Summary
Caenorhabditis elegans antipsikotik ilaçlar (APDS) etkilerini test etmek için yaklaşımlar gösterilmektedir. Deneyler gelişimi ve canlılığı üzerinde ve yutak pompalama hızı üzerindeki, ilaç etkilerini test etmek için tarif edilmiştir. Bu yöntemler aynı zamanda APDS başka ilaç sınıfları ile farmakogenetik deneyler için geçerlidir.
Abstract
Caenorhabditis elegans ileri büyük ölçekli mükellef ve genetik ekranları ve kimyasal genetik ekranları ters basit bir genetik organizmadır. C. elegans genomu nörotransmitter sentezi ve sinaptik yapısı ve fonksiyonu için gerekli olan proteinleri kodlayan genler dahil olmak üzere potansiyel antipsikotik ilaç (APD), insanlarda muhafaza hedefleri içerir. APD maruz kalması, konsantrasyona bağlı bir şekilde gelişme gecikmesi ve / veya kurt öldürücü olarak üretir. Bu fenotipler 1,2 kaldırma farenks ve APD kaynaklı inhibisyonu ile, kısmen, kaynaklanır. Böylece, gelişimsel fenotip nöroleptiklerin farmakogenetik çalışmalar için yararlıdır, bir nöromüsküler temeli vardır. Burada nematod gelişimi ve yutak pompalamayı APD etkilerini test için ayrıntılı prosedürleri göstermektedir. Gelişimsel testi için, senkronize embriyolar nematod büyüme ortamı APDS içeren (NGM) levhalar, ve ani gelişen aşamalarında yerleştirilirmals sonra günlük puanlanır. Faringeal pompalama hızı testi için, genç yetişkin hayvanlar APDS içeren NGM plakalar üzerinde test edilir düzenledi. Birim zaman başına yutak pompaların sayısı kaydedilir ve pompalama hızı hesaplanır. Bu deneyler, küçük moleküller, büyük moleküller ya da birçok diğer türleri çalışmak için de kullanılabilir.
Introduction
Caenorhabditis elegans büyük ölçekli ileri ve geri genetik ekranları ve kimyasal genetik ekranlarında mükellef basit bir genetik organizmadır. C. elegans biyolojik olarak aktif bileşikler, geniş bir spektrum duyarlıdır ve bu nedenle bu bileşiklerin, çeşitli etki mekanizmalarını tanımlamak için başarılı bir şekilde kullanılmıştır. Örneğin, biyolojik olarak aktif bileşikler, solucan farmakogenetik asetilkolin reseptörü agonistleri (örneğin, levamisol, nikotin, morantel ve pirantel), anestezikler (ör., halotan), kafein, kolinesteraz inhibitörleri (örneğin, aldikarb, lannate ve triklorfon), florür, GABA ile ilişkili bulunmaktadır kullanılarak incelendi bileşikleri (örneğin, GABA ve Muscimol), ivermektin, parakuat, forbol esterler ve serotonin ile ilgili ilaçlar (örneğin, serotonin ve imiprimine) 3. Ayrıca, C. elegans sağlayan, büyük ölçekli küçük molekül ekranlar için kullanılmış olan, yeni biyolojik olarak aktif bileşiğin keşfis ve yeni genetik hedefler 4. tanımlanması.
C. elegans genomu nörotransmitter sentezi ve sinaptik yapısı ve fonksiyonu için gerekli olan 5 proteinleri kodlayan genler dahil olmak üzere potansiyel antipsikotik ilaç (APD), insanlarda muhafaza hedefleri içerir. Bu nedenle, C. elegans nörogenetik ve APDS etki yeni moleküler mekanizmalarını keşfetmek için nörobiyoloji teklif yöntemleri. Nematod olarak, APD maruz erken gelişim gelişme gecikmesi ve daha yüksek konsantrasyonlarda, ölümcül 2,6 üretir. Yetişkinlik döneminde APD poz davranışsal fenotipleri üretir. Örneğin, klozapin pozlama lokomosyonu ve faringeal pompalama engeller ve 1,2,7 döşeme yumurta geliştirir.
