Coleta e medição Mediadores nociceptiva e inflamatória em feridas cirúrgicas

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Carvalho, B., Clark, D. J., Yeomans, D., Angst, M. S. Collecting and Measuring Nociceptive and Inflammatory Mediators in Surgical Wounds . J. Vis. Exp. (20), e962, doi:10.3791/962 (2008).

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Abstract

Os objetivos deste estudo foram testar a viabilidade de coleta e medição inflamatórios e nociceptivos mediadores bioquímicos no local da cirurgia, para avaliar a relação entre ferida e os níveis séricos, e para determinar as associações entre a liberação do mediador, a dor eo consumo de analgésicos pós-cesariana entrega. Vinte mulheres saudáveis ​​submetidos a cesariana eletiva com raquianestesia foram incluídos. Exsudato da ferida e mediadores de soro, os escores de dor eo consumo de analgésicos foram medidos no 1, 6, 24 e 48 horas pós-cesariana. No exsudato da ferida, 19 dos 20 mediadores foram detectados de forma confiável, incluindo IL-1β, IL-2, IL-4, IL-6, IL-7, IL-8, IL-10, IL-12, IL-13, IL -17, TNFa, INFγ, G-CSF, GM-CSF, MCP-1 e MIP-1β, fator de crescimento neural (NGF), a prostaglandina E2 (PG-E2) e substância P. Wound PG-E2 e várias citocinas pico início , enquanto NGF mostrou uma versão mais atrasada. Não houve correlação entre a concentração versus perfil de tempo de ferida e citocinas no soro. Este estudo demonstra a viabilidade da recolha e medição de mediadores nociceptivos e inflamatórios em feridas cirúrgicas em momentos específicos. A falta de correlações significativas entre os níveis séricos de feridas e enfatiza a importância de determinar site-specific libertação se patologias localizadas estão a ser estudado.

Protocol

Coleta de mediador nociceptiva e inflamatória bioquímicos

  1. O On-Q ® ® System PainBuster Alívio da Dor é inserido na camada subcutânea pela equipe cirúrgica pouco antes de fechamento da ferida. O sistema fornece continuamente soro fisiológico (ou anestésico local) por via subcutânea na ferida a uma taxa de 2 ml / h.
  2. A torneira de três vias é incorporado a este sistema para permitir a aspiração do exsudato da ferida em pontos de tempo especificado.
  3. Em pontos de tempo especificado pelo protocolo (por exemplo, 1, 6, 24 e 48 horas após cesariana), 1 ml de exsudato da ferida é retirada para um copo de polietileno contendo 30 mL de inibidor de protease.
  4. Em intervalos ao mesmo tempo, 10 ml de sangue é coletado em um tubo de coleta de sangue top verde contendo heparina de lítio. 300 ml de inibidor de proteinase é então adicionado às amostras de sangue.
  5. Dentro de 1 hora da coleta, as amostras são colocadas em gelo e centrifugado a 3000 rpm por 10 min.
  6. O soro e supranate ferida é removido e colocar em um tubo de microcentrífuga padrão e armazenadas a -20 ° C.

Análise do ensaio

  1. Uma vez que todas as amostras são coletadas, são descongeladas e analisadas ao mesmo tempo.
  2. As citocinas são medidos utilizando-A17 multiplex placa de imunoensaio bead array. Tecnologia Multiplex imuno-ensaio permite a dosagem até 100 analitos no corpo de líquido amostras tão pequenas no volume de 50 ul e produzir resultados comparáveis ​​com aqueles obtidos com ELISA. Esta placa é capaz de medir interleucina 1ß (IL-1ß), a interleucina 2 (IL-2), interleucina 4 (IL-4), interleucina 5 (IL-5), a interleucina 6 (IL-6), a interleucina 7 (IL -7), interleucina 8 (IL-8), interleucina (IL-10), a interleucina 12 (IL-12), a interleucina 13 (IL-13), a interleucina 17 (IL-17), fator de necrose tumoral α (TNF) , interferon α (INFα), fator estimulante de colônias de granulócitos (G-CSF), granulócitos e macrófagos fator estimulador de colônia (GM-CSF), proteína quimiotática de monócitos 1 (MCP-1) e proteína inflamatória de macrófagos 1 (MIP-1β).
  3. Fator de crescimento neural é medido com NGF anticorpos DY256 adicionando-o à placa 17-plex com auxílio do kit de acoplamento Bio-Plex amina.
  4. Cada medição é feita em duplicata e de acordo com as especificações do fabricante. Curvas padrão para cada analito são gerados usando os analitos de referência fornecidos pelos fabricantes em concentrações de 0,20, 0,78, 3,13, 12,5, 50, 200, 800, 3200 pg / ml, mais um zero (solução salina normal apenas) padrão. Curvas padrão são incluídos em cada amostra e as concentrações foram calculadas com Bio-Plex software Manager.
  5. Prostaglandina E2 e substância P são medidos através de uma sensibilidade altamente Kits ELISA Cada ensaio é realizado em duplicata de acordo com a especificação do fabricante.

