Summary
وأظهرت النهج لاختبار آثار العقاقير المضادة للذهان (APDS) في انواع معينة ايليجانس. وصفت فحوصات لاختبار آثار المخدرات على التنمية وقدرتها على البقاء وعلى معدل ضخ البلعوم. هذه الأساليب قابلة للتطبيق لتجارب pharmacogenetic مع فئات أخرى من المخدرات APDS أيضا.
Abstract
انواع معينة ايليجانس هو كائن الوراثية بسيطة قابلة للنطاق واسع إلى الأمام وعكس شاشات الجينية والوراثية شاشات الكيميائية. وC. يتضمن ايليجانس الجينوم المخدرات المحتملة المضادة للذهان (APD) أهداف المحفوظة في البشر، بما في ذلك الجينات ترميز البروتينات اللازمة لتخليق العصبي وللهيكل متشابك وظيفة. التعرض الهادئ ينتج تأخر في النمو و / أو الفتك في الديدان الخيطية بطريقة تعتمد على التركيز. هي سبب هذه الظواهر، في جزء منه، من خلال تثبيط الهادئ الناجم عن ضخ 1،2 من البلعوم. وبالتالي، فإن النمط الظاهري التنموية لديها أساس العصبية والعضلية، مما يجعلها مفيدة للدراسات pharmacogenetic من الذهان. نحن هنا لشرح الإجراءات التفصيلية لاختبار آثار الهادئ على التنمية الديدان الخيطية والبلعوم الضخ. لفحص التنموية، وتوضع الأجنة متزامنة على الديدان الخيطية متوسطة النمو (NGM) لوحات تحتوي على APDS، ومراحل تطوير العانيثم يتم تسجيل ملس اليومية. لفحص معدل ضخ البلعوم، نظموا يتم اختبار الحيوانات البالغة الشباب على لوحات NGM تحتوي على APDS. يتم تسجيل عدد من مضخات البلعوم في وحدة الزمن، ويتم حساب معدل الضخ. هذه المقايسات يمكن استخدامها لدراسة العديد من أنواع أخرى من الجزيئات الصغيرة أو حتى الجزيئات الكبيرة.
Introduction
انواع معينة ايليجانس هو كائن الوراثية بسيطة قابلة للشاشات الوراثية إلى الأمام وعكس نطاق واسع وشاشات جينية الكيميائية. C. ايليجانس حساس لمجموعة واسعة من المركبات النشطة بيولوجيا وبالتالي تم استخدامها بنجاح لتحديد آليات العمل من مجموعة متنوعة من هذه المركبات. على سبيل المثال، ودرس المركبات الحيوية النشطة باستخدام علم الوراثة الدوائي تشمل دودة منبهات مستقبلات الأستيل كولين (على سبيل المثال الليفاميزول، النيكوتين، morantel، وبيرانتيل)، ومواد التخدير (مثل هالوثان)، والكافيين، مثبطات الكولين (مثل الألديكارب، انيت، وترايكلورفون)، الفلورايد، ذات الصلة GABA مركبات (مثل GABA وmuscimol)، بالإيفرمكتين، الباراكوات، استرات phorbol، والعقاقير ذات الصلة السيروتونين (مثل السيروتونين وimiprimine) 3. وعلاوة على ذلك، C. وقد استخدم ايليجانس للشاشات جزيء صغير على نطاق واسع، مما يتيح اكتشاف مجمع النشطة بيولوجيا جديدةق وتحديد الأهداف الوراثية الرواية 4.