APD kaynaklı gelişimsel gecikme ve öldürücülüğü büyük ölçekli kimyasal genetik ekranlar için güçlü fenotipleri vardır. Büyük olasılıkla birden fazla hücresel ve genetik Basi gibi bu fenotipleri kadar karmaşıktırs. Bu nedenle, genetik ekranlar dolaylı ilaç hedefleri bir dizi elde etmek için beklenir. Ancak, bizim laboratuvar aday gen ekranları ve APD kaynaklı gelişimsel gecikme ve letalitesinin bastırıcılarının için bir genom RNAi ekran gerçekleştirilen ve başarıyla olasılıkla dopamin, insülin ve nikotinik asetilkolin reseptörleri 2,8 dahil olmak üzere doğrudan hedefleri, kodlayan genleri kurtarıldı. Yetişkin APD kaynaklı davranışları dayalı genetik ekranlar da yeni APD hedeflerinin tanımlanmasına yol açmıştır, ve biz şimdi memelilerde 7 gelişimsel ve davranışsal hem de ekranlardan hedefleri doğrulayarak edilir. Bu nedenle, APDS aksiyon yeni moleküler mekanizmaları keşfetmek için bir omurgasız kimyasal bir genetik yaklaşım 5,8 mümkün görünmektedir.
C. elegans yutak 20 nöronlar, 20 kas hücreleri ve Bir taban zan ile sarılmış 20 aksesuar hücreleri içeren bir organdır. Memeli kalp benzer şekilde, yutak özerk a,nd sürekli dış ortamdan 9 gıda pompaları. Faringeal pompalama oranı engellenmesi gıda alımını uzlaşma ve böylece mutasyonlar veya uyuşturucu faringeal pompalama nedeni gelişimsel gecikme inhibe veya 9 tutuklama söyledi. APDS gelişimi ve canlılığı 1,2 üzerindeki etkileri kısmen muhasebe, yutak pompalama hızını inhibe. Burada, nematod gelişimi ve yutak pompalama için ilaç deneyleri göstermek için bir örnek olarak atipik AKB klozapini kullanın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1.. Gelişim Delay / Lethality Deneyi: Vahşi tip (N2) ve iki Mutant (Mut1 ve Mut2) Suşlar, 12 oyuklu bir plaka içerisinde üç Klozapin Konsantrasyonlar test edilir
- 1. günde, (2 cm çaplı her oyuğa), 12 oyuklu plakanın her oyuğuna 2 mi NGM ortamı 10 dökün ve gece boyunca oda sıcaklığında (RT) de tezgah üzerinde sertleşmesine olanak sağlar. Aynı gün, bir gece boyunca 220 rpm devirle, Escherichia coli OP50 bir bakteri kolonisi seçmek 50 ml LB solüsyonu bir şişe enfekte eder ve 37 ° C bir çalkalayıcı içinde kültür o.
- 2. günde, her bir oyuğa NGM merkezi üzerine 20 ul OP50 bakteri kültürü aktarın. 37 ° C inkübatör içinde inkübe edilir ya da bakteri çim kalın büyümesine izin vermek için gece boyunca oda sıcaklığında bekletin.
- DMSO (dimetil sülfoksit) solvent içinde eritilmesi ile klozapin bir 80 mM stok solüsyonu klozapin olun. Daha sonra 1.7 mM asetik asit B içinde seyreltilmiş stok çözeltisi ile bir 80 ul çalışma çözeltisi yapmakTablo 1 ased.
Not: ilgi belirli bir ilaç için hazır çözelti mutantlardan alınan yabani tür ayırt için en uygun konsantrasyonunu bulmak için, ön konsantrasyon bir dizi test yaparak tespit edilmelidir. - Aktarım 80 ul klozapin de tohumlanmış NGM plaka üzerine çalışma çözeltisi ve çözelti yüzeyi üzerinde eşit olarak dağıtmak için izin vermek için plaka girdap. Plaka kurumasını bekleyin. Aynı gün deneyi için plaka kullanarak ya da bir sonraki gün kullanılmak üzere 20 ° C inkübatör içine yerleştirin.
Not: çalışma çözeltisi, özellikle yüksek konsantrasyonda, Klozapin düşük çözünürlüğe sahip bir ilaç bir süspansiyondur. Bu nedenle, ilaç konsantrasyonu doğru olduğunu garanti etmek için ilaç plakaya çözüm aktarmadan önce tüp vorteks. - M9 tampon ile birçok gebe yetişkin içeren 3,5 cm plaka solucanlar yıkayın ve daha sonra bir 15 ml tüp onları aşağı spin1 dakika boyunca 2000 rpm'de.
- Süpernatant aspire. 5 ml çamaşır suyu (: hipoklorit: NaOH 04:01:05 de GKD 2 O) ekleyin ve hafifçe tersini tüpleri nematodları bozabilir.