    Figura 1
    Figura 1

    Figura 1: Níveis de exsudato e soro de várias citocinas pró e anti-inflamatórias (interleucina 1ß (IL-1ß), a interleucina 2 (IL-2), interleucina 4 (IL-4), interleucina 5 (IL-5), a interleucina 6 (IL-6), a interleucina 7 (IL-7), interleucina 8 (IL-8), interleucina (IL-10), a interleucina 12 (IL-12), a interleucina 13 (IL-13), a interleucina 17 (IL -17), fator de necrose tumoral α (TNF-α), interferon γ (INFγ), fator estimulador de colônias de granulócitos (G-CSF), granulócitos e macrófagos fator estimulador de colônias (GM-CSF), proteína quimiotática de monócitos 1 (MCP-1 ) e proteína inflamatória de macrófagos 1 (MIP-1ß), fator de crescimento neural (NGF), a prostaglandina E2 (PG-E2) e substância P (SP) níveis (pg / mL), medidos no início do estudo, 6 e 24 horas pós-parto cesárea .

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Discussion

O On-Q ® ® System PainBuster alívio da dor deve ser inserido através da incisão em toda a camada subcutânea pouco antes do fechamento da ferida. Isso facilita a aspiração através da torneira de três vias nos intervalos de tempo especificado. O sistema On-Q ® fornece continuamente solução salina por via subcutânea na ferida a uma taxa de 2 ml / h. Isso evita que o cateter de coagulação e melhora a confiabilidade do sistema para produzir amostras de exsudato. Se a aspiração do exsudato é difícil (aproximadamente 5% dos casos), considere a mudança da posição do sujeito (por exemplo, sentado o paciente para cima ou para mentir-los plana), empurrando levemente acima da ferida, usando um 0,5-1ml lavar salina normal ou a retirada do cateter 1-2 cm.

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Acknowledgements

O trabalho do Dr. Carvalho é apoiado por uma Carreiras Construção Interdisciplinar em pesquisa Saúde da Mulher concessão do Escritório de Pesquisa sobre Saúde da Mulher e Instituto Nacional de Saúde Infantil e Desenvolvimento Humano dos Institutos Nacionais de Saúde (5K12 HD043452). Angst Dr receberam suprimentos (On-Q ® ® PainBuster Pós-Op Sistema de Alívio da Dor) e financiamento para a realização dos testes bioquímicos de I-Flow (Lake Forest, CA).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
On-Q® PainBuster® Post-Op Pain Relief System I-Flow, Lake Forest, CA
Complete proteinase inhibitor Roche Group
17-multiplex bead immunoassay Bio-PlexTM plate Bio-Rad
Bio-Plex amine coupling kit Bio-Rad
The NGF antibody DY256 R&D Systems
Prostaglandin E2 and substance P ELISA Kits Assay Designs

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References

  1. Elshal, M. F., McCoy, J. P. Multiplex bead array assays: performance evaluation and comparison of sensitivity to ELISA. Methods. 38, 317-323 (2006).
  2. Heijmans-Antonissen, C., Wesseldijk, F., Munnikes, R. J., Huygen, F. J., van der Meijden, P., Hop, W. C., Hooijkaas, H., Zijlstra, F. J. Multiplex bead array assay for detection of 25 soluble cytokines in blister fluid of patients with complex regional pain syndrome type 1. Mediators Inflamm.. 28398, 1-8 (2006).
  3. Buvanendran, A., Kroin, J. S., Berger, R. A., Hallab, N. J., Saha, C., Negrescu, C., Moric, M., Caicedo, M. S., Tuman, K. J. Upregulation of prostaglandin E2 and interleukins in the central nervous system and peripheral tissue during and after surgery in humans. Anesthesiology. 104, 403-410 (2000).
  4. Holzheimer, R. G., Steinmetz, W. Local and systemic concentrations of pro- and anti-inflammatory cytokines in human wounds. Eur J Med Res. 5, 347-355 (2000).

