Summary
Ansätze zum Testen der Wirkung von Neuroleptika (APD) in Caenorhabditis elegans gezeigt werden. Die Tests werden für die Prüfung Arzneimittelwirkungen auf die Entwicklung und Lebensfähigkeit und Rachenpumprate beschrieben. Diese Methoden sind auch für pharmakogenetische Versuche mit anderen als APDs Medikamentenklassen.
Abstract
Caenorhabditis elegans ist eine einfache genetische Organismus zugänglich Groß Vorwärts-und Rückwärts genetischen Screens und chemisch-genetischen Bildschirme. Die C. elegans Genom umfasst mögliche Antipsychotikum (APD) Ziele im Menschen konserviert, einschließlich der Gene, die Proteine für die Neurotransmitter-Synthese und für die synaptische Struktur und Funktion erforderlich kodiert. APD Exposition produziert Entwicklungsverzögerung und / oder Letalität bei Nematoden in einer konzentrationsabhängigen Weise. Diese Phänotypen verursacht, teilweise durch die APD-induzierte Hemmung der Rachenpump 1,2. Somit hat die Entwicklungs Phänotyp eine neuromuskuläre Basis, so dass es nützlich pharmakogenetische Studien von Neuroleptika. Hier zeigen wir detaillierte Verfahren für die Prüfung APD Auswirkungen auf die Nematodenentwicklung und Rachen Pumpen. Für die Entwicklungs-Assay werden synchronisiert Embryonen auf Nematoden-Wachstumsmedium (NGM)-Platten, die APD, und die Stadien der Entwicklung ani platziertmals werden dann täglich erzielt. Für die Rachenpumprate-Test, inszenierte junge Tiere werden auf NGM-Platten mit APDs getestet. Die Anzahl der Pharynx Pumpen pro Zeiteinheit aufgezeichnet werden, und die Pumpgeschwindigkeit wird berechnet. Diese Assays können zur Untersuchung von vielen anderen Arten von kleinen Molekülen oder sogar großen Molekülen verwendet werden.
Introduction
Caenorhabditis elegans ist eine einfache genetische Organismus zugänglich Groß Vorwärts-und Rückwärts genetischen Screens und chemisch-genetischen Bildschirme. C elegans ist gegenüber einem breiten Spektrum von biologisch aktiven Verbindungen und ist daher nicht erfolgreich verwendet worden, um die Mechanismen der Wirkung von einer Vielzahl von solchen Verbindungen zu definieren. Zum Beispiel mit Schnecken Pharmakogenetik gehören Acetylcholin-Rezeptor-Agonisten (zB Levamisol, Nikotin, Morantel und Pyrantel), Anästhetika (zB Halothan), Koffein, Cholinesterase-Inhibitoren (z. B. Aldicarb, Lannate und Trichlorfon), Fluorid, GABA-verwandten studierte bioaktiven Verbindungen Verbindungen (z. B. GABA und Muscimol), Ivermectin, Paraquat, Phorbolester und Serotonin-bezogene Medikamente (z. B. Serotonin und imiprimine) 3. Außerdem C. elegans hat für große Bildschirme kleines Molekül verwendet worden, so dass Entdeckung von neuen bioaktiven Verbindungs und Identifizierung neuer genetischer Ziele 4.
Die C. elegans Genom umfasst mögliche Antipsychotikum (APD) Ziele im Menschen konserviert, einschließlich der Gene, die Proteine für die Neurotransmitter-Synthese und für die synaptische Struktur und Funktion 5 erforderlich kodiert. So, C. elegans Neurogenetik und Neurobiologie bieten Methoden für die Entdeckung neuer molekularer Wirkmechanismen von APDs. In Nematoden, APD Exposition früh in der Entwicklung produziert Entwicklungsverzögerung, und bei höheren Konzentrationen, Letalität 2,6. APD Exposition im Erwachsenenalter produziert Verhaltens Phänotypen. Zum Beispiel hemmt Clozapin Exposition Fortbewegung und Rachenpump und verbessert Eiablage 1,2,7.
APD-induzierten Entwicklungsverzögerung und Letalität sind starke Phänotypen für Groß chemisch-genetischen Bildschirme. Diese Phänotypen sind komplex, soweit sie wahrscheinlich mehr als einen zellulären und genetischen basis. Daher werden solche genetischen Bildschirme erwartet, dass eine Vielzahl von indirekten Wirkstoffziele ergeben. Allerdings hat unser Labor Kandidaten-Gen-Bildschirme und eine genomweite RNAi-Bildschirm für die Unterdrücker der APD-induzierten Entwicklungsverzögerung und Letalität durchgeführt und erfolgreich wiederhergestellt Gene, die wahrscheinlich zu kodieren direkte Ziele, einschließlich Dopamin, Insulin und Nikotinsäure Acetylcholin-Rezeptoren 2,8. Genetische Screens auf der Grundlage APD-induzierte Verhalten beim Erwachsenen haben auch die Identifizierung neuer APD Ziele führte, und wir jetzt Validierung von Targets sowohl Entwicklungs-und Verhaltens Bildschirme in Säugetieren 7. So scheint, ein wirbel chemisch-genetischen Ansatz für neuartige molekulare Wirkmechanismen von APDs entdecken machbar 5,8 sein.