وC. يتضمن ايليجانس الجينوم المخدرات المحتملة المضادة للذهان (APD) أهداف المحفوظة في البشر، بما في ذلك الجينات ترميز البروتينات اللازمة لتخليق العصبي وللهيكل متشابك وظيفة 5. وبالتالي، C. ايليجانس neurogenetics وأساليب العرض بيولوجيا الأعصاب لاكتشاف الآليات الجزيئية الرواية عمل APDS. في الديدان الخيطية، والتعرض الهادئ في التنمية في وقت مبكر ينتج تأخر في النمو، وبتركيزات أعلى، الفتك 2،6. APD التعرض خلال مرحلة البلوغ وتنتج الظواهر السلوكية. على سبيل المثال، والتعرض كلوزابين يمنع تحرك والبلعوم الضخ ويعزز وضع البيض 1،2،7.
تأخر في النمو الهادئ التي يسببها والفتك هي الظواهر قوية لشاشات الجينية الكيميائية على نطاق واسع. هذه الظواهر معقدة بقدر ما أنها من المرجح أن يكون أكثر من واحد باسيل الخلوية والجينيةق. لذلك، من المتوقع أن تسفر عن مجموعة متنوعة من الأهداف المخدرات غير المباشرة مثل شاشات الوراثية. ومع ذلك، فقد أجرى مختبرنا شاشات الجينات مرشح وشاشة رني الجينوم على نطاق لالمكثفات من تأخر في النمو الهادئ التي يسببها والفتك وتعافى الجينات التي من المرجح ترميز أهدافا مباشرة، بما في ذلك الدوبامين، الأنسولين، ومستقبلات أستيل النيكوتين 2،8 بنجاح. وقد أدت الشاشات الجينية على أساس السلوكيات الهادئ التي يسببها في الكبار أيضا إلى تحديد الأهداف الهادئ الرواية، ونحن الآن التحقق من صحة الأهداف من على شاشات كلا التنموية والسلوكية في الثدييات 7. وبالتالي، وهو نهج الجينية الكيميائية اللافقارية لاكتشاف الآليات الجزيئية الرواية عمل APDS يبدو أن ذلك ممكنا 5،8.
وC. ايليجانس البلعوم هو الجهاز الذي يضم 20 الخلايا العصبية، الخلايا العضلية 20، و 20 خلايا الإكسسوارات، وملفوفة بواسطة غشاء الطابق السفلي. مماثلة لقلب الثدييات، البلعوم هو الحكم الذاتي لالثانية مضخات باستمرار الغذائية في البيئة الخارجية من 9. تثبيط معدل ضخ البلعوم التنازلات امتصاص المواد الغذائية، وبالتالي الطفرات أو الأدوية التي تمنع ضخ البلعوم سبب تأخر في النمو أو اعتقال 9. APDS تمنع معدل ضخ البلعوم، وهو ما يمثل في جزء منه لآثارها على التنمية والجدوى 1،2. هنا، ونحن نستخدم APD كلوزابين شاذة كمثال لإثبات فحوصات المخدرات للتنمية الديدان الخيطية والبلعوم الضخ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. التنموية تأخير / الفتك الفحص: البرية من نوع (N2) واثنين من المسخ (Mut1 وMut2) سلالات يتم اختبارها في ثلاثة تركيزات كلوزابين في لوحة 12 جيدا
- في يوم 1، صب 2 مل NGM المتوسطة 10 في كل بئر من لوحة 12 جيدا (كل جيدا مع 2 سم القطر) والسماح لتتصلب على مقاعد البدلاء في درجة حرارة الغرفة (RT) بين عشية وضحاها. في اليوم نفسه، واختيار مستعمرة من البكتيريا الإشريكية القولونية OP50، تصيب زجاجة من 50 مل LB الحل، والثقافة في شاكر 37 درجة مئوية في 220 دورة في الدقيقة التناوب بين عشية وضحاها.
- في يوم 2، ونقل 20 ميكرولتر OP50 ثقافة البكتيرية على مركز كل NGM جيدا. احتضان لوحات في الحاضنة 37 درجة مئوية أو تركهم في RT بين عشية وضحاها للسماح للبكتيريا أن تنمو في الحديقة سمكا.
