる非常に感度ELISAキットを用いて測定している。

    図1
    図1

    図1:様々なプロと抗炎症性サイトカイン(インターロイキン1SS(IL -1β)、インターロイキン2(IL - 2)、インターロイキン4(IL - 4)、インターロイキン5(IL - 5)、インターロイキンの滲出液および血清中濃度6(IL - 6)、インターロイキン7(IL - 7)、インターロイキン8(IL - 8)、インターロイキン(IL - 10)、インターロイキン12(IL - 12)、インターロイキン13(IL - 13)、インターロイキン17(IL -17)、腫瘍壊死因子α(TNF -α)、インターフェロンγ(INFγ)、顆粒球コロニー刺激因子(G - CSF)、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM - CSF)、単球走化性タンパク質1(MCP - 1 )とマクロファージ炎症性タンパク質1(MIP -1β)、神経成長因子(NGF)、プロスタグランジンE2(PG - E2)およびサブスタンスP(SP)ベースライン時に測定されたレベル(pg / mL)を、6および24時間後に帝王切開。

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Discussion

オン- Q ® PainBuster ®痛みを軽減するシステムは、閉鎖を巻かする直前に皮下層で全体の切開を介して挿入する必要があります。これは、指定した時間間隔で三方活栓を介して吸引を容易にします。オン- Q ®システムは、連続して皮下を2ml / hの速度で傷口に生理食塩水を提供これは、カテーテルは、血液凝固防止と滲出液のサンプルを生成するシステムの信頼性を向上させます。滲出液の吸引は、(症例の約5%)が困難な場合、、(例えば、患者が座ったりが水平に)被写体の位置を変更して傷の上にそっと押して、0.5〜1ミリリットルの生理食塩水のフラッシュを使用したり、カテーテルを引き出すことを検討1〜2センチメートル。

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Acknowledgements

博士カルバリョの仕事は、女性の健康と母子保健と米国立衛生研究所(5K12 HD043452)の人間開発の国立研究所で研究局から女性の健康研究の助成金でビル学際的なキャリアでサポートされています。博士の不安は、電源(オン- Q ® PainBuster ®術後痛みを軽減するシステム)とI -フロー(レイクフォレスト、カリフォルニア州)からの生化学的アッセイを行うための資金提供を受けた。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
On-Q® PainBuster® Post-Op Pain Relief System I-Flow, Lake Forest, CA
Complete proteinase inhibitor Roche Group
17-multiplex bead immunoassay Bio-PlexTM plate Bio-Rad
Bio-Plex amine coupling kit Bio-Rad
The NGF antibody DY256 R&D Systems
Prostaglandin E2 and substance P ELISA Kits Assay Designs

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References

  1. Elshal, M. F., McCoy, J. P. Multiplex bead array assays: performance evaluation and comparison of sensitivity to ELISA. Methods. 38, 317-323 (2006).
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  3. Buvanendran, A., Kroin, J. S., Berger, R. A., Hallab, N. J., Saha, C., Negrescu, C., Moric, M., Caicedo, M. S., Tuman, K. J. Upregulation of prostaglandin E2 and interleukins in the central nervous system and peripheral tissue during and after surgery in humans. Anesthesiology. 104, 403-410 (2000).
  4. Holzheimer, R. G., Steinmetz, W. Local and systemic concentrations of pro- and anti-inflammatory cytokines in human wounds. Eur J Med Res. 5, 347-355 (2000).

Erratum

Formal Correction: Erratum: Collecting and Measuring Nociceptive and Inflammatory Mediators in Surgical Wounds
Posted by JoVE Editors on 03/07/2012. Citeable Link.

A correction was made to: Collecting and Measuring Nociceptive and Inflammatory Mediators in Surgical Wounds. A key reference was excluded.

A fifth reference:

5. Carvalho, B., Clark, D. J. & Angst, M. S. Local and Systemic Release of Cytokines, Nerve Growth Factor, Prostaglandin E2, and Substance P in Incisional Wounds and Serum Following Cesarean Delivery. The Journal of Pain : official journal of the American Pain Society 9 (7), 650-657 (2008).

was added. The abstract was updated to :

We describe a methodology by which we are able to collect and measure inflammatory and nociceptive biochemical mediators at the surgical wound site. Collecting site-specific biochemical markers allows us to evaluate the relationship between surgical wound and serum levels; determine any associations between mediator release, pain and analgesic consumption; and evaluate the effect of systemic and peripheral drug administration on surgical wound biochemistry.

This methodology has been applied to healthy women undergoing elective cesarean delivery with spinal anesthesia. Wound exudate and serum mediators, in conjunction with pain scores and analgesics consumption were measured at 1, 6, 24, and 48 hours post-cesarean delivery. Biochemical mediators that were detected included IL-1β, IL-2, IL-4, IL-6, IL-7, IL-8, IL-10, IL-12, IL-13, IL-17, TNFα, INFγ, G-CSF, GM-CSF, MCP-1 and MIP-1β, nerve growth factor (NGF), prostaglandin E2 (PG-E2) and substance P. We found no correlations between wound and serum cytokines concentrations or time-release profiles (J Pain. 2008 Jul 9(7):650-7). This article describes and demonstrates the feasibility of collecting and assaying nociceptive and inflammatory mediators in surgical wounds at specific time points. The lack of significant correlations between serum and wound levels shows the importance of determining site-specific release if surgical wounds and localized pathologies are to be studied.

from

The objectives of this study were to test the feasibility of collecting and measuring inflammatory and nociceptive biochemical mediators at the surgical site; to evaluate the relationship between wound and serum levels; and to determine any associations between mediator release, pain and analgesic consumption post-cesarean delivery. Twenty healthy women undergoing elective cesarean delivery with spinal anesthesia were enrolled. Wound exudate and serum mediators, pain scores and analgesics consumption were measured at 1, 6, 24, and 48 hours post-cesarean. In wound exudate, 19 out of 20 mediators were reliably detected including IL-1β, IL-2, IL-4, IL-6, IL-7, IL-8, IL-10, IL-12, IL-13, IL-17, TNFα, INFγ, G-CSF, GM-CSF, MCP-1 and MIP-1β, nerve growth factor (NGF), prostaglandin E2 (PG-E2) and substance P. Wound PG-E2 and various cytokines peaked early, whereas NGF showed a more delayed release. There were no correlations between the concentration versus time profile of wound and serum cytokines. This study demonstrates the feasibility of collecting and measuring nociceptive and inflammatory mediators in surgical wounds at specific time points. The lack of significant correlations between wound and serum levels emphasizes the importance of determining site-specific release if localized pathologies are to be studied.

Comments

1 Comment

  1. The technique appears robust, even if intuitive. However, as shown in the video paper, the data are collected in the presence of superfusion with local anaesthetic solution (in this case bupivacaine) which is very likely to modify the response and the local concentrations of mediators both as a direct pharmacological action of the local anaesthetic as well as through the fluid diluent effect. Moreover, adsoprtion of the various substances by the medical plastics would need evaluation. Hence a lot of control work needs to be done so that the numerical results obtained can be interpreted correctly. Perhaps the data are semiquantitative at best.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    March 4, 2009 - 6:37 PM

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