Summary
Benaderingen voor het testen van de effecten van antipsychotica (APD) in Caenorhabditis elegans worden gedemonstreerd. Assays zijn beschreven voor het testen van geneesmiddelen effecten op de ontwikkeling en de levensvatbaarheid en keelholte pompsnelheid. Deze methoden zijn ook van toepassing voor farmacogenetisch experimenten met andere dan APD drugklassen.
Abstract
Caenorhabditis elegans is een eenvoudige genetische organisme vatbaar zijn voor grootschalige vooruit en achteruit genetische screens en chemische genetische screens. De C. elegans genoom omvat potentiële antipsychotische geneesmiddel (APD) doelen geconserveerd bij de mens, waaronder genen die coderen voor eiwitten die nodig zijn voor synthese van neurotransmitters en synaptische structuur en functie. APD blootstelling produceert ontwikkelingsvertraging en / of letaliteit bij nematoden in een concentratie-afhankelijke wijze. Deze fenotypes worden veroorzaakt, gedeeltelijk door APD-geïnduceerde remming van pharynx pompen 1,2. Aldus, de ontwikkeling fenotype een neuromusculaire basis, waardoor het nuttig farmacogenetische studies van neuroleptica. Hier laten we zien gedetailleerde procedures voor het testen van APD effecten op de nematode ontwikkeling en keelholte pompen. Voor de ontwikkelings-test worden gesynchroniseerd embryo's op nematode groeimedium (NGM) platen die APD, en de fasen van de ontwikkeling van ani geplaatstmals worden vervolgens dagelijks gescoord. Voor de keelholte pompsnelheid assay, geënsceneerd jonge volwassen dieren worden getest op NGM platen met APD. Het aantal keelholte pompen per tijdseenheid wordt opgenomen, en de pompsnelheid wordt berekend. Deze testen kunnen worden gebruikt voor het bestuderen van vele andere soorten kleine moleculen of zelfs grote moleculen.
Introduction
Caenorhabditis elegans is een eenvoudige genetische organisme vatbaar zijn voor grootschalige vooruit en achteruit genetische screens en chemische genetische screens. C. elegans is gevoelig voor een breed spectrum van bioactieve verbindingen en is derhalve met succes gebruikt om de werkingsmechanismen van een verscheidenheid van dergelijke verbindingen vast. Bijvoorbeeld, bioactieve verbindingen bestudeerd met behulp van worm farmacogenetica bevatten acetylcholine receptor agonisten (zoals levamisol, nicotine, morantel en pyrantel), anesthetica (bijv. halothaan), cafeïne, cholinesteraseremmers (bijv. aldicarb, Lannate en trichloorfon), fluoride, GABA-gerelateerde stoffen (bijv. GABA en muscimol), ivermectine, paraquat, forbolesters en serotonine verwante drugs (bijv. serotonine en imiprimine) 3. Bovendien C. elegans is gebruikt voor grootschalige klein molecuul schermen, waardoor ontdekking van nieuwe bioactieve verbindings en de identificatie van nieuwe genetische doelwitten 4.
De C. elegans genoom omvat potentiële antipsychotische geneesmiddel (APD) doelen geconserveerd bij de mens, waaronder genen die coderen voor eiwitten die nodig zijn voor synthese van neurotransmitters en synaptische structuur en functie 5. Aldus C. elegans neurogenetica en neurobiologie aan de lezer methoden voor het ontdekken van nieuwe moleculaire werkingsmechanismen van APD. In nematoden, APD blootstelling vroeg in de ontwikkeling veroorzaakt vertraging in de ontwikkeling, en bij hogere concentraties, dodelijkheid 2,6. APD blootstelling tijdens de volwassenheid produceert gedragsproblemen fenotypes. Bijvoorbeeld, clozapine blootstelling remt motoriek en keelholte pompen en verbetert de eileg 1,2,7.