- إجراء 80 ملي حل الأسهم كلوزابين عن طريق إذابة كلوزابين في DMSO (سلفوكسيد ثنائي ميثيل) المذيبات. ثم تقديم حل العمل 80 ميكرولتر مع الحل الأسهم المخفف في 1.7 ملي حمض الخليك باسعد على الجدول 1.
ملاحظة: يجب تحديد الحل يعمل لدواء معين من الاهتمام من خلال القيام بسلسلة من الاختبارات الأولية للعثور على تركيز تركيز الأنسب للتمييز بين النوع البري من المسوخ. - نقل 80 ميكرولتر حل كلوزابين العمل على لوحة NGM المصنفة جيدا ودوامة لوحة للسماح الحل لتوزيعها بالتساوي على السطح. انتظر لوحة لتجف. استخدام لوحة للفحص في نفس اليوم أو وضعها في حاضنة 20 درجة مئوية لاستخدامها في اليوم التالي.
ملاحظة: الحل هو تعليق العمل المخدرات بسبب ذوبان منخفضة من كلوزابين، وخصوصا في أعلى تركيز. وبالتالي، دوامة أنبوب قبل نقل الحل إلى لوحة المخدرات من أجل ضمان أن تركيز الدواء دقيقة. - غسل الديدان قبالة 3.5 سم لوحة تحتوي على الكثير من البالغين مع العازلة M9 حامل ثم تدور عليهم في أنبوب 15 ملفي 2،000 دورة في الدقيقة لمدة 1 دقيقة.
- نضح طاف. إضافة 5 مل حل التبييض (هيدروكسيد الصوديوم: هيبوكلوريت: [ده 2 O في 4:01:05) وتعطيل الديدان الخيطية التي كتبها قلب بلطف الأنابيب.
- مراقبة الحيوانات حتى تذوب نصفهم في حوالي 5 دقائق. تدور باستمرار البيض في 2،000 دورة في الدقيقة لمدة 1 دقيقة.
- نضح طاف وإضافة 14 مل العازلة M9 بسرعة.
- تدور باستمرار البيض في 2،000 دورة في الدقيقة لمدة 1 دقيقة، ونضح طاف، وترك حوالي 100 ميكرولتر حل. دوامة بتعليق البيض.
- نقل البيض 2 ميكرولتر معلقة في M9 على طبق من ذهب NGM العادية لاختبار مدى العديد من البيض يتم نقلها. ضبط حجم البيض مع وقف التنفيذ لضمان أن هناك ما يقرب من 30-35 من البيض في كل عملية تحويل. نقل 30-35 البيض إلى كل بئر من لوحة الفحص، ومن ثم احتضان في حاضنة 20 درجة مئوية لمدة 24 ساعة.
- في اليوم الأول من الفحص، يسجل عدد البيض فقس. ضبط عدد من الحيوانات تحاك ل25/well بواسطة pickiنانوغرام من الديدان إضافية إذا لزم الأمر.
- في الأيام التالية، ومراقبة الحيوانات ويسجل لهم كل 24 ساعة. وسجل مرحلة تنموية استنادا إلى حجم الحيوان وشكل الفرج 11. التجربة يدوم 5-6 أيام مع تأثير أقوى ينظر عادة في اليوم الثالث أو الرابع.
- إدخال البيانات إلى ملف إكسل وحساب النسبة المئوية للحيوانات في كل مرحلة تنموية لكل يوم من التجربة. توليد الرسوم البيانية مع وظيفة '100٪ مرصوف العمود 'في '2-D العمود' القائمة.
2. البلعوم الضخ الفحص: يونغ الحيوانات الكبار لمن نوع البرية والمسخ سلالات وسجل على لوحات الفحص كلوزابين
- يتم إجراء فحص لوحة باتباع نفس البروتوكول المستخدم للالتنموية تأخير / الفتك الفحص.
- اختيار 50 الحيوانات L4 لكل سلالة لوحات NGM المصنفة 24 ساعة قبل الفحص واحتضان الديدان عند 20 درجة مئوية.
