Summary
Подходы к тестирования эффектов антипсихотических препаратов (APDS) в Caenorhabditis Элеганс демонстрируются. Анализы описаны для тестирования лекарственные эффекты на развитие и жизнеспособность и на скорости накачки глотки. Эти методы также применимы для экспериментов с фармакогенетических классов лекарственных средств, отличных от ЛФД.
Abstract
Caenorhabditis Элеганс простой генетический организм поддаются крупномасштабных вперед и назад генетические экраны и химические генетические экраны. С. Элеганс геном включает потенциальную антипсихотические препараты (APD) Цели консервативные у людей, в том числе генов, кодирующих белки, необходимые для синтеза нейромедиаторов и синаптической структуры и функции. Воздействие APD производит задержку и / или летальность в нематод с развитием в зависимости от концентрации. Эти фенотипы обусловлены, в частности, путем APD-индуцированного ингибирования глотки насосного 1,2. Таким образом, фенотип развития имеет нервно-мышечную основу, что делает его полезным для фармакогенетических исследований нейролептиков. Здесь мы показываем, подробные процедуры тестирования APD воздействие на развитие нематоды и глотки накачки. Для анализа развития, синхронизированные эмбрионы помещают на нематод роста среды (NGM) пластин, содержащие APDS, и этапах разработки Анинормалей затем забил в день. Для скорости накачки глотки анализа, устроили молодые взрослые животные были протестированы на NGM пластин, содержащих APDS. Количество глотки насосов в единицу времени записывается, и скорость накачки рассчитывается. Эти анализы могут быть использованы для изучения многие другие типы малых молекул или даже больших молекул.
Introduction
Caenorhabditis Элеганс простой генетический организм поддаются крупномасштабных прямой и обратной генетических экранов и химических генетических экранов. С. Элеганс чувствителен к широкому спектру биологически активных соединений, и поэтому успешно применяется для определения механизмов действия различных таких соединений. Например, биологически активных соединений изучены с помощью червя фармакогенетика включают агонисты рецептора ацетилхолина (например левамизол, никотина, морантел и Пирантела), анестетики (например, галотан), кофеин, ингибиторы холинэстеразы (например алдикарб, lannate и трихлорфон), фторид, ГАМК-связанных соединения (например ГАМК и мусцимол), ивермектин, паракват, форбол сложные эфиры и серотонина, связанных препараты (например, серотонина и imiprimine) 3. Кроме того, С. Элеганс был использован для крупномасштабных экранов небольшой молекулы, что позволяет открытие нового биологически активного соединенияс и выявление новых генетических мишеней 4.
С. Элеганс геном включает потенциальную антипсихотические препараты (APD) Цели консервативные у людей, в том числе генов, кодирующих белки, необходимые для синтеза нейромедиаторов и синаптической структуры и функции 5. Таким образом, С. Элеганс нейрогенетики и методы нейробиологии предложение для обнаружения новых молекулярных механизмов действия ЛФД. У нематод, экспозиция APD на ранних стадиях развития производит задержку развития и при более высоких концентрациях, летальность 2,6. Воздействие APD во взрослом возрасте вызывает поведенческие фенотипы. Например, клозапин воздействие подавляет передвижение и глотки накачку и повышает яйценоскость 1,2,7.
APD-индуцированной задержка развития и летальность являются мощными фенотипы для крупномасштабных химических генетических экранов. Эти фенотипы комплекс в той мере, они, вероятно, имеют более одного клеточные и генетические Basiс. Поэтому такие генетические экраны ожидается выход разнообразные косвенные лекарственных препаратов. Тем не менее, наша лаборатория провела генов-кандидатов экраны и экран RNAi генома для гасителей APD-индуцированной задержки развития и летальности и успешно восстановлены гены, которые, вероятно, кодируют прямые цели, в том числе дофамина, инсулин и никотиновых рецепторов ацетилхолина 2,8. Генетические экраны на основе APD-индуцированных поведения у взрослых, также привели к идентификации новых мишеней APD, и мы теперь проверки цели из обоих развития и поведения экранов у млекопитающих 7. Таким образом, беспозвоночных химические генетический подход, чтобы обнаружить новые молекулярные механизмы действия ЛФД представляется, возможно 5,8.
