Recueillir et mesurer les médiateurs nociceptifs et inflammatoires dans les plaies chirurgicales

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Carvalho, B., Clark, D. J., Yeomans, D., Angst, M. S. Collecting and Measuring Nociceptive and Inflammatory Mediators in Surgical Wounds . J. Vis. Exp. (20), e962, doi:10.3791/962 (2008).

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Abstract

Les objectifs de cette étude étaient de tester la faisabilité de la collecte et la mesure inflammatoires et nociceptifs médiateurs biochimiques au site chirurgical, d'évaluer la relation entre la blessure et les taux sériques, et de déterminer toutes les associations entre la libération du médiateur, la douleur et la consommation d'antalgiques post-césarienne livraison. Vingt femmes sains subissant une césarienne élective avec anesthésie spinale étaient inscrits. L'exsudat et médiateurs du sérum, des scores de douleur et de la consommation d'analgésiques ont été mesurées à 1, 6, 24 et 48 heures post-césarienne. En exsudats de la plaie, 19 des 20 médiateurs ont été détectés de manière fiable l'IL-1β, y compris, l'IL-2, IL-4, IL-6, IL-7, IL-8, IL-10, IL-12, IL-13, IL -17, TNFa, INFγ, le G-CSF, GM-CSF, MCP-1 et MIP-1β, facteur de croissance nerveuse (NGF), la prostaglandine E2 (PG-E2) et la substance P. plaies PG-E2 et diverses cytokines ont culminé au début , tandis que le NGF a montré une libération plus tardive. Il n'y avait aucune corrélation entre la concentration en fonction du profil temporel des plaies et des cytokines sériques. Cette étude démontre la faisabilité de la collecte et la mesure des médiateurs inflammatoires nociceptives et dans les plaies chirurgicales à des moments précis. L'absence de corrélations significatives entre les taux sériques de la plaie et insiste sur l'importance de la détermination de sites spécifiques libération si les pathologies localisées sont à étudier.

Protocol

Nociceptive et inflammatoires collection de médiateur biochimique

  1. La Sur-Q ® PainBuster System ® Soulagement de la douleur est inséré dans la couche sous-cutanée par l'équipe chirurgicale, juste avant de refermer la plaie. Le système fournit en permanence une solution saline normale (ou anesthésie locale) sous-cutanée dans la plaie à un taux de 2 ml / h.
  2. Un robinet à trois voies est intégré dans ce système pour permettre l'aspiration des exsudats de la plaie à des points de temps spécifié.
  3. Aux points de temps spécifié par le protocole (par exemple, 1, 6, 24 et 48 heures après l'accouchement par césarienne), 1 ml d'exsudat de la plaie est retiré dans un gobelet en polyéthylène contenant 30 pl d'inhibiteur de protéinase.
  4. A intervalles le même temps de 10 ml de sang est recueilli dans un tube vert de sang dessus la collecte contenant de l'héparine de lithium. 300 pl de l'inhibiteur de protéinase est ensuite ajouté à des échantillons de sang.
  5. En 1 heure du prélèvement, les échantillons sont mis sur la glace et centrifugé à 3000 rpm pendant 10 min.
  6. Le sérum et supranate blessure est retiré et le placer dans un tube à centrifuger standard et stockés à -20 ° C.

L'analyse de dosage

  1. Une fois que tous les échantillons sont recueillis, ils sont décongelés et analysées dans le même temps.
  2. Les cytokines sont ensuite mesurés à l'aide A17-multiplexe plaque de perles immuno tableau. Multiplex immuno-essai la technologie permet titrant jusqu'à 100 analytes dans des liquides organiques d'échantillons de faible volume de 50 ul et produire des résultats comparables à ceux obtenus par ELISA. Cette plaque est capable de mesurer l'interleukine 1ß (IL-1ß), l'interleukine 2 (IL-2), l'interleukine 4 (IL-4), l'interleukine 5 (IL-5), l'interleukine 6 (IL-6), l'interleukine 7 (IL -7), l'interleukine 8 (IL-8), d'interleukine (IL-10), l'interleukine 12 (IL-12), l'interleukine 13 (IL-13), l'interleukine 17 (IL-17), facteur de nécrose tumorale α (TNF) , interféron α (INFα), facteur de croissance hématopoïétique granulocytaire (G-CSF), granulocyte-macrophage colony stimulating factor (GM-CSF), la protéine chimiotactique monocytaire 1 (MCP-1) et des macrophages inflammatoires protéines 1 (MIP-1β).
  3. Facteur de croissance nerveuse est mesurée avec NGF DY256 en l'ajoutant à la plaque 17-Plex avec l'aide de la trousse Bio-Plex amines accouplement.
  4. Chaque mesure est faite en double et selon les spécifications du fabricant. Les courbes standard pour chaque analyte sont générés en utilisant les analytes de référence fournies par les fabricants à des concentrations de 0,20, 0,78, 3,13, 12,5, 50, 200, 800, 3200 pg / ml, plus un standard zéro (sérum physiologique uniquement). Les courbes standard sont inclus dans chaque série et les concentrations dans l'échantillon ont été calculées avec le logiciel de directeur de Bio-Plex.
  5. La prostaglandine E2 et la substance P sont mesurés en utilisant une grande sensibilité de kits ELISA Chaque test est effectué en double exemplaire selon les spécifications du fabricant.

