Raccolta e misurazione nocicettivo mediatori infiammatori e nelle ferite chirurgiche

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Carvalho, B., Clark, D. J., Yeomans, D., Angst, M. S. Collecting and Measuring Nociceptive and Inflammatory Mediators in Surgical Wounds . J. Vis. Exp. (20), e962, doi:10.3791/962 (2008).

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Abstract

Gli obiettivi di questo studio sono stati per testare la fattibilità della raccolta e misurazione dei mediatori biochimici infiammatori e nocicettivi nel sito chirurgico, per valutare la relazione tra ferita e livelli sierici, e per determinare eventuali associazioni tra rilascio mediatore, il dolore e il consumo di analgesici post-cesareo consegna. Venti donne sane in fase di consegna elettiva cesareo con anestesia spinale sono stati arruolati. Essudato e mediatori del siero, i punteggi del dolore ed il consumo di analgesici sono stati misurati ad 1, 6, 24, e 48 ore post-parto cesareo. In essudato, 19 su 20 mediatori erano rilevata con certezza tra cui IL-1β, IL-2, IL-4, IL-6, IL-7, IL-8, IL-10, IL-12, IL-13, IL -17, TNFa, INFγ, G-CSF, GM-CSF, MCP-1 e MIP-1β, fattore di crescita nervosa (NGF), prostaglandine E2 (PG-E2) e sostanza P. ferita PG-E2 e varie citochine raggiunto l'apice all'inizio , mentre NGF ha mostrato una versione più ritardato. Non ci sono state correlazioni tra la concentrazione rispetto al profilo temporale delle ferite e delle citochine sieriche. Questo studio dimostra la fattibilità della raccolta e misurazione dei mediatori infiammatori nocicettivo e nelle ferite chirurgiche in punti temporali specifici. La mancanza di correlazioni significative tra ferita e livelli sierici sottolinea l'importanza di determinare site-specific di rilascio se patologie localizzate sono da studiare.

Protocol

Nocicettivo e infiammatorie raccolta mediatore biochimico

  1. On-Q ® PainBuster Dolore ® Sistema di Soccorso è inserita nello strato sottocutaneo dall'équipe chirurgica appena prima la chiusura della ferita. Il sistema fornisce continuamente soluzione fisiologica (o anestetico locale) per via sottocutanea nella ferita ad una velocità di 2 ml / h.
  2. Un rubinetto a tre vie è incorporato in questo sistema per permettere l'aspirazione di essudato in punti di tempo specificato.
  3. In punti di tempo specificato dal protocollo (ad esempio, 1, 6, 24, e 48 ore dopo il parto cesareo), 1 ml di essudato è ritirato in una tazza di polietilene contenente 30 ml di inibitore della proteasi.
  4. A intervalli stesso tempo, 10 ml di sangue viene raccolto in un tubo verde in alto la raccolta del sangue contenenti eparina di litio. 300 ml di inibitore della proteasi viene poi aggiunta ai campioni di sangue.
  5. Entro 1 ora dal prelievo, i campioni vengono messi in ghiaccio e centrifugati a 3000 rpm per 10 min.
  6. Il siero e supranate ferita viene rimosso e posto in una provetta standard e conservati a -20 ° C.

Test di analisi

  1. Una volta che tutti i campioni sono stati raccolti, vengono scongelati e analizzati allo stesso tempo.
  2. Le citochine sono poi misurati con A17-multiplex tallone piatto immunodosaggio array. Multiplex immuno-saggio tecnologia permette dosaggio fino a 100 analiti nel corpo-fluido campioni più piccoli di volume di 50 microlitri e produrre risultati comparabili con quelli ottenuti con i test ELISA. Questo piatto è in grado di misurare 1SS interleuchina (IL-1SS), interleuchina 2 (IL-2), interleuchina 4 (IL-4), interleuchina 5 (IL-5), l'interleuchina 6 (IL-6), interleuchina 7 (IL -7), interleukina 8 (IL-8), l'interleuchina (IL-10), interleuchina 12 (IL-12), interleuchina 13 (IL-13), interleuchina 17 (IL-17), fattore di necrosi tumorale α (TNF) , interferone α (INFα), fattore stimolante colonie di granulociti (G-CSF), granulociti-macrofagi fattore stimolante le colonie (GM-CSF), proteine ​​chemoattractant monociti 1 (MCP-1) e della proteina infiammatoria macrofagica 1 (MIP-1β).
  3. Fattore di crescita nervosa viene misurata con l'anticorpo NGF DY256 aggiungendolo al 17-plex piastra con l'aiuto del Bio-Plex kit ammina accoppiamento.
  4. Ogni misurazione viene effettuata in duplicati e secondo le specifiche del produttore. Curve standard per ogni analita sono generati utilizzando il analiti di riferimento forniti dai produttori a concentrazioni di 0.20, 0.78, 3.13, 12.5, 50, 200, 800, 3200 pg / ml più uno zero standard (soluzione fisiologica solo). Curve standard sono inclusi in ogni seduta e le concentrazioni del campione sono stati calcolati con Bio-Plex software di gestione.
  5. Prostaglandina E2 e P sostanza sono misurati utilizzando un kit ELISA altamente sensibilità viene eseguita Ciascun test in duplicato secondo le specifiche del produttore.