Die C. elegans Rachen ist ein Organ, 20 Neuronen, Muskelzellen, 20, 20 und akzessorischen Zellen durch eine Basalmembran gewickelt enthält. Ähnlich wie bei der Säugetier-Herz, ist der Rachen eine autonomend Pumpen ständig Essen in von der äußeren Umgebung 9. Die Hemmung der Rachenpumprate beeinträchtigt Nahrungsaufnahme und damit Mutationen oder Medikamente, die Rachenpump Ursache Entwicklungsverzögerung hemmen oder zu verhaften 9. APDs hemmen die Rachenpumprate Anteil zum Teil auf ihre Auswirkungen auf die Entwicklung und Lebensfähigkeit 1,2. Hier verwenden wir die atypische APD Clozapin als Beispiel für Drogentests zur Nematodenentwicklung und Rachenpump demonstrieren.
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Protocol
1. Entwicklungsverzögerung / Letalität Assay: Die Wildtyp-(N2) und Zwei Mutant (Mut1 und Mut2) Die Stämme werden in drei Clozapin Konzentrationen in einer 12-Well-Platte getestet
- (Jeweils auch mit einem 2 cm Durchmesser) Am Tag 1 pour 2 ml NGM Medium 10 in jede Vertiefung einer 12-Well-Platte und lassen auf der Bank bei Raumtemperatur (RT) über Nacht aushärten. Am selben Tag, wählen Sie eine Kolonie von Escherichia coli OP50 Bakterien infizieren, eine Flasche von 50 ml LB-Lösung und Kultur, die sie in einem 37 ° C-Schüttler bei 220 rpm Dreh Übernachtung.
- Am Tag 2 Transfer 20 ul OP50 Bakterienkultur auf die Mitte jeder NGM auch. Die Inkubation in einem 37 ° C-Inkubator oder lassen Sie sie über Nacht bei RT, damit der Bakterienrasen dicker zu wachsen.
- Machen Sie eine 80 mM Stammlösung Clozapin durch Auflösen von Clozapin in DMSO (Dimethylsulfoxid) Lösungsmittel. Dann machen Sie eine 80-ul-Arbeitslösung mit der Stammlösung in 1,7 mM Essigsäure verdünnt bin Tabelle 1 ased.
Hinweis: Die Arbeitslösung für ein bestimmtes Medikament von Interesse sind, indem Sie eine Reihe von vorläufigen Konzentrationstests, um die am besten geeignete Konzentration für die Unterscheidung der Wildtyp von den Mutanten zu finden bestimmt werden. - Über 80 ul Clozapin Arbeitslösung auf die Platte ausgesät NGM gut und wirbeln die Platte, damit die Lösung gleichmäßig auf der Oberfläche verteilen. Warten Sie, bis die Platte zu trocknen. Verwenden Sie die Platte für den Test am gleichen Tag oder legen Sie sie in einem 20 ° C-Inkubator, am nächsten Tag verwendet werden.
Hinweis: Die Arbeitslösung ist eine Wirkstoffsuspension aufgrund der geringen Löslichkeit von Clozapin, insbesondere bei höheren Konzentration. Daher vortexen Rohr vor der Lösung in der Medikamentenplatte, um zu gewährleisten, dass die Wirkstoffkonzentration genau ist. - Waschen Würmer aus einem 3,5 cm-Platte mit vielen schwangeren Erwachsenen mit M9-Puffer und dann drehen sie in einem 15-ml-Tubebei 2000 Upm für 1 min.
- Saugen Sie den Überstand. 5 ml Bleichlösung (NaOH: Hypochlorit: ddH 2 O bei 4.01.05) und stören die Nematoden durch vorsichtiges Umdrehen der Rohre.
- Beachten Sie die Tiere, bis die Hälfte von ihnen sind mit rund 5 min gelöst. Spin down die Eier bei 2.000 rpm für 1 min.
- Saugen Sie den Überstand und fügen Sie 14 ml M9-Puffer schnell.
- Spin down die Eier bei 2.000 rpm für 1 min und saugen Sie den Überstand, so dass etwa 100 ul Lösung. Vortex, um die Eier zu suspendieren.
- Transfer 2 ul Eier in M9 aufgehängt auf einer regulären NGM Platte zu testen, wie viele Eier übertragen werden. Stellen Sie die Lautstärke der suspendierten Eier, um sicherzustellen, dass es etwa 30 bis 35 Eier in jeder Übertragung. Übertragen 30-35 Eier in jede Vertiefung der Testplatte, und dann in einem 20 ° C-Inkubator inkubiert für 24 Stunden.