С. Элеганс глотки является органом, который включает в себя 20 нейронов, 20 мышечных клеток, и 20 вспомогательных клеток, завернутые базальной мембраной. Как и в сердца млекопитающих, глотки является автономнымй постоянно насосы еду в из внешней среды 9. Ингибирование скорости насосного глотки компромиссы поглощение пищи, и, таким образом мутации или препараты, которые подавляют глотки насосную причиной задержки развития или ареста 9. ЛФД ингибирования скорости глотки насосную, что составляет в части для их влияний на развитие и жизнеспособность 1,2. Здесь мы используем атипичной APD клозапин в качестве примера для демонстрации анализы наркотиков для развития нематод и глотки накачки.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Задержка развития / Летальность Анализ: дикого типа (N2) и два Мутант (Mut1 и Mut2) штаммы были испытаны в трех клозапин концентраций в 12-луночный планшет
- В день 1, заливают 2 мл NGM среды 10 в каждую лунку 12-луночного планшета (каждую лунку с диаметром 2 см) и позволяют затвердеть на скамье при комнатной температуре (RT) в течение ночи. В тот же день, выберите колонию кишечной палочки OP50 бактерий, заразить бутылку 50 мл раствора LB, и культура его в шейкере 37 ° C при 220 вращения оборотов в минуту в течение ночи.
- В день 2, передать 20 мкл OP50 бактериальной культуры на центр каждого NGM скважины. Инкубируйте пластин в инкубаторе 37 ° C или оставить их при комнатной температуре в течение ночи, чтобы позволить бактериальная газон расти толще.
- Сделать 80 мм клозапин маточного раствора путем растворения клозапин в ДМСО (диметилсульфоксид) растворителя. Тогда сделать рабочий раствор 80 мкл с маточного раствора, разведенного в 1,7 мл уксусной кислоты BAsed в таблице 1.
Примечание: Рабочий раствор для конкретного препарата интереса должно быть определено, делая серию предварительных испытаний концентрации, чтобы найти наиболее соответствующую концентрацию для различения дикого типа от мутантов. - Передача 80 мкл клозапин рабочего раствора на затравку, NGM пластины хорошо и вращать пластинку, чтобы решение равномерно распределить на поверхности. Подождите, пока пластина для просушки. Используйте пластины для анализа в тот же день или поместить его в 20 ° С инкубатор, который будет использоваться на следующий день.
Примечание: Рабочий раствор представляет собой суспензию препарат из-за низкой растворимости клозапин, особенно при высокой концентрации. Таким образом, вихревой трубки перед передачей решение пластины наркотиков для того, чтобы гарантировать, что концентрация лекарственного средства является точной. - Вымойте червей от 3,5 см пластину, содержащую много беременных взрослых с М9 буфера и затем спина их в 15 мл трубкив 2000 оборотах в минуту в течение 1 мин.
- Аспирируйте супернатант. Добавьте 5 мл раствор отбеливателя (NaOH: гипохлорит: DDH 2 O в 4:01:05) и нарушить нематод, аккуратно переворачивая пробирки.
- Соблюдайте животных, пока половина из них не растворяются в пределах 5 мин. Спин вниз яйца в 2000 оборотах в минуту в течение 1 мин.
- Аспирируйте супернатант и добавить 14 мл M9 буфер быстро.
- Спин вниз яйца в 2000 оборотах в минуту в течение 1 мин и аспирации супернатант, оставляя приблизительно 100 мкл раствора. Vortex приостановить яйца.
- Передача 2 мкл яйца приостановлено в M9 на регулярной NGM пластины для проверки, сколько яйцеклетки переносятся. Регулировка громкости взвешенных яиц, чтобы обеспечить, что Есть около 30-35 яиц в каждой передаче. Передача 30-35 яиц в каждую лунку аналитического планшета, а затем инкубируют в инкубаторе при 20 ° C в течение 24 часов.
- На первом день анализа, оценка количества яиц вылупились. Регулировка общее количество заштрихованных животных 25/well по Pickiнг лишние червей, если это необходимо.
- В последующие дни, наблюдать за животными и забить им каждые 24 ч. Этап развития оценивается в зависимости от размера животного и формы вульвы 11. Эксперимент длится 5-6 дней с самой надежной эффекта обычно увидеть на третий или четвертый день.
- Входной данные в файл Excel и вычислить процент животных на каждом этапе развития для каждого день эксперимента. Генерация графики с функцией '100% Гистограмма с накоплением 'в '2-D колонке "меню.
2. Фарингальный Насосная Анализ: Young Adult Животные для дикого типа и мутантных штаммов оцениваются по клозапин Планшеты
- Аналитический планшет выполнен по той же протокол, используемый для развития задержки / летальность анализа.
- Возьмите 50 L4 животных для каждого штамма к сеяных NGM пластин 24 часа в сутки до анализа и инкубировать червей при 20 ° С.
- Возьмите 10 животных к Ассау пластины хорошо. Затем выберите 10 животных на следующий же каждый 15-20 мин.
