Dérivation de cellules souches de la souris Trophoblast à partir de blastocystes

Summary

Dans cette vidéo, nous démontrons l'isolement des blastocystes de souris et de la dérivation de cellules souches trophoblastiques à partir de blastocystes. Nous décrivons également les conditions d'entretien de la propriété de cellules souches ainsi que l'induction de la différenciation en culture.

Abstract

Spécification du trophectoderme est l'un des événements les plus anciens de différenciation du développement des mammifères. La lignée dérivée de trophoblaste trophectoderme médie l'implantation et génère la partie foetale du placenta. En conséquence, le développement de cette lignée est essentielle pour la survie des embryons. Dérivation de la tige du trophoblaste (TS), les cellules à partir de blastocystes de souris a été décrite par Tanaka

Protocol

Dans ce protocole, nous décrivons la préparation de blastocystes de souris et de la création de lignées de cellules TS. Manipulations de souris générale préalable à la collecte de blastocystes, y compris la mise en place pour l'accouplement naturel et l'induction de l'ovulation super, essentiellement suivi le protocole standard illustré par Nagy et al. 2003 (pp146-150).

Dérivation et la maintenance des cellules TS

1. Croisées entre les souris d'élevage de configuration d'intérêt.
2. Préparer les fibroblastes embryonnaires de souris (MEF) en tant que cellules nourricières. Deux jours avant la collecte des blastocystes, FAE (2 x 10 ⁶ cellules) sont étalées dans des boîtes de 100 mm. Le lendemain, ces cellules sont traitées avec 10 ml de milieu de TS contenant la mitomycine C (20 mg / ml) pendant 2 heures d'incubation à 37 ° C, 5% de CO _2. Il est suivi par un lavage des cellules deux fois avec du PBS. Les cellules mitomycine C traitées sont ensuite ensemencées dans des plaques 12 puits (1 x 10 ⁵ cellules / puits).
3. Le jour de la collecte de blastocyste (3,5 jpc, appelé le premier jour), un milieu de culture est remplacé par le MEF TS moyenne plus de 1x FGF4/Heparin (0,5 ml / puits).
4. Préparation pour la collecte de l'utérus: euthanasier la souris et de localiser l'utérus (figure 1A).
5. Enlever l'utérus en la saisissant avec une pince à col de l'utérus (situé derrière la vessie) et couper à travers la jonction de l'utérus et du col utérin (figure 1B). Tirez l'utérus, les garnitures de la membrane et les tissus adipeux loin et couper l'utérus en dessous de la jonction avec l'oviducte (figure 1C). Placez le col (figure 1D) dans un petit volume (0,2 ml) du milieu TS dans une plaque de 60 mm.
6. Rincer chaque corne utérine avec 1 ml de milieu de TS à l'aide d'une seringue de 1 ml avec une aiguille de calibre 26. Insérez l'aiguille dans la base de l'utérus et rincer lentement dans une nouvelle plaque de 60 mm avec une moyenne TS ml. L'utérus doit être gonflé et étendu intégralement pendant le rinçage.
7. Recueillir et le transfert des blastocystes avec précaution dans un endroit propre plaque 12 puits contenant du milieu TS à l'aide d'une pipette bouche-contrôlé. Lavez blastocystes à trois reprises par le transfert de série par le biais du milieu TS en plaques de 12 puits. Placez un blastocyste par puits (figure 2A) dans une plaque de 12 puits contenant les mitomycine C-traitée mangeoires MEF et la culture à 37 ° C, 5% de CO _2.
8. Les blastocystes éclosent à partir zone pellucide et joindre les puits de 24 à 36 heures. Une petite excroissance être facilement observée le jour 3. Nourrissez les cultures avec 500 ul du milieu TS frais plus 1x FGF4/Heparin.
9. Au jour 4 ou 5, l'excroissance blastocyste devrait être prêt pour la ventilation en fonction de sa taille. La taille idéale pour la désagrégation des cellules TS est illustré dans la figure 3B. Laver les cultures une fois avec 0,5 ml de PBS. Ajouter 100 ml 0,25% de trypsine / EDTA et incuber pendant 5 minutes à 37 ° C, 5% de CO _2. Pause dans l'excroissance de petites touffes d'aspiration et refoulement vigoureusement avec une pipetteman P100. Arrêter le traitement à la trypsine en ajoutant le TS-70CM-1.5F4H (milieu TS 30%, 70% MEF-CM, plus FGF4/Heparin 1.5x) dans le puits. Changer moyenne 8 heures après la désagrégation et de continuer à nourrir les cellules tous les 2 jours.
10. Entre les jours 6 et 10 (très variable) des colonies de cellules TS peuvent être observés. Ils ont plat, drap, comme la morphologie épithéliale avec une frontière claire colonie (figure 2C). Continuer à alimenter les cultures tous les 2 jours
11. Lorsque les cellules atteignent la confluence TS de 50% (généralement entre 15 et 20 jours), se laver une fois avec du PBS et ajouter 100 ml 0,25% de trypsine / EDTA. Pipeter haut en bas durant trypsinisation pour assurer une proximité unique de cellules en suspension. Arrêter le traitement à la trypsine en ajoutant le TS-70CM-1.5F4H et le transfert de nouvelles plaques de 6 puits ou 60mm contenant la mitomycine C-traitée mangeoires MEF (2,5 x 10 ⁵ cells/6-well ou 5 x10 ⁵ cells/60mm plaque).
12. Changer moyenne 8 heures après le passage et continuer à nourrir les cultures tous les 2 jours.
13. Après un ou deux passages plus (3-5 jours entre les passages) sur les départs du MEF, les cellules peuvent être cultivées TS sans eux. Parce MEFs attacher à la plaque de culture beaucoup plus vite que les cellules TS après trypsinisation, une telle différence dans le taux adhérentes peuvent être utilisées pour séparer les cellules TS à partir des mangeoires MEF. Après le passage des cellules cultivées, les incuber à 37 ° C CO, 5% ₂ pendant 30 min. La plupart des FAE se joindre à la plaque et la population TS reste en suspension. Transférer le surnageant dans une nouvelle plaque. Répétez ce processus pour plusieurs passages pour obtenir une population TS pur.
14. Maintenir les cellules TS dans le TS-70CM-1.5F4H et les passer tous les 4 jours (1:10-1:20 split) ou lorsque la culture atteint 70% de confluence. Passant les cellules à haute densité (supérieure à diviser 01h05) ou en les cultivant en trop confluentes peut provoquer leur différenciation.
15. L'identité des cellules TS peut être confirmée par immunomarquage d'un marqueur de cellule, Cdx2 (figure 3).