- Am ersten Tag des Tests, Note die Anzahl der Eier geschlüpft. Stellen Sie die Gesamtzahl der Tiere, die von schraffierten Picki 25/wellng von den zusätzlichen Würmer, wenn nötig.
- An den folgenden Tagen, die Tiere zu beobachten und Gäste sie alle 24 Stunden. Entwicklungsstufe wird basierend auf der Größe des Tieres und der Form der Vulva 11 erzielt. Der Versuch dauert 5-6 Tage mit den robusten Effekt in der Regel am dritten oder vierten Tag gesehen.
- Eingabe der Daten in eine Excel-Datei und berechnen Sie den Prozentsatz der Tiere in jeder Entwicklungsstufe für jeden Tag des Experiments. Erzeugung von Diagrammen mit der Funktion '100% Gestapelte Säule "in der Spalte '2-D"-Menü.
2. Rachen-Pumping Assay: Junger Erwachsener Tiere für den Wildtyp-und Mutanten-Stämme sind auf Clozapin Assay-Platten Partitur
- Die Testplatte wird nach dem gleichen Protokoll für die Entwicklungsverzögerung / Letalität Assay verwendet werden.
- Wählen L4 50 Tieren für jeden Stamm auf NGM-Platten ausgesät 24 Stunden vor dem Test und bebrüten die Würmer bei 20 ° C
- Wählen Sie 10 Tiere zu einem assay Well-Platte. Dann wählen Sie 10 Tiere auf den nächsten gut, alle 15-20 min.
- Nachdem die Tiere in der ersten und haben den Drogen für 30 Minuten ausgesetzt wurde, starten Sie den Test durch Beobachtung Rachenpump unter einem Dissektionsmikroskop und Gäste die Pumpen für 20 sec 9. Sobald Rachenpump erzielt wird, wählen Sie den Wurm von der Platte.
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Representative Results
1. Entwicklungsverzögerung / Letalität Testergebnis
Ein typisches Ergebnis für die Entwicklungsverzögerung / Letalität Test wird in den 1a 1b gezeigt und. Bei Wildtyp-Tiere in der Kontrollgruppe wurden dem schwangeren Erwachsenen-Stadium (Abbildung 1a) gewachsen ist, sind Wildtyp-Tiere auf Clozapin ausgesetzt noch in den jungen Larvenstadien oder tot sind (Abbildung 1b). 1c zeigt ein repräsentatives Ergebnis zu vergleichen ein Suppressor-Mutante (Mut1) und ein Verstärker-Mutante (Mut2) mit dem Wildtyp bei drei verschiedenen Konzentrationen Clozapin. An allen drei Clozapin-Konzentrationen, ist die Letalität der Mut1 niedriger als der Wildtyp und die Letalität der Mut2 höher ist. Surviving Mut1 Tiere Fortschritte zu fortgeschrittenen Larvenstadien als der Wildtyp, während die überlebenden Tiere Mut2 anzuzeigen Entwicklungsverzögerung im Vergleich zum Wildtyp. </ P>
2. Pharyngeal Pumprate Untersuchungsergebnis
Abbildung 2 zeigt eine repräsentative Rachenpumptestergebnis Vergleich eines Suppressor-Mutante (Mut1) und einen Verstärker-Mutante (Mut2) mit dem Wildtyp bei zwei Clozapin-Konzentrationen. Clozapin Exposition reduziert die Rachenpumpraten der Wildtyp-und Mutanten-Stämme in einer konzentrationsabhängigen Weise. Allerdings ist die verringerte Pumprate von Rachen Mut1 geringer als die der Wildtyp, während die verminderte Pumprate von Rachen Mut2 größer als die der Wildtyp ist.
Fig. 1 ist. Demonstration von Clozapin-induzierten Entwicklungsverzögerung und Letalität. Wildtyp-Tiere (N2) auf einer Steuer gewachsen NGM Platte (a) und auf einer NGM-Platte mit 200 ug / ml (612 uM) ergänzt Clozapin (b). (C) Ein repräsentatives Ergebnis der Entwicklungsverzögerung / Letalität Assay zeigt Clozapin Wirkung auf dem Wildtyp (N2), Suppressormutante (Mut1) und ein Verstärker-Mutante (Mut2). Die Bilder in (a) und (b) nachgedruckt < http://www.nature.com/npp/journal/v34/n8/full/npp200935a.html von Neuropsychopharmakologie>. 34 (8), 1968-1978 (Juli , 2009). Klicken Sie hier für eine größere Ansicht .