    Figure 1
    Figure 1

    Figure 1: niveaux d'exsudat et le sérum des différentes cytokines pro-et anti-inflammatoires (interleukine 1ß (IL-1ß), l'interleukine 2 (IL-2), l'interleukine 4 (IL-4), l'interleukine 5 (IL-5), l'interleukine 6 (IL-6), l'interleukine 7 (IL-7), d'interleukine 8 (IL-8), d'interleukine (IL-10), l'interleukine 12 (IL-12), l'interleukine 13 (IL-13), l'interleukine 17 (IL -17), facteur de nécrose tumorale α (TNF-α), l'interféron γ (INFγ), facteur stimulant les colonies de granulocytes (G-CSF), facteur de colonies de granulocytes-macrophages (GM-CSF), monocytes protéines chimiotactique 1 (MCP-1 ) et des macrophages inflammatoires protéines 1 (MIP-1ß), facteur de croissance nerveuse (NGF), la prostaglandine E2 (PG-E2) et la substance P (SP) niveau (pg / ml) mesurée au départ, 6 et 24 heures post-césarienne de livraison .

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Discussion

La Sur-Q ® PainBuster System ® Soulagement de la douleur doit être inséré dans l'incision cutanée entière dans la couche juste avant de refermer la plaie. Cela facilite l'aspiration via le robinet à trois voies à des intervalles de temps spécifié. La Sur-Q ® système délivre en continu une solution saline normale sous-cutanée dans la plaie à un taux de 2 ml / h. Cela empêche le cathéter de la coagulation et améliore la fiabilité du système pour produire des échantillons d'exsudat. Si l'aspiration de l'exsudat est difficile (environ 5% des cas), envisager de changer la position du sujet (par exemple, assis le patient vers le haut ou couché à plat), poussant doucement au-dessus de la plaie, en utilisant un 0,5-1ml rincer sérum physiologique ou de retirer le cathéter 1-2 cm.

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Acknowledgements

Les travaux du Dr Carvalho est soutenu par une carrière vouée interdisciplinaire en santé de la femme de subvention de recherche du Bureau de recherche sur la santé des femmes et l'Institut national de la santé infantile et du développement humain des National Institutes of Health (5K12 HD043452). Angst Dr reçu des fournitures (On-Q ® PainBuster ® Post-Op Système soulagement de la douleur) et le financement de la conduite des essais biochimiques de I-Flow (Lake Forest, CA).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
On-Q® PainBuster® Post-Op Pain Relief System I-Flow, Lake Forest, CA
Complete proteinase inhibitor Roche Group
17-multiplex bead immunoassay Bio-PlexTM plate Bio-Rad
Bio-Plex amine coupling kit Bio-Rad
The NGF antibody DY256 R&D Systems
Prostaglandin E2 and substance P ELISA Kits Assay Designs

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References

  1. Elshal, M. F., McCoy, J. P. Multiplex bead array assays: performance evaluation and comparison of sensitivity to ELISA. Methods. 38, 317-323 (2006).
  2. Heijmans-Antonissen, C., Wesseldijk, F., Munnikes, R. J., Huygen, F. J., van der Meijden, P., Hop, W. C., Hooijkaas, H., Zijlstra, F. J. Multiplex bead array assay for detection of 25 soluble cytokines in blister fluid of patients with complex regional pain syndrome type 1. Mediators Inflamm.. 28398, 1-8 (2006).
  3. Buvanendran, A., Kroin, J. S., Berger, R. A., Hallab, N. J., Saha, C., Negrescu, C., Moric, M., Caicedo, M. S., Tuman, K. J. Upregulation of prostaglandin E2 and interleukins in the central nervous system and peripheral tissue during and after surgery in humans. Anesthesiology. 104, 403-410 (2000).
  4. Holzheimer, R. G., Steinmetz, W. Local and systemic concentrations of pro- and anti-inflammatory cytokines in human wounds. Eur J Med Res. 5, 347-355 (2000).

