Summary
線虫（Caenorhabditis elegans）における抗精神病薬（APDの）の影響をテストするためのアプローチが実証されています。アッセイを開発および生存に咽頭のポンピング速度に対する薬物の効果を試験するために記載されている。これらの方法は、APDの以外の薬剤クラスと薬理遺伝学的実験に適用可能である。
Abstract
線虫（Caenorhabditis elegans）は、前方、大規模に従順と遺伝子スクリーニング、化学遺伝学的スクリーニングを逆に単純な遺伝的生物である。 C.エレガンスゲノムは、神経伝達物質合成およびシナプスの構造および機能に必要なタンパク質をコードする遺伝子を含む潜在的な抗精神病薬（APD）は、ヒトにおいて保存ターゲットを含む。 APD露光は、濃度依存的に、線虫において発達遅延および/または致死性を生じる。これらの表現型は、咽頭のポンピング1,2のAPD誘導阻害によって部分的に引き起こされる。このため、発生表現型は神経遮断薬の薬理遺伝学的研究のためには有用なものに、神経筋基盤を持っています。ここでは、線虫の開発および咽頭ポンプ上のAPDの影響をテストするための詳細な手順を示しています。発達のアッセイのために、同期化された胚は、線虫の成長培地のAPDを含有する（NGM）プレート、および肛門の開発段階に配置されているMALSは、その後毎日採点されます。咽頭ポンピング速度アッセイのために、若い成人の動物はAPDのを含むNGMプレート上でテストされて上演した。単位時間当たりの咽頭ポンプの数が記録され、ポンピング速度を算出する。これらのアッセイは、小分子または大分子であっても他の多くのタイプを研究するために使用することができる。
Introduction
線虫（Caenorhabditis elegans）は、大規模、順方向および逆方向遺伝子スクリーニング、化学遺伝学的スクリーニングを受けやすいシンプルな遺伝的生物である。C.エレガンスは、生物活性化合物の広いスペクトルに敏感であり、したがってそのような化合物の種々の作用メカニズムを定義するために首尾よく使用されている。例えば、生物活性化合物は、アセチルコリン受容体アゴニスト（ 例えばレバミゾール、ニコチン、モランテル、およびピランテル）、麻酔薬（ 例えばハロタン）、カフェイン、コリンエステラーゼ阻害剤（ 例えばアルジカルブ、lannate、およびトリクロルホン）、フッ化物、GABA関連を含むワームの薬理遺伝学を用いて研究化合物（ 例えば 、GABAおよびムシモール）、イベルメクチン、パラコート、ホルボールエステル、およびセロトニン関連薬（ 例えばセロトニンおよびimiprimine）3。さらに、C.エレガンスは、新規生物活性化合物の発見を可能にする、大規模な小分子のスクリーニングに使用されているSおよび新規の遺伝子標的4の識別。
C.エレガンスゲノムは、神経伝達物質合成およびシナプスの構造および機能5に必要なタンパク質をコードする遺伝子を含む潜在的な抗精神病薬（APD）は、ヒトにおいて保存ターゲットを含む。このように、C.虫の神経遺伝とのAPDの新しい作用の分子メカニズムを発見するための神経生物学の提供方法。線虫では、APDの露出は開発の初期段階で発育遅延、および高濃度で、致死2,6を生成します。成人期のAPDの暴露は、行動の表現型を生成します。例えば、クロザピン露出が移動し、咽頭ポンプを阻害し、1,2,7産卵を強化します。
APD誘発性発達遅延と致死は、大規模な化学遺伝学的スクリーニングのための強力な表現型である。これらの表現は、これまでのところ、彼らはおそらく、複数の細胞および遺伝バシを持っているように複雑でS。したがって、このような遺伝子スクリーニングは、間接薬物標的の様々もたらすことが期待される。しかし、私たちの研究室では、候補遺伝子の画面およびAPD誘発性発達遅延と致死性の抑制のためのゲノムワイドなRNAiスクリーニングを実施しており、成功しそうドーパミン、インスリン、およびニコチン性アセチルコリン受容体2,8を含む直接の標的をコードする遺伝子を回復しました。成人におけるAPD誘発の行動に基づいた遺伝子スクリーニングはまた、新規のAPD標的の同定につながっている、と我々は今、哺乳類7の発達と行動の両方の画面からターゲットを検証する。このように、APDの作用の新たな分子メカニズムを発見する無脊椎動物の化学遺伝学的ア プローチは、5,8実現可能であるように思われる。
C.エレガンスの咽頭20ニューロン、20筋細胞および基底膜により包まれた20アクセサリー細胞を含む器官である。哺乳類の心臓と同様に、咽頭、自律AですND絶えず外部環境から9に食べ物を圧送する。レート妥協食品摂取をポンピング咽頭の阻害、したがって、咽頭ポンプを阻害変異または薬は発達遅延が発生したり、9を逮捕。 APDは、開発および生存率1,2に対する効果についての部分で占め、咽頭ポンピング速度を阻害する。ここでは、線虫の開発および咽頭ポンピングするための薬物アッセイを実証する例として、非定型のAPDクロザピンを使用しています。
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Protocol
1。発達遅延/致死アッセイ：野生型（N2）と2つの突然変異（MUT1とMUT2）株を12ウェルプレートに三クロザピン濃度で試験されています