APD-geïnduceerde vertraging in de ontwikkeling en dodelijkheid zijn krachtige fenotypes voor grootschalige chemische genetische screens. Deze fenotypes complex voorzover zij waarschijnlijk meer dan een cellulaire en genetische basis. Daarom worden dergelijke genetische screens wordt naar verschillende indirecte targets opleveren. Echter, heeft ons laboratorium kandidaat-gen schermen en een genoom-brede RNAi scherm onderdrukkers van APD-geïnduceerde vertraging in de ontwikkeling en dodelijkheid uitgevoerd en heeft met succes hersteld genen die waarschijnlijk coderen directe doelen, waaronder dopamine, insuline, en nicotine acetylcholine receptoren 2,8. Genetische screens op basis van APD-geïnduceerde gedrag in de volwassen hebben ook geleid tot de identificatie van nieuwe doelwitten APD, en we zijn nu valideren van targets van zowel ontwikkelings-en gedragsproblemen schermen in zoogdieren 7. Zo verschijnt er een ongewervelde chemisch genetische benadering van nieuwe moleculaire werkingsmechanismen van APD ontdekken haalbaar 5,8 te zijn.
De C. elegans keelholte is een orgaan dat 20 neuronen, 20 spiercellen en 20 accessoire cellen, verpakt door een basaal membraan omvat. Net als de zoogdierhart, de keelholte autonoom eennd voortdurend pompen van voedsel in de externe omgeving 9. Remming van de keelholte pompsnelheid compromissen voedselopname, en dus mutaties of geneesmiddelen die de keelholte pompen oorzaak vertraging in de ontwikkeling te remmen of te stoppen 9. APD's remmen de keelholte pompsnelheid, goed voor een deel van hun effecten op de ontwikkeling en levensvatbaarheid 1,2. Hier gebruiken we de atypische APD clozapine als een voorbeeld voor drug testen voor nematode ontwikkeling en keelholte pompen demonstreren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Developmental Delay / Letaliteit Assay: The Wild-Type (N2) en Two Mutant (Mut1 en Mut2) stammen worden beproefd in drie Clozapine Concentraties in een 12-well plaat
- Op dag 1, pour 2 ml NGM 10 medium in elk putje van een 12-well plaat (elk putje met een 2 cm diameter) en een nacht laten uitharden de bank bij kamertemperatuur (RT). Op dezelfde dag, kies een kolonie van Escherichia coli OP50 bacteriën infecteren van een flesje van 50 ml LB-oplossing, en cultuur in een 37 ° C schudder bij 220 rpm draaien 's nachts.
- Op dag 2, overdracht 20 ul OP50 bacteriecultuur op het midden van elk NGM ook. Incubeer de platen in een 37 ° C incubator of laat ze bij kamertemperatuur geroerd om de bacteriedek dikker groeien.
- Maak een 80 mm clozapine voorraad oplossing door het oplossen van clozapine in DMSO (dimethylsulfoxide) oplosmiddel. Maak dan een 80 ul werken oplossing met de stock-oplossing verdund in 1,7 mM azijnzuur based in tabel 1.
Opmerking: De werkoplossing een bepaald geneesmiddel plaats moet worden bepaald door het doen van een reeks vooraf concentratie tests om de meest geschikte concentratie te vinden voor het onderscheiden van de wildtype van de mutanten. - Overdracht 80 ul clozapine werken oplossing op de geplaatste NGM plaat goed en draai de plaat zodat de oplossing gelijkmatig te verdelen over het oppervlak. Wacht tot de plaat te drogen. Gebruik de plaat voor de test op dezelfde dag en plaats deze in een 20 ° C incubator de volgende dag te gebruiken.
Opmerking: De werkoplossing is een geneesmiddelsuspensie vanwege de lage oplosbaarheid van clozapine, vooral bij hogere concentraties. Daarom vortex de buis alvorens de oplossing van het geneesmiddel plaat om te garanderen dat de geneesmiddelconcentratie juist. - Wassen wormen uit een 3,5 cm plaat met veel zwangere volwassenen met M9 buffer en dan draaien ze in een 15 ml buisbij 2000 rpm gedurende 1 minuut.
- Zuig de supernatant. Voeg 5 ml bleekwater-oplossing (NaOH: hypochloriet: DDH 2 O bij 4:01:05) en verstoren de nematoden door voorzichtig omkeren van de buizen.
- Observeer de dieren tot de helft van hen zijn opgelost in ongeveer 5 minuten. Spin down de eieren bij 2.000 tpm gedurende 1 minuut.
