Summary
Enfoques para probar los efectos de los fármacos antipsicóticos (APD) en Caenorhabditis elegans se demuestran. Los ensayos se describen para las pruebas de efectos del fármaco sobre el desarrollo y la viabilidad y sobre la tasa de bombeo de la faringe. Estos métodos se aplican también para los experimentos farmacogenéticos con clases de fármacos diferentes a APD.
Abstract
Caenorhabditis elegans es un organismo genético simple susceptible a gran escala de avance y retroceso genéticos pantallas y pantallas genéticos químicos. El C. elegans genoma incluye fármaco potencial antipsicótico (APD) objetivos conservadas en los seres humanos, incluidos los genes que codifican las proteínas necesarias para la síntesis de neurotransmisores y de la estructura y la función sináptica. Exposición APD produce una demora y / o mortalidad en los nematodos en el desarrollo de una manera dependiente de la concentración. Estos fenotipos son causados, en parte, por la inhibición inducida por APD de faríngea de bombeo 1,2. Por lo tanto, el fenotipo de desarrollo tiene una base neuromuscular, lo que es útil para estudios de farmacogenética de los neurolépticos. Aquí demostramos procedimientos detallados para probar los efectos de APD sobre el desarrollo del nematodo y el bombeo de la faringe. Para el ensayo de desarrollo, los embriones sincronizados se colocan en medio de crecimiento de nematodos (NGM) placas que contienen APD, y las etapas de desarrollo de Animales son entonces marcados diaria. Para el ensayo de velocidad de bombeo de la faringe, protagonizaron los animales adultos jóvenes se ponen a prueba en placas NGM contienen APD. El número de bombas faríngeas por unidad de tiempo se registra, y se calcula la tasa de bombeo. Estos ensayos se pueden usar para el estudio de muchos otros tipos de moléculas pequeñas o incluso moléculas grandes.
Introduction
Caenorhabditis elegans es un organismo genético simple susceptibles de pantallas genéticos directo e inverso a gran escala y pantallas genéticos químicos. C. elegans es sensible a un amplio espectro de compuestos bioactivos y por lo tanto se ha utilizado con éxito para definir los mecanismos de acción de una variedad de tales compuestos. Por ejemplo, compuestos bioactivos estudiados usando la farmacogenética gusano incluyen agonistas del receptor de acetilcolina (por ejemplo, levamisol, nicotina, morantel, y pirantel), anestésicos (por ejemplo, halotano), cafeína, inhibidores de la colinesterasa (por ejemplo, el aldicarb, LANNATE, y triclorfón), fluoruro, el GABA-relacionados compuestos (por ejemplo, GABA y muscimol), ivermectina, paraquat, ésteres de forbol y fármacos relacionados con la serotonina (por ejemplo, la serotonina y imiprimine) 3. Además, C. elegans se ha utilizado para pantallas de molécula pequeña a gran escala, lo que permite el descubrimiento de nueva compuesto bioactivos y la identificación de dianas genéticas nuevas 4.
El C. elegans genoma incluye fármaco potencial antipsicótico (APD) objetivos conservadas en los seres humanos, incluidos los genes que codifican las proteínas necesarias para la síntesis de neurotransmisores y de la estructura y función sináptica 5. Por lo tanto, C elegans neurogenetics y métodos ofrecen la neurobiología para descubrir nuevos mecanismos moleculares de la acción de la APD. En los nematodos, la exposición APD en el desarrollo temprano produce retraso en el desarrollo, y en concentraciones más altas, la letalidad de 2,6. Exposición APD durante la edad adulta produce fenotipos conductuales. Por ejemplo, la exposición a la clozapina inhibe la locomoción y el bombeo faríngeo y mejora la postura de huevos 1,2,7.
Retraso en el desarrollo inducido por APD y letalidad son los fenotipos de gran alcance para las pantallas de genética química a gran escala. Estos fenotipos son complejos en la medida en que es probable que tengan más de un basi celulares y genéticoss. Por lo tanto, se espera que tales pantallas genéticas para producir una variedad de dianas de medicamentos indirectos. Sin embargo, nuestro laboratorio ha realizado candidatos pantallas de genes y una pantalla de RNAi de todo el genoma de los supresores de retraso en el desarrollo inducido por APD y la letalidad y ha genes que probablemente codifican blancos directos, incluyendo la dopamina, la insulina y los receptores nicotínicos de la acetilcolina 2,8 recuperado con éxito. Pantallas genéticas basadas en los comportamientos inducidos por el APD en el adulto también han conducido a la identificación de los objetivos de APD novedosas, y ahora estamos validando dianas de las pantallas tanto de desarrollo y de comportamiento en los mamíferos 7. Por lo tanto, un enfoque genético químico de invertebrados para descubrir nuevos mecanismos moleculares de acción de APD parece ser factible 5,8.
