Summary
方法用于测试的抗精神病药物（APD）提供在秀丽隐杆线虫的效果表现出来。分析描述了用于测试的发展和生存能力和咽抽水率药物作用。这些方法也适用于药理学实验与比APD的其他类药物。
Abstract
秀丽隐杆线虫是一种简单的遗传生物经得起大规模的正向和反向遗传筛选和化学遗传筛选。该三线虫基因组包括潜在的抗精神病药物（APD）保守在人类的目标，包括基因编码所需的神经递质的合成和突触的结构和功能的蛋白质。 APD曝光产生以浓度依赖的方式发育迟缓和/或致死的线虫。这些表型引起的，部分是由APD-诱导抑制咽泵1,2的。因此，发展型有神经肌肉的基础上，使其成为有用的抗精神病药的药理学研究。在这里，我们展示了详细的程序，用于测试对线虫发育和咽抽水APD的影响。对于发育检测，同步胚胎放在线虫生长培养基含有的APD（NGM）板，和ANI发展的阶段MALS，然后每天进行评分。对于咽抽水速率法，上演年轻的成年动物都含有APD的NGM板测试。每单位时间的咽泵的数目被记录下来，并且该泵送率的计算方法。这些测定可用于研究许多其他类型的小分子，甚至大的分子。
Introduction
秀丽隐杆线虫是一种简单的遗传生物经得起大规模的正向和反向遗传筛选和化学遗传筛选。C。线虫是一个广泛的生物活性化合物的光谱敏感，并因此被成功地用于定义各种这样的化合物的作用机制。例如，生物活性物质利用蠕虫药理学包括乙酰胆碱受体激动剂（ 如左旋咪唑，尼古丁，噻烯氢嘧啶，噻嘧啶和），麻醉药（ 如氟烷），咖啡因，胆碱酯酶抑制剂（ 如涕灭威，lannate和敌百虫），氟化物，GABA相关研究化合物（ 如 γ-氨基丁酸和 蝇蕈醇），伊维菌素，百草枯，佛波醇酯和五羟色胺有关的药物（ 如血清素和imiprimine）3。此外，C。线虫已经用于大型的小分子的屏幕，允许发现新的生物活性化合物s和鉴定新基因目标4。
该三线虫基因组包括潜在的抗精神病药物（APD）保守在人类的目标，包括基因编码所需的神经递质的合成和突触的结构和功能5蛋白。因此，C。线虫神经遗传学和神经生物学报价方法发现的APD作用的新的分子机制。线虫，APD的曝光处于发展初期产生发育迟缓，并在较高的浓度，杀伤力2,6。成年期的APD曝光产生的行为表型。例如，氯氮平曝光抑制运动和咽抽水，提高产蛋1,2,7。
APD引起的发育迟缓和杀伤力是强大的表型为大型化工遗传筛选。这些表型是复杂的，只要它们可能有一个以上的细胞和遗传巴斯秒。因此，这样的遗传筛选预期产生的各种间接的药物靶点。然而，我们的实验室已进行候选基因的屏幕和全基因组RNAi筛选为APD引起发育迟缓和杀伤力抑制器，并已成功恢复基因，可能编码直接目标，包括多巴胺，胰岛素和烟碱乙酰胆碱受体2,8。的基础上，成人APD诱导行为遗传筛选也导致了新的APD目标的确定，以及我们现在正在从哺乳动物7两个发育和行为屏幕验证目标。因此，无脊椎动物化学遗传学方法发现的APD作用的新的分子机制似乎是可行5,8。
该三线虫咽的是，包括20个神经元，20肌细胞，和20辅助细胞，包裹由基底膜的器官。类似于哺乳动物的心脏，咽是一个自治第二不断泵食品在来自外部环境的9。咽抽水率抑制妥协食物的摄取，从而突变或药物抑制咽抽水引起发育迟缓或逮捕9。 APD的抑制咽抽水率，占部分为他们的发展和生存能力1,2效果。在这里，我们用非典型APD氯氮平作为一个例子来证明药物检测线虫发育和咽抽水。
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Protocol
1。发展迟缓/致命偷袭含量：野生型（N2）和两个突变（MUT1和MUT2）菌株在12孔板测试三中氯氮平浓度
- 在第1天，倒入2毫升NGM培养基中10到12孔板的各孔中（每孔用直径2厘米），并允许过夜变硬的 长凳上，在室温（RT）。同一天，挑大肠杆菌 OP50细菌菌落，感染了一瓶50毫升LB培养基溶液，它的文化在37℃摇床以220rpm旋转过夜。
- 第2天，转移20微升OP50细菌培养到中心各NGM的好。培养板在37℃培养箱中或将它们在室温下过夜，使细菌草坪生长厚。
- 通过在DMSO（二甲亚砜）的溶剂中溶解氯氮平作出80mM的氯氮平原液。然后作出80微升工作液用稀释的1.7 mM的醋酸b将原液ASED于表1中 。
