גזירת Trophoblast עכבר בתאי גזע Blastocysts

Summary

בסרטון הזה, אנחנו מדגימים את בידודה של blastocysts העכבר ואת הגזירה של בתאי גזע trophoblast מ blastocysts. אנחנו גם לתאר את תנאי תחזוקה של הנכס בתאי גזע, כמו גם גיוס של בידול בתרבות.

Abstract

מפרט של trophectoderm הוא אחד האירועים בידול המוקדם של התפתחות היונקים. השושלת trophoblast נגזר ההשתלה trophectoderm מתווכת ומייצר את החלק העוברי של השליה. כתוצאה מכך, את הפיתוח של שושלת זו היא חיונית להישרדות העובר. גזירת trophoblast גזע (TS) תאים blastocysts עכבר תוארה לראשונה על ידי טנקה

Protocol

בפרוטוקול זה, אנו מתארים את הכנת blastocysts עכבר והקמת קווי TS התא. מניפולציות עכבר כללי לפני גביית blastocysts, כולל הגדרת עבור ההזדווגות הטבעי הגיוס הביוץ סופר, בעצם לעקוב אחר הפרוטוקול הסטנדרטי מאויר על ידי נאגי ואח'. 2003 (pp146-150).

גזירת ותחזוקה של תאים TS

1. רבייה ההתקנה הכלאה בין העכברים של עניין.
2. הכן fibroblasts העכבר עובריים (MEFs) כמו תאים מזין. יומיים לפני גביית blastocysts, MEFs (2 x 10 ⁶ תאים) הם מצופה ב 100 מנות מ"מ. למחרת, תאים אלו מטופלים עם 10 מ"ל של מדיום TS המכיל mitomycin C (20 מ"ג / מ"ל) במשך הדגירה שעות 2 ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO _2. זה ואחריו כביסה תאים פעמיים עם PBS. C mitomycin תאים שטופלו הם זורעים אז 12 גם צלחות (1 x 10 ⁵ תאים / טוב).
3. ביום אוסף הבלסטוציסט (3.5 DPC, המכונה ביום אחד), בינונית MEF תרבות מוחלפת TS בינוני פלוס 1x FGF4/Heparin (0.5 מ"ל / טוב).
4. הכנה אוסף של הרחם: להרדים את העכבר ולאתר את הרחם (איור 1A).
5. הסר את הרחם ידי אחיזה עם מלקחיים על צוואר הרחם (הנמצא מאחורי שלפוחית ​​השתן) וחצתה צומת של הרחם וצוואר הרחם (איור 1B). משוך את הרחם, חתוך את קרום ורקמות שומן משם לחתוך את הרחם מתחת לצומת עם oviduct (תרשים 1C). מניחים את uteri (איור 1D) בנפח קטן (0.2 מ"ל) של המדיום TS בצלחת 60 מ"מ.
6. רוקן כל קרן הרחם עם 1 מ"ל של מדיום TS באמצעות מזרק 1 מ"ל עם מחט 26-מד. הכנס את המחט לתוך הבסיס של הרחם ולשטוף לאט לתוך צלחת 60 מ"מ עם המדיום החדש מ"ל 1 TS. הרחם צריך להיות מנופח המורחבת מלא במהלך השטיפה.
7. איסוף והעברת blastocysts בזהירות לתוך צלחת 12 נקי היטב המכיל בינוני TS בעזרת פיפטה בפה מבוקר. לשטוף blastocysts שלוש פעמים על ידי העברת סדרתי דרך המדיום TS ב 12 גם הצלחות. מקום אחד לכל הבלסטוציסט היטב (איור 2 א) בצלחת 12-היטב המכיל את mitomycin C שטופלו ניזונים MEF ותרבות ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO _2.
8. Blastocysts יבקעו מתוך zona pellucida ולצרף את בארות 24 עד 36 שעות. תוצאה קטנה יהיה לצפות בקלות ביום 3. פיד התרבויות עם המדיום TS μl 500 טרי בתוספת 1x FGF4/Heparin.
9. ביום 4 או 5, תוצאה הבלסטוציסט צריך להיות מוכן disaggregation בהתאם לגודלה. גודל אידיאלי עבור disaggregation תא TS מתואר באיור 3 ב. שטפו את התרבויות פעם עם 0.5 מ"ל PBS. מוסיפים 100 מ"ל 0.25% טריפסין / EDTA ו דגירה במשך 5 דקות ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO _2. הפסקת תוצאה לגושים קטנים על ידי pipetting למעלה ולמטה במרץ עם pipetteman P100. עצור את trypsinization ידי הוספת 70 ס"מ-TS-1.5F4H (בינוני TS 30%, 70% MEF-CM פלוס FGF4/Heparin 1.5x) לתוך הבאר. שנה בינונית 8 שעות לאחר disaggregation וממשיכים להאכיל תאים כל 2 ימים.
10. בין 6 ימים ו - 10 (משתנה מאוד) מושבות תאים TS ניתן לצפות. יש להם דף שטוח, אפיתל כמו מורפולוגיה עם גבול המושבה ברור (איור 2C). המשך להאכיל את כל התרבויות 2 ימים
11. כאשר תאים TS להגיע confluency 50% (בדרך כלל בין הימים 15 ו -20), לשטוף פעם עם PBS ולהוסיף 100 מ"ל 0.25% טריפסין / EDTA. פיפטה מעלה ומטה במהלך trypsinization כדי להבטיח השעיה ליד תא בודד. עצור את trypsinization ידי הוספת 70 ס"מ-TS-1.5F4H ולהעביר חדש צלחות 6-60mm טוב או הכולל את mitomycin C שטופלו ניזונים MEF (2.5 x 10 ⁵ cells/6-well או 5 x10 ⁵ cells/60mm צלחת).
12. שנה בינונית 8 שעות לאחר המעבר וממשיכים להאכיל את כל התרבויות 2 ימים.
13. אחרי אחד או שניים יותר קטעים (3-5 ימים בין קטעים) על ניזונים MEF, תאים TS יכול להיות מתורבת בלעדיהם. מכיוון MEFs לצרף צלחת התרבות הרבה יותר מהר מאשר תאים TS לאחר trypsinization, הבדל כזה בשיעור חסיד יכול להיות מנוצל כדי להפריד תאים TS מן ניזונים MEF. לאחר פטירתו תאים בתרבית, דגירה אותם 37 ° C CO, ₂ 5% למשך 30 דקות. רוב MEFs יצרף צלחת לבין האוכלוסייה ט.ס. נשאר ההשעיה. מעבירים את supernatant לצלחת חדשה. חזור על תהליך זה עבור כמה קטעים להשיג האוכלוסייה TS טהור.
14. שמור על תאים TS ב-TS-70 ס"מ 1.5F4H ולהעביר אותם כל 4 ימים (1:10-1:20 מפוצל) או כאשר התרבות מגיע 70% confluency. מירוץ תאים עם צפיפות גבוהה (יותר מאשר לפצל 01:05) או culturing אותם כאשר ומחוברות יתר על המידה עלול לגרום הבידול שלהם.
15. זהותו של תאים TS שניתן לאשר על ידי immunostaining של סמן תא, Cdx2 (איור 3).