El C. elegans faringe es un órgano que incluye 20 neuronas, las células musculares 20, y 20 células accesorias, envueltos por una membrana basal. Similar al corazón de los mamíferos, la faringe es un autónomaND constantemente Bombas de alimentación desde el medio ambiente externo 9. La inhibición de la velocidad de bombeo de la faringe compromete la absorción de los alimentos, y por lo tanto las mutaciones o medicamentos que inhiben la faringe de bombeo causa retraso en el desarrollo o la detención 9. APD inhiben la velocidad de bombeo de la faringe, lo que representa, en parte, por sus efectos sobre el desarrollo y viabilidad 1,2. Aquí, nosotros usamos la clozapina APD atípica como ejemplo para demostrar los ensayos de medicamentos para el desarrollo del nematodo y el bombeo de la faringe.
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Protocol
1. Retraso en el desarrollo / letalidad Ensayo: Las dos cepas mutantes (Mut1 y Mut2) de tipo salvaje (N2) y se ponen a prueba en tres Clozapina Las concentraciones en una placa de 12 pocillos
- El día 1, vierta 2 ml NGM medio 10 en cada pocillo de una placa de 12 pocillos (cada pozo con un diámetro de 2 cm) y se deja endurecer en el banquillo a temperatura ambiente (TA) durante la noche. El mismo día, elegir una colonia de bacterias Escherichia coli OP50, infectar a una botella de 50 ml de solución de LB, y la cultura en un agitador de 37 ° C a 220 rpm de rotación durante la noche.
- En el día 2, transferir 20 l de cultivo bacteriano OP50 en el centro de cada NGM bien. Incubar las placas en una incubadora a 37 ° C o dejarlos a temperatura ambiente durante la noche para permitir que el césped bacteriano a crecer más grueso.
- Haga una solución de clozapina de stock 80 mM disolviendo la clozapina en DMSO (dimetilsulfóxido) solvente. A continuación, hacer una solución de trabajo de 80 l con la solución madre diluida en 1,7 mM de ácido acético basándose en la Tabla 1.
Nota: La solución de trabajo para un fármaco particular de interés debe ser determinada por hacer una serie de pruebas preliminares de concentración para encontrar la concentración más apropiado para distinguir el tipo salvaje de los mutantes. - Transferencia de 80 l clozapina solución de trabajo en la placa de NGM sembrado bien y agitar la placa para permitir que la solución para distribuir de manera uniforme sobre la superficie. Espere a que la placa se seque. Utilice la placa para el ensayo en el mismo día o colocarlo en una incubadora de 20 ° C para su uso al día siguiente.
Nota: La solución de trabajo es una suspensión del fármaco debido a la baja solubilidad de la clozapina, especialmente a mayor concentración. Por lo tanto, vórtice el tubo antes de transferir la solución a la placa de fármaco con el fin de garantizar que la concentración de fármaco es exacta. - Lavar los gusanos de un plato de 3,5 cm que contiene muchos adultos grávidas con tampón M9 y luego girar hacia abajo en un tubo de 15 mla 2.000 rpm durante 1 min.
- Aspirar el sobrenadante. Añadir 5 ml de solución de lejía (NaOH: hipoclorito: ddH2O a 4:01:05) y desbaratar los nematodos invirtiendo suavemente los tubos.
- Observar a los animales hasta la mitad de ellos se disuelven en torno al 5 min. Centrifugar los huevos a 2.000 rpm durante 1 min.
- Aspirar el sobrenadante y añadir 14 ml de buffer M9 rápidamente.
- Centrifugar los huevos a 2000 rpm durante 1 min y aspirar el sobrenadante, dejando aproximadamente 100 l solución. Vortex para suspender los huevos.