- После того, как животные в первой скважины были подвержены препарата в течение 30 мин, начали проводить анализ, наблюдая глотки накачку под микроскопом рассечение и забивать насосы на 20 сек 9. После глотки накачки забил, выбрать червя от пластины.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
1. Задержка развития / летальность результат анализа
Типичный результат для развития задержки / летальность анализа показано в фигурах 1a и 1b. Когда дикого типа животных в контрольной группе выросли до беременной взрослой стадии (рис. 1а), дикого типа животных, подвергшихся воздействию клозапин еще в молодых личиночной стадии или мертвы (рис. 1b). Рисунок 1в показывает характерный результат сравнения супрессор мутант (Mut1) и энхансер мутант (Mut2) с диким типом при трех различных концентрациях клозапин. На всех трех клозапин концентрациях, летальность Mut1 ниже, чем дикого типа и летальность Mut2 гораздо выше. Выжившие Mut1 животные прогрессировать до более продвинутых личиночной стадии, чем дикого типа, в то время как оставшиеся в живых Mut2 животные отображения задержку развития сравнению с диким типом. </ Р>
2. Скорость Фарингальный насосная результат анализа
На фиг.2 показан репрезентативный глотки насосную результат анализа сравнения супрессор мутант (Mut1) и энхансер (мутант) Mut2 с диким типом при двух концентраций клозапина. Воздействие клозапин снижает глотки скоростей перекачивания штаммов дикого типа и мутантных в зависимости от концентрации. Тем не менее, уменьшилась глотки скорость откачки Mut1 меньше, чем у дикого типа, при этом снизилась глотки скорость откачки Mut2 больше, чем у дикого типа.
Рисунок 1. Демонстрация клозапин, вызванной задержкой развития и летальности. Животных дикого типа (N2), выращенных на контроль NGM пластины (а) и на NGM пластины с добавлением 200 мкг / мл (612 мкМ) клозапин (б). (С) представитель результатом развития задержки / летальность анализа, показывая эффект клозапин по дикого типа (N2), супрессоров мутанта (Mut1), и усиливающего мутанта (Mut2). Изображения в (а) и (б) перепечатано < http://www.nature.com/npp/journal/v34/n8/full/npp200935a.html > от Нейропсихофармакологии. 34 (8), 1968-1978 (июль , 2009). Кликните здесь, чтобы посмотреть увеличенное изображение .
ig1.jpg "ширина =" 600px "/>
Рисунок 2. Демонстрация клозапин, вызванной торможением глотки накачки. Типичный результат для глотки насосной анализа, показывая эффект клозапин по дикого типа (N2), супрессоров мутанта (Mut1), и усиливающего мутанта (Mut2). Данные были проанализированы с двусторонним ANOVA с использованием статистического программного обеспечения программы Р. Нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенное изображение .
Таблица 1. Подготовка рабочего раствора клозапин. Эта сумма в течение 4 скважин при каждой концентрации.
| Концентрация клозапин | 0 мкМ | 300 мкМ | 400 мкм | 500 мкм |
|---|---|---|---|---|
| Решение ВАК | 270 мкл | 270 мкл | 270 мкл | 270 мкл |
| Клозапин раствор | - | 30 мкл | 40 мкл | 50 мкл |
| ДМСО | 50 мкл | 20 мкл | 10 мкл | 0 мкл |
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Здесь мы описываем методы тестирования эффектов ЛФД на развитие и поведение С. Элеганс. ДМСО или этаноле используют для растворения клозапин, так как препарат является относительно нерастворимым в воде. Поскольку растворители, как сообщается, повлияет C. Элеганс биологии 12, ДМСО-отдельно или этанол-один контрольные группы имеют важное значение. Самая высокая концентрация ДМСО используется в наших тестах до 3%, что не имеет очевидное влияние на С. Элеганс развития. ДМСО может быть использован для многих малых молекул, или даже некоторые крупные молекулы, например липидных кислот.
Концентрации APD, используемые в этих анализах выше, чем дано для человека. Это характерно для большинства небольших исследований молекул в С. Элеганс, так как высокие концентрации необходимы для проникновения С. Элеганс кутикулу. ВЭЖХ исследования показывают, что уровни клозапина в С. Элеганс ткани в Асса развитияу близки к тем, которые ожидаются в мозгах человека 2.
Проникновение кутикулы вызывает особую озабоченность для изучения крупных молекул. Мутанты с дефектами в кутикулы барьера, таких как ACS-20 мутантов и шины (B acterially U н-S Wollen) мутантов, предложить один подход, чтобы обойти эту проблему 13. Автобусные мутанты были выделены на основании их устойчивости к инфекции патогена Microbacterium nematophilum. Например, слабые аллели шины-8 показывают, что этот ген играет роль в производстве поверхности кутикулы. Эти мутанты устойчивы к инфекции, потому что бактерия не может связываться с принимающей поверхности. Важно отметить, что нарушение формирования кутикулы также приводит к увеличению чувствительности к лекарству в этом генетическом фоне 14.