TS cellules de congélation

1. Préparer 2x milieu de congélation (50% de FBS, 30 moyennes TS% et 20% de DMSO).
2. Cocellules TS llect par trypsinisation, suivie par une centrifugation à 450g pendant 6 min. Les remettre en suspension dans un milieu de TS avec un volume égal de milieu de congélation 2x.
3. Congelez les cellules lentement en utilisant une chambre de l'alcool isopropylique à -70 ° C et transfert à l'azote liquide après 24-48 heures.
4. Une plaque de 60 mm (70% de confluence) est habituellement conservée dans deux flacons.

La décongélation des cellules TS

1. Vite dégeler le flacon à 37 ° C, les recueillir dans 10 médias TS ml par centrifugation (450g, 6 min), et remettre en suspension dans 30% TS médias, 70CM-1.5F4H.
2. Un flacon de cellules est ensemencé dans une plaque de 60 mm.

Différenciation des cellules TS en TGC

La différenciation des cellules TS en cellules géantes du trophoblaste (PGT) peut être induite par le retrait du MEF-CM, FGF4 et l'héparine. Le phénotype TGC (gros noyaux) peut être détecté quatre jours après l'induction (Tanaka et al., 1998 et Chiu et al. 2008). Immunocoloration des P450scc détecter l'expression de ce marqueur TGC dans la culture différenciés (figure 4A). Cytométrie de flux IP (iodure de propidium) cellules colorées montre en outre la présence de cellules différenciées contenant plus forte teneur en ADN (figure 4B). Ces résultats suggèrent que les cellules subissent TS endoréduplication devenir TGC polyploïdes.

Les résultats représentatifs

Figure 1. Dissection de l'utérus de la souris. (A) Situation de l'utérus est indiqué par des flèches. (B) Couper à travers la jonction de l'utérus et le col comme indiqué. (C) Couper l'utérus juste en dessous de l'oviducte (DO) au-dessous de l'ovaire (VO). (D) Image de l'utérus.

Images représentant la figure 2. Illustrent blastocyste de souris, excroissance blastocyste et la colonie du trophoblaste. (A) un blastocyste de souris recueillies à E3.5 est montré. ICM, la masse cellulaire interne, MT, trophectoderme mural; PT, trophectoderme polaire. (B) une excroissance du trophoblaste sur les départs du MEF est montré. TS, cellules souches trophoblastiques. (C) Une colonie de cellules souches trophoblastiques montre un net avantage sur les départs du MEF. Les flèches indiquent les limites des cellules.