- Transferencia de 2 l huevos suspendidos en M9 en un plato regular de NGM para probar cuántos huevos se transfieren. Ajustar el volumen de los huevos en suspensión para asegurar que hay aproximadamente 30-35 huevos en cada transferencia. Transferencia 30-35 huevos a cada pocillo de la placa de ensayo, y luego incubar en una incubadora de 20 º C durante 24 h.
- En el primer día del ensayo, anotar el número de huevos eclosionados. Ajuste el número total de animales que nacieron para 25/well por Pickión de los gusanos adicionales si es necesario.
- En los días siguientes, observar a los animales y la puntuación de ellos cada 24 horas. El grado de desarrollo se obtuvo sobre la base del tamaño del animal y la forma de la vulva 11. El experimento dura 5-6 días con el efecto más robusto típicamente visto en la tercera o cuarta día.
- Ingrese los datos en un archivo de Excel y calcular el porcentaje de animales en cada etapa de desarrollo para todos los días del experimento. Generar gráficos con la función de '100% Stacked columna 'en '2 D-columna "del menú.
2. Faríngea Ensayo de Bombeo: animales adultos jóvenes y para los de tipo salvaje y cepas mutantes se califican en placas Clozapina ensayo
- La placa de ensayo se obtiene siguiendo el mismo protocolo utilizado para el ensayo de retardo / letalidad del desarrollo.
- Elige 50 animales L4 para cada cepa a NGM placas sembradas 24 horas antes del ensayo y se incuba a los gusanos a 20 ° C.
- Elige 10 animales a un ASSAy placa también. A continuación, elija 10 animales al siguiente bien cada 15-20 min.
- Después de que los animales en el primer pozo han sido expuestos a drogas durante 30 min, iniciar el ensayo mediante la observación de bombeo faríngea bajo un microscopio de disección y la puntuación de las bombas durante 20 s 9. Una vez que el bombeo de la faringe se anotó, recoger el gusano de la placa.
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Representative Results
1. El retraso del desarrollo / resultado del ensayo de letalidad
Un resultado típico para el ensayo de retardo / letalidad del desarrollo se demuestra en las Figuras 1a y 1b. Cuando los animales de tipo salvaje en el grupo de control se han convertido en la etapa adulta grávida (Figura 1a), de tipo salvaje animales expuestos a la clozapina se encuentran todavía en las etapas jóvenes larvas o están muertos (Figura 1b). Figura 1c muestra un resultado representativo comparar un mutante supresor (Mut1) y un mutante potenciador (Mut2) con el tipo salvaje en tres concentraciones diferentes de clozapina. En todas las tres concentraciones de clozapina, la letalidad de Mut1 es menor que la de tipo salvaje y la letalidad de Mut2 es mayor. Sobrevivir a los animales Mut1 progresan a estadios larvarios más avanzados que de tipo salvaje, mientras que los animales supervivientes Mut2 muestran retraso en el desarrollo en comparación con el tipo salvaje. </ P>
2. Resultado del ensayo tasa de bombeo faríngeo
La figura 2 muestra un resultado del ensayo de bombeo faríngea representante de la comparación de un mutante supresor (Mut1) y un mutante de potenciador (Mut2) con el tipo salvaje a dos concentraciones clozapina. Exposición La clozapina reduce las tasas de bombeo faríngeas de las cepas de tipo salvaje y mutantes en una forma dependiente de la concentración. Sin embargo, la velocidad de bombeo de la faringe disminución de Mut1 es menor que la de la de tipo salvaje, mientras que la tasa de bombeo de la faringe disminución de Mut2 es mayor que la de la de tipo salvaje.
Figura 1. Demostración de la demora y la letalidad del desarrollo inducida por clozapina. Animales de tipo salvaje (N2) crecido en un control Placa de NGM (a) y en una placa de NGM suplementado con 200 g / ml (612 mM) clozapina (b). (C) Un resultado representativo del ensayo de retardo / letalidad del desarrollo que muestra el efecto de la clozapina en el tipo salvaje (N2), un mutante supresor (Mut1), y un mutante de potenciador (Mut2). Las imágenes en (a) y (b) se reimprimen < http://www.nature.com/npp/journal/v34/n8/full/npp200935a.html > de Neuropsicofarmacología. 34 (8), 1968/78 (julio , 2009). Haga clic aquí para ver la imagen más grande .