Erratum

Formal Correction: Erratum: Collecting and Measuring Nociceptive and Inflammatory Mediators in Surgical Wounds
Posted by JoVE Editors on 03/07/2012. Citeable Link.

A correction was made to: Collecting and Measuring Nociceptive and Inflammatory Mediators in Surgical Wounds. A key reference was excluded.

A fifth reference:

5. Carvalho, B., Clark, D. J. & Angst, M. S. Local and Systemic Release of Cytokines, Nerve Growth Factor, Prostaglandin E2, and Substance P in Incisional Wounds and Serum Following Cesarean Delivery. The Journal of Pain : official journal of the American Pain Society 9 (7), 650-657 (2008).

was added. The abstract was updated to :

We describe a methodology by which we are able to collect and measure inflammatory and nociceptive biochemical mediators at the surgical wound site. Collecting site-specific biochemical markers allows us to evaluate the relationship between surgical wound and serum levels; determine any associations between mediator release, pain and analgesic consumption; and evaluate the effect of systemic and peripheral drug administration on surgical wound biochemistry.

This methodology has been applied to healthy women undergoing elective cesarean delivery with spinal anesthesia. Wound exudate and serum mediators, in conjunction with pain scores and analgesics consumption were measured at 1, 6, 24, and 48 hours post-cesarean delivery. Biochemical mediators that were detected included IL-1β, IL-2, IL-4, IL-6, IL-7, IL-8, IL-10, IL-12, IL-13, IL-17, TNFα, INFγ, G-CSF, GM-CSF, MCP-1 and MIP-1β, nerve growth factor (NGF), prostaglandin E2 (PG-E2) and substance P. We found no correlations between wound and serum cytokines concentrations or time-release profiles (J Pain. 2008 Jul 9(7):650-7). This article describes and demonstrates the feasibility of collecting and assaying nociceptive and inflammatory mediators in surgical wounds at specific time points. The lack of significant correlations between serum and wound levels shows the importance of determining site-specific release if surgical wounds and localized pathologies are to be studied.

from

The objectives of this study were to test the feasibility of collecting and measuring inflammatory and nociceptive biochemical mediators at the surgical site; to evaluate the relationship between wound and serum levels; and to determine any associations between mediator release, pain and analgesic consumption post-cesarean delivery. Twenty healthy women undergoing elective cesarean delivery with spinal anesthesia were enrolled. Wound exudate and serum mediators, pain scores and analgesics consumption were measured at 1, 6, 24, and 48 hours post-cesarean. In wound exudate, 19 out of 20 mediators were reliably detected including IL-1β, IL-2, IL-4, IL-6, IL-7, IL-8, IL-10, IL-12, IL-13, IL-17, TNFα, INFγ, G-CSF, GM-CSF, MCP-1 and MIP-1β, nerve growth factor (NGF), prostaglandin E2 (PG-E2) and substance P. Wound PG-E2 and various cytokines peaked early, whereas NGF showed a more delayed release. There were no correlations between the concentration versus time profile of wound and serum cytokines. This study demonstrates the feasibility of collecting and measuring nociceptive and inflammatory mediators in surgical wounds at specific time points. The lack of significant correlations between wound and serum levels emphasizes the importance of determining site-specific release if localized pathologies are to be studied.

Comments

1 Comment

  1. The technique appears robust, even if intuitive. However, as shown in the video paper, the data are collected in the presence of superfusion with local anaesthetic solution (in this case bupivacaine) which is very likely to modify the response and the local concentrations of mediators both as a direct pharmacological action of the local anaesthetic as well as through the fluid diluent effect. Moreover, adsoprtion of the various substances by the medical plastics would need evaluation. Hence a lot of control work needs to be done so that the numerical results obtained can be interpreted correctly. Perhaps the data are semiquantitative at best.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    March 4, 2009 - 6:37 PM

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