    Figura 1
    Figura 1

    Figura 1: livelli di essudato e nel siero di varie citochine pro-e anti-infiammatorie (interleuchina 1SS (IL-1SS), interleuchina 2 (IL-2), interleuchina 4 (IL-4), interleuchina 5 (IL-5), interleuchina 6 (IL-6), interleuchina 7 (IL-7), interleuchina 8 (IL-8), l'interleuchina (IL-10), interleuchina 12 (IL-12), interleuchina 13 (IL-13), interleuchina 17 (IL -17), fattore di necrosi tumorale α (TNF-α), l'interferone γ (INFγ), fattore stimolante le colonie di granulociti (G-CSF), granulociti-macrofagi colony stimulating factor (GM-CSF), fattore chemiotattico dei monociti proteina 1 (MCP-1 ) e di proteine ​​infiammatorie macrofagi 1 (MIP-1SS), il fattore di crescita nervosa (NGF), prostaglandina E2 (PG-E2) e sostanza P (SP) livelli (pg / mL) misurati al basale, 6 e 24 ore dopo il cesareo consegna .

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Discussion

On-Q ® PainBuster dolore System ® Sollievo dovrebbe essere inserito attraverso l'incisione intera strato sottocutaneo appena prima la chiusura della ferita. Questo facilita l'aspirazione tramite il rubinetto a tre vie a intervalli di tempo specificato. On-Q ® sistema offre continuamente soluzione fisiologica per via sottocutanea nella ferita ad una velocità di 2 ml / h. Questo impedisce la coagulazione del catetere e migliora l'affidabilità del sistema di produrre campioni di essudato. Se l'aspirazione di essudato è difficile (di circa il 5% dei casi), cambia la posizione del soggetto (ad esempio, seduto il paziente verso l'alto o mentendo loro piatto), spingendo delicatamente sopra la ferita, utilizzando un 0,5-1ml di soluzione fisiologica o ritirare il catetere 1-2 cm.

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Acknowledgements

Il lavoro del Dr. Carvalho è supportato da una costruzione Lavora interdisciplinare in assegno di ricerca delle donne Salute presso l'Ufficio di ricerca sulla salute delle donne e il National Institute of Child Health e lo Sviluppo Umano del National Institutes of Health (5K12 HD043452). Angst dr ricevuto rifornimenti (On-Q ® PainBuster ® Post-Op sistema sollievo dal dolore) e finanziamenti per lo svolgimento del test biochimici da I-Flow (Lake Forest, California).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
On-Q® PainBuster® Post-Op Pain Relief System I-Flow, Lake Forest, CA
Complete proteinase inhibitor Roche Group
17-multiplex bead immunoassay Bio-PlexTM plate Bio-Rad
Bio-Plex amine coupling kit Bio-Rad
The NGF antibody DY256 R&D Systems
Prostaglandin E2 and substance P ELISA Kits Assay Designs

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References

  1. Elshal, M. F., McCoy, J. P. Multiplex bead array assays: performance evaluation and comparison of sensitivity to ELISA. Methods. 38, 317-323 (2006).
  2. Heijmans-Antonissen, C., Wesseldijk, F., Munnikes, R. J., Huygen, F. J., van der Meijden, P., Hop, W. C., Hooijkaas, H., Zijlstra, F. J. Multiplex bead array assay for detection of 25 soluble cytokines in blister fluid of patients with complex regional pain syndrome type 1. Mediators Inflamm.. 28398, 1-8 (2006).
  3. Buvanendran, A., Kroin, J. S., Berger, R. A., Hallab, N. J., Saha, C., Negrescu, C., Moric, M., Caicedo, M. S., Tuman, K. J. Upregulation of prostaglandin E2 and interleukins in the central nervous system and peripheral tissue during and after surgery in humans. Anesthesiology. 104, 403-410 (2000).
  4. Holzheimer, R. G., Steinmetz, W. Local and systemic concentrations of pro- and anti-inflammatory cytokines in human wounds. Eur J Med Res. 5, 347-355 (2000).