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Figura 2. Demostración de la inhibición inducida por clozapina de bombeo de la faringe. Un resultado típico para el ensayo de bombeo de la faringe que muestra el efecto de la clozapina en el tipo salvaje (N2), un mutante supresor (Mut1), y un mutante de potenciador (Mut2). Los datos se analizaron con ANOVA de dos vías con el software estadístico R. programa Haga clic aquí para ver la imagen más grande .
Tabla 1. Preparación de la solución de trabajo de la clozapina. La cantidad es de 4 pozos en cada concentración.
| Concentración Clozapina | 0 M | 300 M | 400 M | 500 M |
|---|---|---|---|---|
| Solución HAC | 270 l | 270 l | 270 l | 270 l |
| Solución Clozapina valores | - | 30 l | 40 l | 50 l |
| DMSO | 50 l | 20 l | 10 l | 0 l |
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Discussion
A continuación, describimos métodos para probar los efectos de la APD sobre el desarrollo y el comportamiento de C. elegans. DMSO o etanol se usa para disolver la clozapina, ya que el fármaco es relativamente insoluble en agua. Debido a que los disolventes se han reportado para afectar C. elegans biología 12, DMSO-solas o grupos de control de etanol por sí sola, son esenciales. La concentración más alta de DMSO utilizada en nuestros ensayos es hasta 3%, que no tiene un efecto obvio sobre C. elegans desarrollo. DMSO se puede utilizar para muchas moléculas pequeñas, o incluso algunas moléculas grandes, por ejemplo, ácidos de lípidos.
Concentraciones APD utilizadas en estos ensayos son más altos que los indicados para el ser humano. Esto es común para la mayoría de los estudios pequeños de moléculas en C. elegans, ya que se requieren altas concentraciones para la penetración de la C. elegans cutícula. Estudios de HPLC indican que los niveles de clozapina en C. tejido elegans en el assa desarrolloy están cerca de los esperados en los cerebros humanos 2.
La penetración de la cutícula es una preocupación particular para los estudios de las moléculas grandes. Los mutantes con defectos en la barrera de la cutícula, como ACS-20 mutantes y autobús (B acterially U n-S wollen) mutantes, ofrecen un enfoque para soslayar este problema 13. Mutantes de bus han sido aislados sobre la base de su resistencia a la infección por el patógeno nematophilum Microbacterium. Por ejemplo, los alelos débiles de autobús-8 demuestran que este gen desempeña un papel en la producción de la superficie de la cutícula. Estos mutantes son resistentes a la infección, debido a que la bacteria no puede unirse a la superficie de acogida. Es importante destacar que, interrupción de la formación de la cutícula también causa un aumento de sensibilidad a los fármacos en este fondo genético 14.
El ensayo de desarrollo descrito aquí puede ser ampliado para pantallas genéticos a gran escala por parte de la realización del ensayo en cultu líquidore. Para pantallas de interferencia de ARN en todo el genoma (RNAi), por ejemplo, el protocolo es similar al descrito anteriormente, pero la alimentación de las bacterias de RNAi es sustituido por bacterias OP50 15. El ensayo de cultivo líquido requiere una concentración de fármaco más baja que la placa de ensayo (observación no publicada). Nuestro laboratorio realiza una pantalla de RNAi en todo el genoma como para los supresores de retraso en el desarrollo inducida por clozapina y obtuvo 40 supresores de una pantalla de ~ 17.000 C. elegans genes 8.
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Disclosures
Los autores declaran que no existe conflicto de interés involucrados.
Acknowledgments
El trabajo fue apoyado por un premio de Desarrollo Científico Clínico de los NIH K08NS002083, un Instituto de Investigación Shervert Frazier Grant, y un premio Young Investigator NARSAD a Edgar A. Büttner.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Clozapine | Sigma | C6305 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | D8418 | |
| Acetic acid (HAC) | Fisher | BP2401 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | EMD | SX0590-13 | |
| Hypochlorite | Sigma-Aldrich | 425044 | |
| Centrifuge 5810 | Eppendorf | 5810 000.017 | |
| Incubator shaker | New Brunswick Scientific | M1246-0006 | |
| Low temperature incubator 815 | Precision Scientific | J1790-1B | |
| Stereomicroscope | Olympus | SZX12 | |
| Petri dish 35 x 10 mm | Fisher Scientific | NC9434271 | |
| 12-well Tissue culture plate | BD Falcon | REF 353043 |
References
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