- Zuig het supernatant en voeg snel 14 ml M9 buffer.
- Spin down de eieren bij 2.000 tpm gedurende 1 minuut en het supernatans aspireren, waardoor ongeveer 100 ul oplossing. Vortex om de eieren te schorten.
- Transfer 2 pl eieren opgehangen in M9 op een regelmatige NGM plaat om te testen hoeveel eieren worden overgebracht. Pas het volume van de geschorste eieren om ervoor te zorgen dat er ongeveer 30-35 eieren per overschrijving. Overdracht 30-35 eieren aan elk putje van de testplaat, en dan geïncubeerd in een 20 ° C incubator gedurende 24 uur.
- Op de eerste dag van de test, scoren het aantal eieren uitgekomen. Stel het totale aantal uitgekomen dieren 25/well door picking uit de extra wormen indien nodig.
- Op de volgende dagen, observeren de dieren en scoren ze elke 24 uur. Ontwikkelingsstadium wordt gescoord gebaseerd op de grootte van het dier en de vorm van de vulva 11. Het experiment duurt 5-6 dagen met de meest robuuste effect meestal gezien op de derde of vierde dag.
- Voer de gegevens in een Excel-bestand en bereken het percentage dieren in elk ontwikkelingsstadium voor elke dag van het experiment. Grafieken genereren met de functie '100% gestapelde kolom 'in de '2-D kolom' menu.
2. Keelholte Pumping Assay: Young Adult Dieren voor de wild-type en mutante stammen worden gescoord op Clozapine assayplaten
- De assay plaat is gemaakt volgens dezelfde protocol dat wordt gebruikt voor de vertraging in de ontwikkeling / dodelijkheid assay.
- Pick 50 L4 dieren van elke soort gezaaid om NGM platen 24 uur voor de test en incubeer de wormen bij 20 ° C.
- Pick 10 dieren een ASSAy plaat ook. Kies dan 10 dieren om het volgende goed elke 15-20 minuten.
- Nadat de dieren in de eerste putje werden blootgesteld aan drug voor 30 minuten, beginnen de test door het observeren pharyngeale pompen onder een dissectie microscoop en de score van de pompen voor 20 sec 9. Zodra keelholte pompen wordt gescoord, kies de worm van de plaat.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
1. Vertraging in de ontwikkeling / dodelijkheid testresultaat
Een typisch resultaat voor ontwikkelingsvertraging / letaliteit test wordt aangetoond in figuren 1a en 1b. Wanneer wildtype dieren in de controlegroep zijn uitgegroeid tot de zwangere volwassen stadium (figuur 1a), wildtype dieren blootgesteld aan clozapine nog in de jonge larvale stadia of dood (Figuur 1b). Figuur 1c toont een representatief resultaat vergeleken een suppressor mutant (Mut1) en een versterker mutant (Mut2) met de wild-type op drie verschillende clozapine concentraties. Op alle drie de clozapine concentraties, de dodelijkheid van Mut1 is lager dan wild-type en de dodelijkheid van Mut2 hoger is. Overleven Mut1 dieren ontwikkelen tot meer geavanceerde larvale stadia dan wild-type, terwijl de overlevende Mut2 dieren weer vertraging in de ontwikkeling in vergelijking met wild-type. </ P>
2. Keelholte pompsnelheid testresultaat
Figuur 2 toont een representatieve keelholte pompen testresultaat vergelijken van een suppressor mutant (Mut1) en een versterker mutant (Mut2) met het wildtype op twee clozapine concentraties. Clozapine blootstelling vermindert de faryngeale pompsnelheden van het wild-type en mutante stammen in een concentratie-afhankelijke wijze. Echter, de verminderde pharynx pompsnelheid van Mut1 is dan die van het wildtype, terwijl de verminderde pharynx pompsnelheid van Mut2 is groter dan die van het wildtype.