注 ：感兴趣的特定药物的工作液必须通过做一系列的初步浓度测试，以找到最合适的浓度从区分突变体与野生型而定。 - 转移80微升氯氮平工作溶液到种子的NGM板孔和旋动板以使溶液均匀地分布在表面上。等待该板干燥。使用板测定在同一天或将其放置在20℃培养箱中培养，第二天使用。
注 ：工作液是一种药物悬浮液由于氯氮平的低溶解度，尤其是在较高浓度。因此，将所述溶液的药物板，以保证药物浓度是准确之前旋涡振荡管。 - 洗蠕虫关闭包含许多妊娠成人M9的缓冲区3.5公分板，然后旋转下来，在一个15毫升管在2000 rpm离心1分钟。
- 吸出上清液。加入5 ml漂白剂溶液（氢氧化钠：次氯酸钠：双蒸2 O为4:1:5），并轻轻倒转试管破坏线虫。
- 观察动物，直到其中一半溶解在大约5分钟。降速卵在2000 rpm下离心1分钟。
- 吸出上清液，并添加14毫升M9缓冲液迅速。
- 降速卵在2000 rpm下离心1分钟，吸出上清液，留下约100μl的溶液。旋涡暂停鸡蛋。
- 在M9上暂停定期NGM板测试多少个蛋被转移转移2微升鸡蛋。调整悬浮卵的体积，以确保有大约30-35鸡蛋中的每个传输。转让30-35鸡蛋到分析板的每一个孔，然后孵育在20℃培养箱中培养24小时。
- 在测定法的第一天，得分卵孵化的数目。调整阴影动物的总数由picki到25/well纳克去多虫如果必要的。
- 在接下来的日子里，观察动物和它们的得分，每24小时。发育阶段是根据动物的大小和外阴11的形状进行评分。实验持续5-6天，最强大的效应通常出现在第三或第四天。
- 输入的数据转换成一个Excel文件，并计算动物在每个发育阶段的百分率为实验的每一天。生成图表的功能'100百分比堆积柱形图“在'2-D列”菜单。
2。咽抽水含量：年轻的成年动物的野生型和突变菌株进球对氯氮平检测板
- 测定板是由下列用于发育延迟/致死率试验相同的协议。
- 挑选50 L4动物对每个菌株接种NGM板24小时的检测前和孵化的蠕虫病毒在20°C
- 挑选10只动物到ASSAY板好。然后挑选10只动物到下一个孔每次15-20分钟。
- 后在第一阱动物已暴露于药物30分钟后，通过观察咽泵启动测定解剖显微镜下和得分的泵，持续20秒9。一旦咽抽水是得分，挑虫脱盘。
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Representative Results
1。发育迟缓/杀伤力测定结果
一个典型的结果为发育延迟/致死率试验中演示了图1a和1b。当对照组野生型动物已发展到了妊娠成年阶段（ 图1a），暴露于氯氮平野生型动物仍然在年轻的幼虫阶段或已经死了（ 图1b）。图1c显示比较具有代表性的结果抑制基因的突变体（MUT1）和增强子的突变体（MUT2）与野生型在三个不同氯氮平浓度。在所有三个氯氮平浓度，MUT1的杀伤力比野生型低，MUT2的杀伤力更高。幸存的MUT1动物发展到比野生型更先进的幼虫阶段，而与野生型相比尚存MUT2动物显示发育迟缓。</ P>
2。咽抽水速率测定结果
图2示出与野生型在两个氯氮平浓度比较抑制器突变体（MUT1）和增强子的突变体（MUT2）的代表性咽泵送试验的结果。氯氮平曝光减少以浓度依赖性方式的野生型和突变株的咽泵送速率。然而，MUT1的下降咽泵送速率小于野生型，而MUT2的下降咽泵送速率大于野生型的。
图1。示范氯氮平诱导发育迟缓和致死的野生型动物（N2）上生长的控制 NGM板（a）和上一个NGM板补充有200微克/毫升（612μM），氯氮平（b）所示 。 （c）表示对野生型（N2），抑制基因的突变体（MUT1），和一个增强子突变体（MUT2）氯氮平的效果的发育延迟/致死率试验的代表性结果。在（a）和（b）中重印<图像http://www.nature.com/npp/journal/v34/n8/full/npp200935a.html从神经心理药物学 > 34（8），1968年至1978年（七月，2009）。 点击这里查看大图 。
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图2。示范咽泵氯氮平诱发的抑制。一个典型的结果，示出了野生型（N2），抑制基因的突变体（MUT1），和一个增强子突变体（MUT2）氯氮平的影响咽部抽吸测定。这些数据是使用双因素方差分析的统计软件分析，R. 点击此处查看大图 。