- اختيار 10 الحيوانات إلى أساذ لوحة جيدا. ثم اختيار 10 الحيوانات إلى البئر كل 15-20 دقيقة المقبل.
- بعد أن تعرضت الحيوانات في أول بئر للمخدرات لمدة 30 دقيقة، يبدأ الفحص من خلال مراقبة ضخ البلعوم تحت المجهر تشريح ويسجل مضخات لمدة 20 ثانية 9. مرة واحدة وسجل البلعوم الضخ، واختيار دودة قبالة لوحة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
1. تأخر في النمو / الفتك نتيجة الفحص
و1B أظهر نتيجة نموذجية للالتنموية تأخير / الفتك مقايسة في أرقام 1a و. عندما نمت البرية من نوع الحيوانات في السيطرة على المجموعة إلى مرحلة الكبار حامل (الشكل 1A)، من نوع الحيوانات البرية المعرضة للكلوزابين لا تزال في مراحل اليرقات الشباب أو هي ميتة يبين (الشكل 1B). الشكل 1C نتيجة ممثل مقارنة متحولة القامع (Mut1) ومتحولة محسن (Mut2) مع نوع البرية في ثلاثة تركيزات مختلفة كلوزابين. في جميع التركيزات كلوزابين الثلاثة، وفتك Mut1 أقل من النوع البري وفتك Mut2 أعلى. الباقين على قيد الحياة الحيوانات Mut1 التقدم إلى مراحل أكثر تقدما من اليرقات النوع البري، في حين عرض على قيد الحياة الحيوانات Mut2 تأخر في النمو مقارنة مع النوع البري. </ ع>
2. معدل ضخ البلعوم نتيجة الفحص
ويبين الشكل 2 ممثل البلعوم الضخ نتيجة الفحص مقارنة متحولة القامع (Mut1) ومتحولة محسن (Mut2) مع نوع البرية بتركيزات كلوزابين اثنين. التعرض كلوزابين يقلل من معدلات الضخ البلعوم من النوع البري ومتحولة سلالات بطريقة تعتمد على التركيز. ومع ذلك، فإن معدل ضخ البلعوم انخفضت من Mut1 هو أقل من ذلك من النوع البري، في حين أن معدل ضخ البلعوم انخفضت من Mut2 هو أعظم من ذلك من النوع البري.
الشكل 1. مظاهرة من تأخر في النمو الناجم عن كلوزابين والفتك. الحيوانات البرية من نوع (N2) نمت على عنصر تحكم NGM لوحة (أ) وعلى لوحة NGM تستكمل مع 200 ميكروغرام / مل (612 ميكرومتر) كلوزابين (ب). (ج) نتيجة ممثل التنموية مقايسة تأخير / الفتك يظهر تأثير كلوزابين على نوع البرية (N2)، متحولة القامع (Mut1)، ومتحولة محسن (Mut2). الصور في (أ) و (ب) وأعيد طبعه < http://www.nature.com/npp/journal/v34/n8/full/npp200935a.html > من Neuropsychopharmacology 34 (8)، 1968-1978 (يوليو ، 2009). اضغط هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر .
ig1.jpg "العرض =" 600px ل"/>
الشكل 2. مظاهرة التي يسببها كلوزابين تثبيط البلعوم الضخ. نتيجة نموذجية لفحص البلعوم ضخ يظهر تأثير كلوزابين على نوع البرية (N2)، متحولة القامع (Mut1)، ومتحولة محسن (Mut2). وقد تم تحليل البيانات مع اتجاهين ANOVA باستخدام البرنامج الإحصائي برنامج R. اضغط هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر .