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2. Demonstration von Clozapin-induzierten Hemmung der Rachen Pumpen. Ein typisches Ergebnis für die Rachenpump Assay zeigt Clozapin Wirkung auf dem Wildtyp (N2), Suppressormutante (Mut1) und ein Verstärker-Mutante (Mut2). Die Daten wurden mit Zwei-Wege-ANOVA mit der statistischen Software-Programm analysiert R. Klicken Sie hier für eine größere Ansicht .
Tabelle 1. Herstellung der Arbeitslösung von Clozapin. Die Menge beträgt für 4 Vertiefungen für jede Konzentration.
| Clozapin Konzentration | 0 uM | 300 uM | 400 uM | 500 uM |
|---|---|---|---|---|
| HAC-Lösung | 270 ul | 270 ul | 270 ul | 270 ul |
| Clozapin-Stammlösung | - | 30 ul | 40 ul | 50 ul |
| DMSO | 50 ul | 20 ul | 10 ul | 0 ul |
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Discussion
Hier Verfahren zum Testen der Wirkung von APDs auf die Entwicklung und das Verhalten von C beschreiben wir elegans. DMSO oder Ethanol eingesetzt wird Clozapin lösen, da der Wirkstoff in Wasser relativ unlöslich ist. Da Lösungsmittel wurde berichtet, daß C. beeinflussen elegans Biologie 12, DMSO-alone-oder Ethanol-alone-Kontrollgruppen sind unerlässlich. Die höchste Konzentration an DMSO in unseren Tests verwendet wird bis zu 3%, was eine offensichtliche Wirkung auf C. keinen elegans Entwicklung. DMSO kann für viele kleine Moleküle oder sogar einige große Moleküle, z. B. Lipid-Säuren verwendet werden.
In diesen Assays verwendeten APD Konzentrationen sind höher als die für den Menschen gegeben. Dies ist üblich, für die meisten kleinen Moleküluntersuchungen in C. elegans, da hohe Konzentrationen für die Penetration des C erforderlich elegans Nagelhaut. HPLC-Studien zeigen, dass die Konzentrationen von Clozapin in C. elegans Gewebe in der Entwicklungs assay, die denen im menschlichen Gehirn 2 erwartet.
Penetration der Kutikula ist ein besonderes Anliegen für Studien von großen Molekülen. Mutanten mit Defekten in der Nagelhaut-Schranke, wie acs-20-Mutanten und Bus (B acterially U n-S Woll)-Mutanten, bieten einen Ansatz, um dieses Problem zu umgehen, 13. Bus-Mutanten wurden auf der Basis ihrer Resistenz gegenüber Infektion durch das Pathogen Microbacterium nematophilum isoliert. ZB schwache Allele Bus-8 zeigen, daß dieses Gen eine Rolle bei der Produktion der Kutikula Oberfläche. Diese Mutanten sind resistent gegen eine Infektion, weil das Bakterium nicht in der Wirtsoberfläche zu binden. Wichtig ist, dass Störungen des Nagelhautbildung bewirkt auch eine erhöhte Empfindlichkeit gegenüber Medikamenten in diesem genetischen Hintergrund 14.
Die hier beschriebene Entwicklungstest kann für große genetische Screens von dem Test in flüssiger kul skaliert werdenwieder. Für genomweite RNA-Interferenz (RNAi) Bildschirme, z. B. ist das Protokoll ähnlich dem oben beschriebenen, aber Zuführen RNAi Bakterien für OP50 Bakterien 15 substituiert ist. Das flüssige Kulturtest erfordert eine geringere Wirkstoffkonzentration als die Plattentest (unveröffentlichte Beobachtung). Unser Labor durchgeführt, eine genomweite RNAi-Bildschirm für die Unterdrücker von Clozapin-induzierten Entwicklungsverzögerung und erhalten 40 Unterdrücker von einem Bildschirm von ~ 17.000 C elegans Gene acht.
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Disclosures
Die Autoren erklären, dass es keine Interessenkonflikt beteiligt.
Acknowledgments
Die Arbeit wurde durch ein NIH Clinical Scientist Award K08NS002083 Entwicklung, einer Shervert Frazier Research Institute Grant, und ein NARSAD Young Investigator Award an Edgar A. Büttner unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Clozapine | Sigma | C6305 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | D8418 | |
| Acetic acid (HAC) | Fisher | BP2401 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | EMD | SX0590-13 | |
| Hypochlorite | Sigma-Aldrich | 425044 | |
| Centrifuge 5810 | Eppendorf | 5810 000.017 | |
| Incubator shaker | New Brunswick Scientific | M1246-0006 | |
| Low temperature incubator 815 | Precision Scientific | J1790-1B | |
| Stereomicroscope | Olympus | SZX12 | |
| Petri dish 35 x 10 mm | Fisher Scientific | NC9434271 | |
| 12-well Tissue culture plate | BD Falcon | REF 353043 |
References
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