表1中。制备氯氮平的工作液。量为4个孔在各浓度。
| 氯氮平浓度 | 0μM | 300微米 | 400微米 | 500微米 |
|---|---|---|---|---|
| HAC解决方案 | 270微升 | 270微升 | 270微升 | 270微升 |
| 氯氮平原液 | - | 30微升 | 40微升 | 50微升 |
| DMSO | 50微升 | 20微升 | 10微升 | 0微升 |
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Discussion
在这里，我们描述了用于测试的APD对C的发展和行为的影响的方法线虫 。 DMSO或乙醇来溶解氯氮平，因为药物是相对不溶于水。因为溶剂已报道影响C.线虫生物学12，DMSO单独或乙醇单独对照组是必不可少的。 DMSO在我们的实验中使用的最高浓度可达3％，这不会对下一个明显的效果线虫的发展。 DMSO可用于许多小分子，或什至一些大的分子， 例如脂氨基酸。
在这些测定中所使用的APD的浓度比提供给人类更高。这是很常见的在C大多数小分子的研究线虫 ，由于高浓度的所需C的渗透线虫角质层。高效液相色谱法的研究表明，氯氮平在C的水平处于发育ASSA 线虫组织y是接近于预期在人类大脑2。
角质层的渗透力是大分子的研究，特别令人关注。突变体与角质层屏障的缺陷，如ACS-20突变体和总线（B acterially 加利-S粗纺）突变体，提供了一种方法来绕过这个问题13。总线突变体已被分离的由病原体微杆菌nematophilum的抗感染能力的基础上。例如， 总线8的弱等位基因表明，该基因在生产角质层表面的作用。这些突变体抗感染，因为细菌不能绑定到主机上。重要的是，形成角质层破坏也导致这种遗传背景14增加药物的敏感性。
这里所描述的发育测定可以通过在液体丘尔进行测定按比例放大进行大规模的遗传筛选重。用于全基因组RNA干扰（RNAi）的屏幕，例如，该协议是类似于上面描述的，但进料的RNAi细菌代替OP50细菌15。液体培养法需要较低的药物浓度比板测定（未发表的观察）。我们的实验室进行这样的全基因组RNAi筛选氯氮平引起的发育迟缓的抑制，并从17,000〜C的屏幕获得40抑制器线虫基因8。
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Disclosures
作者宣称，有没有涉及利益冲突。
Acknowledgments
这项工作是由美国国立卫生研究院临床科学家发展奖K08NS002083，一个Shervert弗雷泽研究所格兰特和NARSAD青年研究者奖，以埃德加A.巴特纳支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Clozapine | Sigma | C6305 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | D8418 | |
| Acetic acid (HAC) | Fisher | BP2401 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | EMD | SX0590-13 | |
| Hypochlorite | Sigma-Aldrich | 425044 | |
| Centrifuge 5810 | Eppendorf | 5810 000.017 | |
| Incubator shaker | New Brunswick Scientific | M1246-0006 | |
| Low temperature incubator 815 | Precision Scientific | J1790-1B | |
| Stereomicroscope | Olympus | SZX12 | |
| Petri dish 35 x 10 mm | Fisher Scientific | NC9434271 | |
| 12-well Tissue culture plate | BD Falcon | REF 353043 |
References
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