Erratum

Formal Correction: Erratum: Collecting and Measuring Nociceptive and Inflammatory Mediators in Surgical Wounds
Posted by JoVE Editors on 03/07/2012. Citeable Link.

A correction was made to: Collecting and Measuring Nociceptive and Inflammatory Mediators in Surgical Wounds. A key reference was excluded.

A fifth reference:

5. Carvalho, B., Clark, D. J. & Angst, M. S. Local and Systemic Release of Cytokines, Nerve Growth Factor, Prostaglandin E2, and Substance P in Incisional Wounds and Serum Following Cesarean Delivery. The Journal of Pain : official journal of the American Pain Society 9 (7), 650-657 (2008).

was added. The abstract was updated to :

We describe a methodology by which we are able to collect and measure inflammatory and nociceptive biochemical mediators at the surgical wound site. Collecting site-specific biochemical markers allows us to evaluate the relationship between surgical wound and serum levels; determine any associations between mediator release, pain and analgesic consumption; and evaluate the effect of systemic and peripheral drug administration on surgical wound biochemistry.

This methodology has been applied to healthy women undergoing elective cesarean delivery with spinal anesthesia. Wound exudate and serum mediators, in conjunction with pain scores and analgesics consumption were measured at 1, 6, 24, and 48 hours post-cesarean delivery. Biochemical mediators that were detected included IL-1β, IL-2, IL-4, IL-6, IL-7, IL-8, IL-10, IL-12, IL-13, IL-17, TNFα, INFγ, G-CSF, GM-CSF, MCP-1 and MIP-1β, nerve growth factor (NGF), prostaglandin E2 (PG-E2) and substance P. We found no correlations between wound and serum cytokines concentrations or time-release profiles (J Pain. 2008 Jul 9(7):650-7). This article describes and demonstrates the feasibility of collecting and assaying nociceptive and inflammatory mediators in surgical wounds at specific time points. The lack of significant correlations between serum and wound levels shows the importance of determining site-specific release if surgical wounds and localized pathologies are to be studied.

from

The objectives of this study were to test the feasibility of collecting and measuring inflammatory and nociceptive biochemical mediators at the surgical site; to evaluate the relationship between wound and serum levels; and to determine any associations between mediator release, pain and analgesic consumption post-cesarean delivery. Twenty healthy women undergoing elective cesarean delivery with spinal anesthesia were enrolled. Wound exudate and serum mediators, pain scores and analgesics consumption were measured at 1, 6, 24, and 48 hours post-cesarean. In wound exudate, 19 out of 20 mediators were reliably detected including IL-1β, IL-2, IL-4, IL-6, IL-7, IL-8, IL-10, IL-12, IL-13, IL-17, TNFα, INFγ, G-CSF, GM-CSF, MCP-1 and MIP-1β, nerve growth factor (NGF), prostaglandin E2 (PG-E2) and substance P. Wound PG-E2 and various cytokines peaked early, whereas NGF showed a more delayed release. There were no correlations between the concentration versus time profile of wound and serum cytokines. This study demonstrates the feasibility of collecting and measuring nociceptive and inflammatory mediators in surgical wounds at specific time points. The lack of significant correlations between wound and serum levels emphasizes the importance of determining site-specific release if localized pathologies are to be studied.

Comments

1 Comment

  1. The technique appears robust, even if intuitive. However, as shown in the video paper, the data are collected in the presence of superfusion with local anaesthetic solution (in this case bupivacaine) which is very likely to modify the response and the local concentrations of mediators both as a direct pharmacological action of the local anaesthetic as well as through the fluid diluent effect. Moreover, adsoprtion of the various substances by the medical plastics would need evaluation. Hence a lot of control work needs to be done so that the numerical results obtained can be interpreted correctly. Perhaps the data are semiquantitative at best.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    March 4, 2009 - 6:37 PM

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