Figuur 1. Demonstratie van clozapine veroorzaakte vertraging in de ontwikkeling en dodelijkheid. Wildtype dieren (N2) zijn gekweekt op een controle NGM plaat (a) en op NGM plaat gesupplementeerd met 200 ug / ml (612 pM) clozapine (b). (C) Een vertegenwoordiger gevolg van de vertraging in de ontwikkeling / dodelijkheid test blijkt effect clozapine op de wild-type (N2), een suppressor mutant (Mut1), en een versterker mutant (Mut2). De afbeeldingen in (a) en (b) worden afgedrukt < http://www.nature.com/npp/journal/v34/n8/full/npp200935a.html > van Neuropsychopharmacology. 34 (8), 1968-1978 (Juli , 2009). Klik hier voor grotere afbeelding .
ig1.jpg "width =" 600px "/>
Figuur 2. Demonstratie van clozapine geïnduceerde remming van pharynx pompen. Een typisch resultaat van de faryngeale pompen test blijkt effect clozapine op het wildtype (N2), een suppressor mutant (Mut1), en een versterker mutant (Mut2). De gegevens werden geanalyseerd met twee-weg ANOVA met behulp van de statistische software programma R. Klik hier voor grotere afbeelding .
Tabel 1. Bereiding werkoplossing van clozapine. Het bedrag van 4 putjes bij elke concentratie.
| Clozapine concentratie | 0 uM | 300 uM | 400 uM | 500 uM |
|---|---|---|---|---|
| HAC oplossing | 270 pl | 270 pl | 270 pl | 270 pl |
| Clozapine stockoplossing | - | 30 gl | 40 gl | 50 gl |
| DMSO | 50 gl | 20 gl | 10 gl | 0 pi |
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
We beschrijven hier werkwijzen voor het testen van de effecten van APD op de ontwikkeling en het gedrag van C. elegans. DMSO of ethanol wordt gebruikt clozapine lossen, omdat het geneesmiddel relatief onoplosbaar in water. Omdat oplosmiddelen gemeld beïnvloeden C. elegans biologie 12, DMSO-alleen of ethanol-alone controlegroepen essentieel. De hoogste concentratie van DMSO in onze testen is aan 3%, die geen duidelijk effect op C. heeft elegans ontwikkeling. DMSO kan worden gebruikt voor vele kleine moleculen, of zelfs grote moleculen, zoals lipiden zuren.
APD concentraties die in deze testen zijn hoger dan die voor de mens. Dit is gebruikelijk voor de meeste kleine moleculen studies C. elegans, aangezien hoge concentraties nodig zijn voor penetratie van de C. elegans cuticula. HPLC werd vastgesteld dat de niveaus van clozapine in C. elegans weefsel in de ontwikkelings ASSAy liggen dicht bij die verwacht worden bij menselijke hersenen 2.
Penetratie van de cuticula is een bijzondere zorg voor studies van grote moleculen. Mutanten met defecten in de cuticula barrière, zoals acs-20 mutanten en Bus (B acterially U n-S wollen) mutanten, bieden een aanpak van dit probleem te omzeilen 13. Bus mutanten werden geïsoleerd op basis van hun resistentie tegen infectie door het pathogeen Microbacterium nematophilum. Bijvoorbeeld zwakke allelen van bus 8 tonen aan dat dit gen een rol speelt bij de productie van de cuticula oppervlak. Deze mutanten resistent tegen infectie, omdat de bacterie niet kan binden aan het ontvangende oppervlak. Belangrijk, verstoring van de cuticula vorming veroorzaakt ook verhoogde drug gevoeligheid in deze genetische achtergrond 14.
De ontwikkelingsdoelen test hier beschreven kan worden opgeschaald voor grootschalige genetische screens door het uitvoeren van de test in vloeibare culture. Voor genoom-brede RNA interferentie (RNAi) schermen, bijvoorbeeld het protocol overeenkomstig aan die boven beschreven, maar terwijl RNAi bacteriën vervangen OP50 bacteriën 15. De vloeibare cultuur test vereist een lagere concentratie van het geneesmiddel dan de plaat assay (ongepubliceerd observatie). Ons laboratorium uitgevoerd zo'n genoom-brede RNAi scherm onderdrukkers van clozapine veroorzaakte vertraging in de ontwikkeling en verkregen 40 onderdrukkers uit een scherm van ~ 17.000 C. elegans genen 8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat er geen rente conflict betrokken.