الجدول 1. إعداد الحل عمل كلوزابين. والمبلغ هو لمدة 4 آبار في كل التركيز.
| تركيز كلوزابين | 0 ميكرومتر | 300 ميكرومتر | 400 ميكرومتر | 500 ميكرومتر |
|---|---|---|---|---|
| الحل HAC | 270 ميكرولتر | 270 ميكرولتر | 270 ميكرولتر | 270 ميكرولتر |
| الحل الأسهم كلوزابين | - | 30 ميكرولتر | 40 ميكرولتر | 50 ميكرولتر |
| DMSO | 50 ميكرولتر | 20 ميكرولتر | 10 ميكرولتر | 0 ميكرولتر |
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
هنا، نحن تصف أساليب لاختبار آثار APDS على تطوير وسلوك C. ايليجانس. يستخدم DMSO الإيثانول أو حل كلوزابين، منذ المخدرات غير قابل للذوبان في الماء نسبيا. لأن تم الإبلاغ المذيبات تؤثر C. ايليجانس البيولوجيا 12، DMSO بذاتها أو مجموعات المراقبة الإيثانول وحدها ضرورية. أعلى تركيز DMSO المستخدمة في فحوصات لدينا هو ما يصل إلى 3٪، والتي لا يكون لها تأثير واضح على C. ايليجانس التنمية. DMSO يمكن استخدامها في العديد من الجزيئات الصغيرة، أو حتى بعض الجزيئات الكبيرة، مثل الأحماض الدهنية.
تركيزات APD المستخدمة في هذه القياسات ليست أعلى من تلك التي تعطى للبشر. وهذا أمر شائع بالنسبة لمعظم الدراسات جزيء صغير في C. ايليجانس، حيث لا يتعين على تركيزات عالية لاختراق من C. ايليجانس بشرة. وتشير الدراسات HPLC أن مستويات كلوزابين في C. ايليجانس الأنسجة في أسا التنمويةذ هي قريبة من تلك المتوقعة في العقول البشرية 2.
اختراق للبشرة هو مصدر قلق خاص للدراسات من الجزيئات الكبيرة. المسوخ مع عيوب في الجدار بشرة، مثل ACS-20 المسوخ والحافلات (B acterially U-S ن wollen) المسوخ، وتقديم نهج واحد للتحايل على هذه المشكلة 13. وقد تم عزل المسوخ الحافلة على أساس مقاومتها للعدوى من قبل الممرض nematophilum الجريثمة. على سبيل المثال، الأليلات ضعف حافلة 8 إثبات أن هذا الجين يلعب دورا في إنتاج سطح بشرة. هذه المسوخ مقاومة للعدوى، وذلك لأن البكتيريا لا يمكن ربط إلى السطح المضيف. الأهم من ذلك، تعطيل تشكيل بشرة يتسبب أيضا في زيادة حساسية المخدرات في هذه الخلفية الوراثية 14.
مقايسة التنموية وصفها هنا يمكن زيادتها لشاشات جينية واسعة النطاق عن طريق إجراء فحص السائل في cultuإعادة. للتدخل الحمض النووي الريبي على نطاق الجينوم (رني) شاشات، على سبيل المثال، البروتوكول هي مماثلة لتلك المذكورة أعلاه، ولكن يتم استبدال تغذية البكتيريا رني عن البكتيريا OP50 15. ثقافة فحص السائل يتطلب تركيز الدواء أقل من لوحة فحص (المراقبة غير منشورة). يقوم مختبرنا مثل شاشة رني الجينوم على نطاق لالمكثفات من تأخر في النمو الناجم عن كلوزابين وحصل 40 المكثفات من شاشة من ~ 17،000 C. ايليجانس الجينات 8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
يعلن الكتاب أنه لا يوجد صراع المصالح المعنية.