Анализ развития описано здесь можно масштабировать до крупномасштабных генетических экранов на проведения анализа в жидком Cultuчисло рейнольдса Для генома РНК-интерференции (RNAi) экранов, например, протокол аналогичен тому, который описан выше, но питающие RNAi бактерии замещен на OP50 бактерий 15. Жидкость анализ культура требует более низкой концентрации лекарственного средства, чем планшете (неопубликованные наблюдения). Наша лаборатория выполняется такой экран RNAi генома для гасителей клозапин, вызванной задержкой развития и получил 40 ограничителей от экрана ~ 17000 С. Элеганс гены 8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют, что нет конфликта интересов участников.
Acknowledgments
Работа была поддержана NIH Клинический награждения развития науки K08NS002083, грант Shervert Фрейзер научно-исследовательский институт, и NARSAD премия для молодых следователь к Эдгара А. Buttner.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Clozapine | Sigma | C6305 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | D8418 | |
| Acetic acid (HAC) | Fisher | BP2401 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | EMD | SX0590-13 | |
| Hypochlorite | Sigma-Aldrich | 425044 | |
| Centrifuge 5810 | Eppendorf | 5810 000.017 | |
| Incubator shaker | New Brunswick Scientific | M1246-0006 | |
| Low temperature incubator 815 | Precision Scientific | J1790-1B | |
| Stereomicroscope | Olympus | SZX12 | |
| Petri dish 35 x 10 mm | Fisher Scientific | NC9434271 | |
| 12-well Tissue culture plate | BD Falcon | REF 353043 |
References
- Donohoe, D. R., Jarvis, R. A., Weeks, K., Aamodt, E. J., Dwyer, D. S. Behavioral adaptation in C. elegans produced by antipsychotic drugs requires serotonin and is associated with calcium signaling and calcineurin inhibition. Neurosci. Res. 64, 280-289 (2009).
- Karmacharya, R., et al. Clozapine interaction with phosphatidyl inositol 3-kinase (PI3K)/insulin-signaling pathway in Caenorhabditis elegans. Neuropsychopharmacology. 34, 1968-1978 (2009).
- Rand, J. B., Johnson, C. D. Carnorhabditis elegans Modern Biological Analysis of an Organism. Estein, H. F., Shakes, D. C. 48, Academic Press, Inc.. 187-204 (1995).
- Kwok, T. C., et al. A small-molecule screen in C. elegans yields a new calcium channel antagonist. Nature. 441, 91-95 (2006).
- Wang, X., Sliwoski, G. R., Buttner, E. A. The relevance of Caenorhabditis elegans genetics for understanding human psychiatric disease. Harv. Rev. Psychiatry. 19, 210-218 (2011).
- Donohoe, D. R., Aamodt, E. J., Osborn, E., Dwyer, D. S. Antipsychotic drugs disrupt normal development in Caenorhabditis elegans via additional mechanisms besides dopamine and serotonin receptors. Pharmacol. Res. 54, 361-372 (2006).
- Karmacharya, R., et al. Behavioral effects of clozapine: involvement of trace amine pathways in C. elegans and M. musculus. Brain Res. 1393, 91-99 (2011).
- Saur, T., et al. A Genome-Wide RNAi Screen in Caenorhabditis elegans Identifies the Nicotinic Acetylcholine Receptor Subunit ACR-7 as an Antipsychotic Drug Target. PLoS Genet. 9, (2013).
- Avery, L., You, Y. J. C. elegans feeding. WormBook, ed. The C. elegans Research Community, doi:10.1895/wormbook.1.150.1. , Available from: http://www.wormbook.org (2012).
- Chaudhuri, J., Parihar, M., Pires-daSilva, A. An introduction to worm lab: from culturing worms to mutagenesis. J Vis Exp. 47, (2011).
- Lewis, J. A., Fleming, J. T. Carnorhabditis elegans Modern Biological Analysis of an Organism. Estein, H. F., Shakes, D. C. 48, Academic Press, Inc.. 3-29 (1995).
- Davis, J. R., Li, Y., Rankin, C. H. Effects of developmental exposure to ethanol on Caenorhabditis elegans. Alcohol Clin. Exp. Res. 32, 853-867 (2008).
- Kage-Nakadai, E., et al. Two very long chain fatty acid acyl-CoA synthetase genes, acs-20 and acs-22, have roles in the cuticle surface barrier in Caenorhabditis elegans. PLoS One. 5, (2010).
- Partridge, F. A., Tearle, A. W., Gravato-Nobre, M. J., Schafer, W. R., Hodgkin, J. The C. elegans glycosyltransferase BUS-8 has two distinct and essential roles in epidermal morphogenesis. Dev. Biol. 317, 549-559 (2008).
- Leung, C. K., Deonarine, A., Strange, K., Choe, K. P. High-throughput screening and biosensing with fluorescent C. elegans strains. J. Vis. Exp. (51), (2011).