- Yarısı yaklaşık 5 dakika ile eritilir kadar hayvanlar dikkat edin. 1 dakika 2.000 rpm'de yumurta aşağı spin.
- Süpernatant aspirat ve hızla 14 ml M9 tampon ekleyin.
- 1 dakika 2.000 rpm'de yumurta aşağı Spin ve yaklaşık 100 ul çözüm bırakarak, süpernatant aspire. Yumurta askıya Vortex.
- Transferi 2 ul yumurta transfer kaç yumurta test etmek için düzenli bir NGM plaka üzerine M9 asılı. Yaklaşık 30-35 yumurta her transferi olmadığından emin olmak için askıya yumurta seviyesini ayarlayın. Deney plakasının her oyuğuna 30-35 yumurta transferi ve daha sonra 24 saat için bir 20 ° C kuluçka makinesi içinde inkübe edilir.
- Tahlilin ilk gününde, yumurtadan yumurta sayısını skor. Picki tarafından 25ul/çukur için taranmış hayvanların toplam sayısını ayarlayınGerekirse ekstra kapalı solucanlar ng.
- Daha sonraki günlerde, hayvanları gözlemlemek ve onları her 24 saatte skor. Gelişim aşama hayvanın boyutu ve vulva 11 şekline göre puanlanmıştır. Deney tipik olarak, üçüncü ya da dördüncü gününde görülen en güçlü etkisi ile 5-6 gün sürer.
- Bir Excel dosyası içine girdi veri ve deney her gün için her gelişimsel aşamada hayvanların yüzdesi hesaplanır. '100% Menüsünden ''2-B sütun içinde' sütun Yığılmış fonksiyonu ile grafikler oluşturun.
2. Pharyngeal Kaldırma Deneyi: Yabani-tür ve mutant suşu için genç yetişkin Hayvan Deneyi Klozapin tabakalarına atacak
- Analiz plakası gelişimsel gecikme / letalite deneyinde kullanılan aynı protokol takip edilerek yapılır.
- 24 saat analizden önce ekim yapılmış olan NGM plakalarına her bir suş için 50 L4 hayvanlar almak ve 20 ° C de inkübe solucanlar
- Bir assa 10 hayvan almaky iyi plaka. Ardından bir sonraki de her 15-20 dk 10 hayvan almak.
- İlk kuyudaki hayvanlar 30 dakika için bir ilaca maruz bırakıldıktan sonra, bir diseksiyon mikroskobu altında yutak pompalama gözlemleyerek deneyi başlatın ve 20 saniye için pompalar 9 puan. Faringeal pompalama attı sonra, plaka kapalı solucan almak.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
1.. Gelişimsel gecikme / letalite tahlil sonucu
Gelişimsel gecikme / öldürücülüğü deneyi için tipik bir sonucu Şekil 1a gösterdi ve 1b edilir. Kontrol grubunda, vahşi tip hayvanlara gebe yetişkin aşamasında (Şekil 1a) büyümüştür zaman, klozapin maruz vahşi tip hayvanların ölmüş (Şekil 1b). Şekil 1c karşılaştırma temsili bir sonuç göstermektedir Genç larva aşamalarında hala ya da vardır baskılayıcı bir mutant (Mut1) ve üç farklı klozapin konsantrasyonlarda vahşi tip bir güçlendirici mutant (Mut2). Üç klozapin yoğunluklarda, Mut1 ölümcüllüğünün yabani tip daha düşüktür ve Mut2 ölümcüllüğünün yüksektir. Hayatta Mut2 hayvanlar yabani tip göre gelişimsel gecikme ekran ise hayatta Mut1 hayvanlar, vahşi tip daha gelişmiş larva aşamalarında ilerleme. </ P>
2. Farengeal pompalama oranı tahlil sonucu
Şekil 2, iki klozapin konsantrasyonda vahşi tip baskılayıcı bir mutant (Mut1) ve bir güçlendirici mutant (Mut2) karşılaştıran bir temsili yutak kaldırma deneyi sonuçlarını göstermektedir. Klozapin maruz kalması, konsantrasyona bağlı bir şekilde, yabani tip ve mutant soylarının yutak pompalama oranını azaltır. Mut2 azalmış yutak pompalama oranı vahşi tip arasında daha büyüktür Bununla birlikte, Mut1 azalmış yutak pompalama hızı, vahşi tip daha azdır.