Acknowledgments
وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة على جائزة تنمية عالم السريرية K08NS002083، وهو معهد بحوث Shervert فرايزر غرانت، وجائزة الباحث الشاب NARSAD لإدغار A. BÜTTNER.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Clozapine | Sigma | C6305 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | D8418 | |
| Acetic acid (HAC) | Fisher | BP2401 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | EMD | SX0590-13 | |
| Hypochlorite | Sigma-Aldrich | 425044 | |
| Centrifuge 5810 | Eppendorf | 5810 000.017 | |
| Incubator shaker | New Brunswick Scientific | M1246-0006 | |
| Low temperature incubator 815 | Precision Scientific | J1790-1B | |
| Stereomicroscope | Olympus | SZX12 | |
| Petri dish 35 x 10 mm | Fisher Scientific | NC9434271 | |
| 12-well Tissue culture plate | BD Falcon | REF 353043 |
References
- Donohoe, D. R., Jarvis, R. A., Weeks, K., Aamodt, E. J., Dwyer, D. S. Behavioral adaptation in C. elegans produced by antipsychotic drugs requires serotonin and is associated with calcium signaling and calcineurin inhibition. Neurosci. Res. 64, 280-289 (2009).
- Karmacharya, R., et al. Clozapine interaction with phosphatidyl inositol 3-kinase (PI3K)/insulin-signaling pathway in Caenorhabditis elegans. Neuropsychopharmacology. 34, 1968-1978 (2009).
- Rand, J. B., Johnson, C. D. Carnorhabditis elegans Modern Biological Analysis of an Organism. Estein, H. F., Shakes, D. C. 48, Academic Press, Inc.. 187-204 (1995).
- Kwok, T. C., et al. A small-molecule screen in C. elegans yields a new calcium channel antagonist. Nature. 441, 91-95 (2006).
- Wang, X., Sliwoski, G. R., Buttner, E. A. The relevance of Caenorhabditis elegans genetics for understanding human psychiatric disease. Harv. Rev. Psychiatry. 19, 210-218 (2011).
- Donohoe, D. R., Aamodt, E. J., Osborn, E., Dwyer, D. S. Antipsychotic drugs disrupt normal development in Caenorhabditis elegans via additional mechanisms besides dopamine and serotonin receptors. Pharmacol. Res. 54, 361-372 (2006).
- Karmacharya, R., et al. Behavioral effects of clozapine: involvement of trace amine pathways in C. elegans and M. musculus. Brain Res. 1393, 91-99 (2011).
- Saur, T., et al. A Genome-Wide RNAi Screen in Caenorhabditis elegans Identifies the Nicotinic Acetylcholine Receptor Subunit ACR-7 as an Antipsychotic Drug Target. PLoS Genet. 9, (2013).
- Avery, L., You, Y. J. C. elegans feeding. WormBook, ed. The C. elegans Research Community, doi:10.1895/wormbook.1.150.1. , Available from: http://www.wormbook.org (2012).
- Chaudhuri, J., Parihar, M., Pires-daSilva, A. An introduction to worm lab: from culturing worms to mutagenesis. J Vis Exp. 47, (2011).
- Lewis, J. A., Fleming, J. T. Carnorhabditis elegans Modern Biological Analysis of an Organism. Estein, H. F., Shakes, D. C. 48, Academic Press, Inc.. 3-29 (1995).
- Davis, J. R., Li, Y., Rankin, C. H. Effects of developmental exposure to ethanol on Caenorhabditis elegans. Alcohol Clin. Exp. Res. 32, 853-867 (2008).
- Kage-Nakadai, E., et al. Two very long chain fatty acid acyl-CoA synthetase genes, acs-20 and acs-22, have roles in the cuticle surface barrier in Caenorhabditis elegans. PLoS One. 5, (2010).
- Partridge, F. A., Tearle, A. W., Gravato-Nobre, M. J., Schafer, W. R., Hodgkin, J. The C. elegans glycosyltransferase BUS-8 has two distinct and essential roles in epidermal morphogenesis. Dev. Biol. 317, 549-559 (2008).
- Leung, C. K., Deonarine, A., Strange, K., Choe, K. P. High-throughput screening and biosensing with fluorescent C. elegans strains. J. Vis. Exp. (51), (2011).