Figure 3. Identification des cellules TS par immunomarquage analyse. TS (AD) et ES (contrôle, EH), les cellules sont soumises à l'identification des marqueurs. Les cellules sont immunocolorés avec des anticorps de reconnaître Oct4 (A, E) ou Cdx2 (B, F), et contre par DAPI (C, G) a présenté en images fusionnées (D, H). La barre d'échelle, 50 um.

Figure 4. Différenciation des cellules TS in vitro. (A) indifférenciées (Undiff) ou différenciés (Diff) de cellules en culture ont été examinés pour l'expression d'un marqueur de TGC, P450scc (vert), de contraste avec DAPI (en rouge). (B) Analyse par cytométrie en flux des cellules différenciées, tachée de PI, le contenu des mesures ADN (M1, deux à quatre exemplaires, M2, plus de quatre exemplaires). La population M2 représente les cellules trophoblastiques polyploïdes.

Discussion

Dans cette vidéo, nous démontrons le processus de collecte E3.5 blastocystes à partir des procédures de l'utérus et d'expérimentation pour établir des lignées de cellules TS. Nous décrivons également la condition de maintenir le caractère souche de cellules TS et d'induire leur différenciation en cellules différenciées. Deux étapes essentielles pures pour obtenir des lignées de cellules TS sont le moment de la désagrégation prolongement (étape 9) et le traitement du premier passage (étape 11). Il a été rapporté que l'endoderme primitif des cellules dérivées peuvent survenir dans la culture après blastocyste vaste dépasser l'étape 9 ou prolifération des colonies de TS (> 50% de confluence) à l'étape 11 (Kunath et al., 2005). Bien que primitive endoderme des cellules dérivées peuvent être identifiés par leur morphologie particulière avec une forme arrondie et la cellule réduite contact cellule-cellule par rapport aux cellules TS, il est difficile de les retirer de la culture, car ils poussent bien dans le milieu TS et ne semblent avoir besoin de mangeoires MEF ou FGF4.

La TGC différenciés peuvent surgir en permanence dans la culture TS, même en présence du MEF-CM et FGF4. Si une population TS pur est désiré, ces cellules différenciées peuvent être séparés sur la base des taux différentiels adhérentes. Similaire à FAE, TGC attacher à des plaques de culture plus vite que les cellules TS, prévoyant une procédure possible d'acquérir une population TS pur comme décrit dans l'étape 13. Alternativement, parce TGC sont fortement adhérentes et plus résistant à la trypsine, une population TS pures peuvent également être obtenus par trypisinization rapide (3 min), suivie par la collecte des cellules TS suspendu.

Materials

Reagents

TS medium: RPMI-1640, 20% FBS, 1 mM sodium pyruvate, 100 mM beta-mercapt–thanol and 100 mg/ml penicillin-streptomycin.

Mitomycin C: Dissolve 2 mg mitomycin C (Sigma M-0503) in 2 ml PBS and add this 2 ml mixture into 200 ml TS medium (10 ng/ml). Make 20 aliquots (10 ml) and store at -20°C until use. Add one aliquot per 100 mm plate.

Mouse embryonic fibroblast-condition medium (MEF-CM): Plate MEFs in 100 mm plates (1 x 106/plate). Next day, add 10 ml TS medium per dish and continue to culture for 48 hours. Collect the culture medium, filter them (0.45 mm) and store at -20°C in 35 ml aliquots. Thaw each aliquot when needed which can be stored at 4°C. The MEFs can be used to prepare for two more batches of CM before they become confluent.

PBS/BSA: Dissolve BSA, fraction V (Sigma A3311, 0.1% (w/v)) in PBS (10 ml), filter through a 0.45 mm syringe filter and make 1 ml aliquots in 1.5 ml tubes. Store at -70°C and thaw one tube when needed to prepare FGF4.

FGF4 (1000x): Resuspend lyophilized FGF4 (Sigma F8424, 25 mg) with 1 ml of the PBS/BSA solution. Mix well and make 10 aliquots (100 ml) into 1.5 ml tubes and store at -70°C. Thaw each tube when needed and store the remaining at 4°C, do not re-freeze. Dilute 1000 times in TS medium to obtain 1x FGF4 (25 ng/ml).

Heparin (1000x): Resuspend heparin (Sigma H3149, 10,000 units) in PBS to a final concentration of 1 mg/ml (1000x). Make 100 ml aliquots into 1.5 ml tubes and store at -70°C. Thaw aliquots when needed and store the remaining at 4°C, do not re-freeze. Dilute 1000 time in TS medium to obtain 1x heparin (1 ng/ml).