Şekil 1. Klozapinle gelişimsel gecikme ve letalitesinin gösteri. Yabani tip hayvanlar (N2) kontrol yetiştirilen NGM plakası (a) ve 200 ug / ml (612 uM) ile takviye edilmiş bir NGM plaka üzerinde klozapinin (b). (C) vahşi tip (N2), baskılayıcı bir mutant (Mut1) ve bir güçlendirici mutant (Mut2) üzerinde klozapinin etkisini gösteren gelişimsel gecikme / letalite deneyinde temsili bir sonucu. (A) ve (b) 'de yeniden basıldı görüntüleri http://www.nature.com/npp/journal/v34/n8/full/npp200935a.html Neuropsychopharmacology dan>. 34 (8), 1968-1978 (Temmuz , 2009). resmi büyütmek için buraya tıklayın .
ig1.jpg "width =" 600px "/>
Şekil 2. Yutak pompalama klozapin ile uyarılan inhibe gösterilmesi. Vahşi tip (N2), baskılayıcı bir mutant (Mut1) ve bir güçlendirici mutant (Mut2) üzerinde klozapinin etkisini gösteren yutak kaldırma deneyi için tipik bir sonucu. Veriler iki yönlü ANOVA istatistik yazılım programı R. ile analiz edilmiştir büyük resmi görebilmek için buraya tıklayın .
Tablo 1. Klozapinin çalışma çözeltisinin hazırlanması. Değeri, her bir konsantrasyonda 4 kuyu içindir.
| Klozapin konsantrasyonu | 0 iM | 300 uM | 400 uM | 500 iM |
|---|---|---|---|---|
| HAC Çözelti | 270 ul | 270 ul | 270 ul | 270 ul |
| Klozapin stok solüsyonu | - | 30 ul | 40 ul | 50 ul |
| DMSO | 50 ul | 20 ul | 10 ul | 0 ul |
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada, C ve davranış ile ilgili APDS etkilerini test etmek için yöntemleri tarif eder elegans. İlaç suda çözünmediği DMSO ya da etanol, klozapin çözmek için kullanılır. Çözücüler C etkilediği bildirilmiştir Çünkü elegans biyoloji 12, DMSO-tek başına veya etanol başına bir kontrol grubu gereklidir. Analizlerde kullanılan en yüksek DMSO konsantrasyonu, C üzerinde belirgin bir etkisi yoktur% 3 e kadar olduğu elegans gelişimi. DMSO hatta birçok küçük moleküller, büyük moleküller ya da bazı, örneğin, lipid asitler için de kullanılabilir.
Bu deneylerde kullanılan APD konsantrasyonları insanlara verilen daha yüksektir. Bu, C de, en küçük molekül çalışmaları için yaygındır elegans, yüksek konsantrasyonlarda C nüfuz etmesi için gerekli olan bu yana manikür elegans. HPLC çalışmalar, C klozapinin seviyeleri gelişimsel assa de elegans dokuy insan beyni 2 beklenen olanlara yakındır.
Kütikül nüfuz büyük moleküllerin çalışmalar için özel bir endişe nedenidir. Böyle acs-20 mutantlar ve Otobüs (B acterially U n-S wollen) mutantlar olarak manikür bariyer defektleri, ile mutantlar bu sorunu 13 aşmak için bir yaklaşım sunuyoruz. Bus mutantları patojen Microbacterium nematophilum neden olduğu enfeksiyona karşı direnci bazında izole edilmiştir. Örneğin, veri yolu-8 zayıf alelleri bu gen üst deri yüzeyinin üretiminde bir rol oynadığını göstermektedir. Bakteri ana yüzeyine bağlamak çünkü bu mutantlar, enfeksiyona karşı dirençlidir. Önemlisi, manikür oluşumunun bozulması da bu genetik arka 14 artan ilaç hassasiyeti neden olur.
Burada açıklanan gelişimsel tahlil sıvı kültürlerdeki tahlil yaparak büyük ölçekli genetik ekranlarında kadar ölçeklendirilebiliryeniden. Genom RNA interferans (RNAi) ekranlar için, örneğin, protokol, yukarıda tarif edilene benzer, ancak besleme RNAi bakteri OP50 bakteriler 15 için ikame edilir. Sıvı kültür tahlil plaka deneyi (yayınlanmamış gözlem) daha düşük bir ilaç konsantrasyonu gerektirir. Bizim laboratuvar Klozapinle gelişimsel gecikme bastırıcılarının için böyle bir genom RNAi ekran gerçekleştirilen ve ~ 17.000 C'lik bir ekrandan 40 bastırıcılara elde elegans genleri 8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar dahil faiz çatışma olmadığını beyan ederim.