Erratum

Formal Correction: Erratum: Collecting and Measuring Nociceptive and Inflammatory Mediators in Surgical Wounds
Posted by JoVE Editors on 03/07/2012. Citeable Link.

A correction was made to: Collecting and Measuring Nociceptive and Inflammatory Mediators in Surgical Wounds. A key reference was excluded.

A fifth reference:

5. Carvalho, B., Clark, D. J. & Angst, M. S. Local and Systemic Release of Cytokines, Nerve Growth Factor, Prostaglandin E2, and Substance P in Incisional Wounds and Serum Following Cesarean Delivery. The Journal of Pain : official journal of the American Pain Society 9 (7), 650-657 (2008).

was added. The abstract was updated to :

We describe a methodology by which we are able to collect and measure inflammatory and nociceptive biochemical mediators at the surgical wound site. Collecting site-specific biochemical markers allows us to evaluate the relationship between surgical wound and serum levels; determine any associations between mediator release, pain and analgesic consumption; and evaluate the effect of systemic and peripheral drug administration on surgical wound biochemistry.

This methodology has been applied to healthy women undergoing elective cesarean delivery with spinal anesthesia. Wound exudate and serum mediators, in conjunction with pain scores and analgesics consumption were measured at 1, 6, 24, and 48 hours post-cesarean delivery. Biochemical mediators that were detected included IL-1β, IL-2, IL-4, IL-6, IL-7, IL-8, IL-10, IL-12, IL-13, IL-17, TNFα, INFγ, G-CSF, GM-CSF, MCP-1 and MIP-1β, nerve growth factor (NGF), prostaglandin E2 (PG-E2) and substance P. We found no correlations between wound and serum cytokines concentrations or time-release profiles (J Pain. 2008 Jul 9(7):650-7). This article describes and demonstrates the feasibility of collecting and assaying nociceptive and inflammatory mediators in surgical wounds at specific time points. The lack of significant correlations between serum and wound levels shows the importance of determining site-specific release if surgical wounds and localized pathologies are to be studied.

from

The objectives of this study were to test the feasibility of collecting and measuring inflammatory and nociceptive biochemical mediators at the surgical site; to evaluate the relationship between wound and serum levels; and to determine any associations between mediator release, pain and analgesic consumption post-cesarean delivery. Twenty healthy women undergoing elective cesarean delivery with spinal anesthesia were enrolled. Wound exudate and serum mediators, pain scores and analgesics consumption were measured at 1, 6, 24, and 48 hours post-cesarean. In wound exudate, 19 out of 20 mediators were reliably detected including IL-1β, IL-2, IL-4, IL-6, IL-7, IL-8, IL-10, IL-12, IL-13, IL-17, TNFα, INFγ, G-CSF, GM-CSF, MCP-1 and MIP-1β, nerve growth factor (NGF), prostaglandin E2 (PG-E2) and substance P. Wound PG-E2 and various cytokines peaked early, whereas NGF showed a more delayed release. There were no correlations between the concentration versus time profile of wound and serum cytokines. This study demonstrates the feasibility of collecting and measuring nociceptive and inflammatory mediators in surgical wounds at specific time points. The lack of significant correlations between wound and serum levels emphasizes the importance of determining site-specific release if localized pathologies are to be studied.

Comments

1 Comment

  1. The technique appears robust, even if intuitive. However, as shown in the video paper, the data are collected in the presence of superfusion with local anaesthetic solution (in this case bupivacaine) which is very likely to modify the response and the local concentrations of mediators both as a direct pharmacological action of the local anaesthetic as well as through the fluid diluent effect. Moreover, adsoprtion of the various substances by the medical plastics would need evaluation. Hence a lot of control work needs to be done so that the numerical results obtained can be interpreted correctly. Perhaps the data are semiquantitative at best.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    March 4, 2009 - 6:37 PM

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