Acknowledgments
Het werk werd ondersteund door een NIH Clinical Scientist Development award K08NS002083, een Shervert Frazier Research Institute Grant, en een NARSAD Young Investigator Award aan Edgar A. Buttner.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Clozapine | Sigma | C6305 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | D8418 | |
| Acetic acid (HAC) | Fisher | BP2401 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | EMD | SX0590-13 | |
| Hypochlorite | Sigma-Aldrich | 425044 | |
| Centrifuge 5810 | Eppendorf | 5810 000.017 | |
| Incubator shaker | New Brunswick Scientific | M1246-0006 | |
| Low temperature incubator 815 | Precision Scientific | J1790-1B | |
| Stereomicroscope | Olympus | SZX12 | |
| Petri dish 35 x 10 mm | Fisher Scientific | NC9434271 | |
| 12-well Tissue culture plate | BD Falcon | REF 353043 |
References
- Donohoe, D. R., Jarvis, R. A., Weeks, K., Aamodt, E. J., Dwyer, D. S. Behavioral adaptation in C. elegans produced by antipsychotic drugs requires serotonin and is associated with calcium signaling and calcineurin inhibition. Neurosci. Res. 64, 280-289 (2009).
- Karmacharya, R., et al. Clozapine interaction with phosphatidyl inositol 3-kinase (PI3K)/insulin-signaling pathway in Caenorhabditis elegans. Neuropsychopharmacology. 34, 1968-1978 (2009).
- Rand, J. B., Johnson, C. D. Carnorhabditis elegans Modern Biological Analysis of an Organism. Estein, H. F., Shakes, D. C. 48, Academic Press, Inc.. 187-204 (1995).
- Kwok, T. C., et al. A small-molecule screen in C. elegans yields a new calcium channel antagonist. Nature. 441, 91-95 (2006).
- Wang, X., Sliwoski, G. R., Buttner, E. A. The relevance of Caenorhabditis elegans genetics for understanding human psychiatric disease. Harv. Rev. Psychiatry. 19, 210-218 (2011).
- Donohoe, D. R., Aamodt, E. J., Osborn, E., Dwyer, D. S. Antipsychotic drugs disrupt normal development in Caenorhabditis elegans via additional mechanisms besides dopamine and serotonin receptors. Pharmacol. Res. 54, 361-372 (2006).
- Karmacharya, R., et al. Behavioral effects of clozapine: involvement of trace amine pathways in C. elegans and M. musculus. Brain Res. 1393, 91-99 (2011).
- Saur, T., et al. A Genome-Wide RNAi Screen in Caenorhabditis elegans Identifies the Nicotinic Acetylcholine Receptor Subunit ACR-7 as an Antipsychotic Drug Target. PLoS Genet. 9, (2013).
- Avery, L., You, Y. J. C. elegans feeding. WormBook, ed. The C. elegans Research Community, doi:10.1895/wormbook.1.150.1. , Available from: http://www.wormbook.org (2012).
- Chaudhuri, J., Parihar, M., Pires-daSilva, A. An introduction to worm lab: from culturing worms to mutagenesis. J Vis Exp. 47, (2011).
- Lewis, J. A., Fleming, J. T. Carnorhabditis elegans Modern Biological Analysis of an Organism. Estein, H. F., Shakes, D. C. 48, Academic Press, Inc.. 3-29 (1995).
- Davis, J. R., Li, Y., Rankin, C. H. Effects of developmental exposure to ethanol on Caenorhabditis elegans. Alcohol Clin. Exp. Res. 32, 853-867 (2008).
- Kage-Nakadai, E., et al. Two very long chain fatty acid acyl-CoA synthetase genes, acs-20 and acs-22, have roles in the cuticle surface barrier in Caenorhabditis elegans. PLoS One. 5, (2010).
- Partridge, F. A., Tearle, A. W., Gravato-Nobre, M. J., Schafer, W. R., Hodgkin, J. The C. elegans glycosyltransferase BUS-8 has two distinct and essential roles in epidermal morphogenesis. Dev. Biol. 317, 549-559 (2008).
- Leung, C. K., Deonarine, A., Strange, K., Choe, K. P. High-throughput screening and biosensing with fluorescent C. elegans strains. J. Vis. Exp. (51), (2011).