TS בתאי הקפאה

1. הכן 2x בינוני הקפאה (50% FBS, TS 30% בינוניים DMSO 20%).
2. Coתאים llect TS ידי trypsinization, ואחריו צנטריפוגה ב 450 דקות 6. Resuspend אותם בינוני TS עם נפח שווה של המדיום הקפאת 2x.
3. להקפיא את התאים לאט באמצעות תא אלכוהול איזופרופילי ב -70 ° C ו להעביר חנקן נוזלי לאחר 24-48 שעות.
4. צלחת 60 מ"מ (70% ומחוברות) נשמר בדרך כלל 2 מבחנות.

הפשרת התאים TS

1. במהירות להפשיר את הבקבוקון ב 37 ° C, לאסוף אותם 10 מ"ל התקשורת TS ידי צנטריפוגה (450, 6 דק '), ו resuspend ב 30% TS מדיה, 70 ס"מ, 1.5F4H.
2. בקבוקון אחד של תאים זורעים בצלחת 60 מ"מ.

TS התמיינות תאים לתוך TGC

התמיינות של תאים TS לענק תאים trophoblast (TGCs) יכול להיגרם על ידי נסיגת MEF-CM, FGF4 ו הפרין. פנוטיפ TGC (גרעינים גדולים) ניתן לאתר ארבעה ימים אחרי הזירוז (טנקה et al. 1998 ו Chiu et al. 2008). Immunostaining של p450scc לזהות את הביטוי של סמן זה TGC בתרבות הבדיל (איור 4 א). ניתוח תזרים cytometric של PI (יודיד propidium) תאים מוכתם נוסף מראה נוכחות של תאים המכילים תוכן מובחן DNA גבוה יותר (איור 4 ב). התוצאות מראות כי תאים TS לעבור endoreduplication להפוך TGCs polyploid.

נציג תוצאות

באיור 1. Dissection uteri של העכבר. (א) מיקום uteri הוא מסומן על ידי החצים. (ב) חוצים צומת של הרחם וצוואר הרחם כפי שמוצג. (ג) חותכים את הרחם ממש מתחת oviduct (OD) מתחת בשחלה (OV). (ד) מקדימה של uteri.

איור 2. תמונות הנציג להמחיש הבלסטוציסט העכבר, תולדה הבלסטוציסט ואת המושבה trophoblast. (א) הבלסטוציסט עכבר שנאספו E3.5 מוצג. ICM, בתא המסה הפנימית; MT, trophectoderm ציור קיר; PT, trophectoderm הקוטב. (ב) תוצאה trophoblast על ניזונים MEF מוצג. TS, תא גזע trophoblast. (ג) גזע trophoblast המושבה תא מראה יתרון ברור על ניזונים MEF. החצים מצביעים על גבול תא.