Acknowledgments
Çalışma NIH Klinik Bilim Geliştirme ödül K08NS002083, bir Shervert Frazier Araştırma Enstitüsü Grant ve Edgar A. Büttner bir NARSAD Genç Araştırmacı Ödülü ile desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Clozapine | Sigma | C6305 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | D8418 | |
| Acetic acid (HAC) | Fisher | BP2401 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | EMD | SX0590-13 | |
| Hypochlorite | Sigma-Aldrich | 425044 | |
| Centrifuge 5810 | Eppendorf | 5810 000.017 | |
| Incubator shaker | New Brunswick Scientific | M1246-0006 | |
| Low temperature incubator 815 | Precision Scientific | J1790-1B | |
| Stereomicroscope | Olympus | SZX12 | |
| Petri dish 35 x 10 mm | Fisher Scientific | NC9434271 | |
| 12-well Tissue culture plate | BD Falcon | REF 353043 |
References
- Donohoe, D. R., Jarvis, R. A., Weeks, K., Aamodt, E. J., Dwyer, D. S. Behavioral adaptation in C. elegans produced by antipsychotic drugs requires serotonin and is associated with calcium signaling and calcineurin inhibition. Neurosci. Res. 64, 280-289 (2009).
- Karmacharya, R., et al. Clozapine interaction with phosphatidyl inositol 3-kinase (PI3K)/insulin-signaling pathway in Caenorhabditis elegans. Neuropsychopharmacology. 34, 1968-1978 (2009).
- Rand, J. B., Johnson, C. D. Carnorhabditis elegans Modern Biological Analysis of an Organism. Estein, H. F., Shakes, D. C. 48, Academic Press, Inc.. 187-204 (1995).
- Kwok, T. C., et al. A small-molecule screen in C. elegans yields a new calcium channel antagonist. Nature. 441, 91-95 (2006).
- Wang, X., Sliwoski, G. R., Buttner, E. A. The relevance of Caenorhabditis elegans genetics for understanding human psychiatric disease. Harv. Rev. Psychiatry. 19, 210-218 (2011).
- Donohoe, D. R., Aamodt, E. J., Osborn, E., Dwyer, D. S. Antipsychotic drugs disrupt normal development in Caenorhabditis elegans via additional mechanisms besides dopamine and serotonin receptors. Pharmacol. Res. 54, 361-372 (2006).
- Karmacharya, R., et al. Behavioral effects of clozapine: involvement of trace amine pathways in C. elegans and M. musculus. Brain Res. 1393, 91-99 (2011).
- Saur, T., et al. A Genome-Wide RNAi Screen in Caenorhabditis elegans Identifies the Nicotinic Acetylcholine Receptor Subunit ACR-7 as an Antipsychotic Drug Target. PLoS Genet. 9, (2013).
- Avery, L., You, Y. J. C. elegans feeding. WormBook, ed. The C. elegans Research Community, doi:10.1895/wormbook.1.150.1. , Available from: http://www.wormbook.org (2012).
- Chaudhuri, J., Parihar, M., Pires-daSilva, A. An introduction to worm lab: from culturing worms to mutagenesis. J Vis Exp. 47, (2011).
- Lewis, J. A., Fleming, J. T. Carnorhabditis elegans Modern Biological Analysis of an Organism. Estein, H. F., Shakes, D. C. 48, Academic Press, Inc.. 3-29 (1995).
- Davis, J. R., Li, Y., Rankin, C. H. Effects of developmental exposure to ethanol on Caenorhabditis elegans. Alcohol Clin. Exp. Res. 32, 853-867 (2008).
- Kage-Nakadai, E., et al. Two very long chain fatty acid acyl-CoA synthetase genes, acs-20 and acs-22, have roles in the cuticle surface barrier in Caenorhabditis elegans. PLoS One. 5, (2010).
- Partridge, F. A., Tearle, A. W., Gravato-Nobre, M. J., Schafer, W. R., Hodgkin, J. The C. elegans glycosyltransferase BUS-8 has two distinct and essential roles in epidermal morphogenesis. Dev. Biol. 317, 549-559 (2008).
- Leung, C. K., Deonarine, A., Strange, K., Choe, K. P. High-throughput screening and biosensing with fluorescent C. elegans strains. J. Vis. Exp. (51), (2011).