איור 3. זיהוי של התאים על ידי TS immunostaining ניתוח. TS (AD) ו - ES (שליטה, EH) תאים כפופים זיהוי הסמן. תאים הם immunostained עם נוגדנים להכיר Oct4 (A, E) או Cdx2 (B, F), וכן על ידי counterstained DAPI (C, G) מוצגים תמונות הממוזגת (D, H). סרגל קנה מידה, 50 מיקרומטר.

איור 4. התמיינות של תאים TS במבחנה. (א) מובחן (Undiff) או מובחן (הבדל) התאים בתרבית נבדקו לביטוי של סמן TGC, counterstained p450scc (ירוק), עם DAPI (אדום). (ב) ניתוח תזרים cytometric של תאים מובחנים, מוכתם לצרכן, המודד את תכולת ה-DNA (M1, 03:58 עותקים; M2, יותר מארבעה עותקים). אוכלוסיית M2 מייצג את התאים trophoblast polyploid.

Discussion

בסרטון הזה, אנחנו מדגימים את תהליך לאסוף E3.5 blastocysts מהנהלים uteri וניסיוני להקים שורות תאים TS. אנו גם מתארים את המצב כדי לשמור על stemness של תאים TS כדי להשרות התמיינות לתאים שלהם מובחנים. שני צעדים קריטיים להשגת טהור שורות תאים TS הם עיתוי disaggregation תוצאה (שלב 9) ועיבוד המעבר הראשון (שלב 11). זה כבר דווח כי פרימיטיבי האנדודרם הנגזרות תאים יכולים להיווצר בתרבות לאחר הבלסטוציסט נרחב להגמל בשלב 9 או צמיחת יתר של מושבות TS (> 50% confluency) בשלב 11 (Kunath et al. 2005). למרות פרימיטיבי האנדודרם הנגזרות תאים ניתן לזהות על ידי המורפולוגיה הייחודית שלהם עם צורה תא מעוגלות מגע מופחת תאים תאים לעומת התאים TS, קשה להסיר אותם מן התרבות כי הם גדלים היטב במדיום TS ואל נראה דורשים ניזונים MEF או FGF4.

TGCs הבדיל להתעורר ללא הרף בתרבות TS אפילו בנוכחות של MEF-CM ו FGF4. אם האוכלוסייה TS טהור הוא הרצוי, תאים אלו מובחנים ניתן להפריד על בסיס שיעורי חסיד ההפרש. בדומה MEFs, TGCs לצרף צלחות תרבות מהר יותר מאשר תאים TS, מתן ההליך ניתן לרכוש אוכלוסייה TS טהור כמתואר בשלב 13. לחלופין, כי הם TGCs חסיד מאוד עמידים יותר בפני trypsinization, אוכלוסייה TS טהור גם ניתן להשיג על ידי trypisinization מהיר (3 דקות), ואחריה אוסף של תאים TS תנאי.

Materials

Reagents

TS medium: RPMI-1640, 20% FBS, 1 mM sodium pyruvate, 100 mM beta-mercapt–thanol and 100 mg/ml penicillin-streptomycin.

Mitomycin C: Dissolve 2 mg mitomycin C (Sigma M-0503) in 2 ml PBS and add this 2 ml mixture into 200 ml TS medium (10 ng/ml). Make 20 aliquots (10 ml) and store at -20°C until use. Add one aliquot per 100 mm plate.

Mouse embryonic fibroblast-condition medium (MEF-CM): Plate MEFs in 100 mm plates (1 x 106/plate). Next day, add 10 ml TS medium per dish and continue to culture for 48 hours. Collect the culture medium, filter them (0.45 mm) and store at -20°C in 35 ml aliquots. Thaw each aliquot when needed which can be stored at 4°C. The MEFs can be used to prepare for two more batches of CM before they become confluent.

PBS/BSA: Dissolve BSA, fraction V (Sigma A3311, 0.1% (w/v)) in PBS (10 ml), filter through a 0.45 mm syringe filter and make 1 ml aliquots in 1.5 ml tubes. Store at -70°C and thaw one tube when needed to prepare FGF4.

FGF4 (1000x): Resuspend lyophilized FGF4 (Sigma F8424, 25 mg) with 1 ml of the PBS/BSA solution. Mix well and make 10 aliquots (100 ml) into 1.5 ml tubes and store at -70°C. Thaw each tube when needed and store the remaining at 4°C, do not re-freeze. Dilute 1000 times in TS medium to obtain 1x FGF4 (25 ng/ml).

Heparin (1000x): Resuspend heparin (Sigma H3149, 10,000 units) in PBS to a final concentration of 1 mg/ml (1000x). Make 100 ml aliquots into 1.5 ml tubes and store at -70°C. Thaw aliquots when needed and store the remaining at 4°C, do not re-freeze. Dilute 1000 time in TS medium to obtain 1x heparin (1 ng/ml).