- 1日目に、（直径2cmの各ウェル）を12ウェルプレートの各ウェルに2ミリリットルNGM培地10を入れ、一晩、室温（RT）にてベンチ上で硬化することを可能にする。同じ日、一晩220 rpmで回転で50ミリリットルのLB液のボトルに感染、 大腸菌 OP50細菌のコロニーを採取し、37℃のシェーカーで培養し、それを。
- 2日目に、各ウェルNGMの中心に20μLOP50細菌培養を転送します。 37℃のインキュベーターで培養するか、細菌ローンを厚く成長させるために室温で一晩置いておく。
- DMSO（ジメチルスルホキシド）溶媒中にクロザピンを溶解させて80 mMのクロザピン原液を作る。その後、1.7 mMの酢酸Bで希釈した原液を80μLワーキング溶液を作る表1にバイアスさ。
注 ：興味のある特定の薬剤のための実用的なソリューションは、変異体からの野生型を区別するために最も適切な濃度を見つけるために予備的な濃度の一連のテストを行うことによって決定されなければならない。 - よくシードされたNGMプレート上に溶液をワーキング転送80μlのクロザピン、溶液が表面に均等に分配することができるように、プレートを旋回。プレートが乾燥するのを待ちます。同じ日にアッセイプレートを使用するか、次の日に使用されるように20℃のインキュベーターに入れてください。
注意 ：ワーキングソリューションは、特に高濃度で、原因クロザピンの溶解度が低いため、薬物懸濁液である。従って、薬物濃度が正確であることを保証するために、薬物プレートに溶液を移す前に、チューブをボルテックス。 - M9緩衝液を用いて、多くの妊娠成人を含む3.5センチメートルプレートをワームを洗い流した後、15ミリリットルチューブでそれらをスピンダウン1分間2,000 rpmで。
- 上清を吸引除去する。 5ミリリットル漂白液（：次亜塩素酸：NaOHを4時01分05秒でのddH 2 O）を加え、穏やかにチューブを反転させて線虫を混乱させる。
- そのうちの半分は、約5分で溶解するまで動物を観察します。 1分間2,000 rpmで卵をスピンダウン。
- 上清を吸引し、急速に14ミリリットルのM9バッファーを追加します。
- 1分間2000 rpmで卵をスピンダウンし、上清を吸引し、約100μlのソリューションを残す。卵を中断する渦。
- 転送され、どのように多くの卵をテストするために定期的なNGMプレートにM9に懸濁2μlの卵を移す。約30〜35卵は各転送であることを保証するために中断した卵の音量を調整します。アッセイプレートの各ウェルに30〜35卵を移し、次いで24時間20℃のインキュベーター中でインキュベートする。
- アッセイの初日に、孵化した卵の数をスコア。 pickiで25/wellする斜線の動物の合計数を調整します必要に応じて追加のワームをオフngの。
- 次の日には、動物を観察し、それらを24時間毎に得点。発生段階は、動物の大きさおよび外陰部11の形状に基づいて採点される。実験は、通常、第三または第四日目に見た最も強力な効果が5-6日間続きます。
- Excelファイルに入力データを、実験の日々のために各発達段階での動物の割合を計算します。メニュー ''2次元欄の'関数'100％積み上げ縦棒でグラフを生成します。
2。咽頭ポンピングアッセイ：野生型および変異株のためのヤングアダルト動物はクロザピンアッセイプレート上で採点される
- アッセイプレートを、発育遅延/致死性アッセイに使用したのと同じプロトコルに従って行われる。
- アッセイの前にシードされたNGMプレートに各菌株を24時間50 L4動物を選択し、20℃でワームをインキュベート
- ASSAに10匹の動物を選ぶYは、ウェルプレート。そして、次のウェルごとに15〜20分に10匹の動物を選ぶ。
- 最初のウェル中の動物は、30分間、薬物に曝露された後、解剖顕微鏡下咽頭ポンピングを観察することによってアッセイを開始し、20秒9のポンプのスコア。咽頭ポンピングが採点されると、プレートからワームを選ぶ。
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Representative Results
1。発達遅延/致死アッセイ結果
発達遅延/致死性アッセイのための典型的な結果を図1aおよび1bに示されている。対照群の野生型動物が妊娠成体段階（ 図1a）まで成長したら、クロザピンに露出野生型動物は死んだ（ 図1b）。図1c、比較の代表的な結果を示している若い幼虫期に残っているか、あるサプレッサー変異体（MUT1）と3種類のクロザピン濃度で野生型とエンハンサー変異体（MUT2）。すべての3つのクロザピン濃度において、MUT1の致死性は、野生型よりも低く、MUT2の致死性が高くなる。生き残ったMUT2動物は野生型と比較して発達遅延を表示しながら、生き残ったMUT1の動物は、野生型よりもより高度な幼虫期に進行。</ pの>
2。咽頭ポンピング速度アッセイの結果
図2に、2クロザピン濃度で野生型とサプレッサー変異体（MUT1）とエンハンサー変異体（MUT2）を比較する代表咽頭ポンピング分析結果を示している。クロザピン露光は、濃度依存的に野生型及び変異株の咽頭ポンピング速度を減少させる。 MUT2の減少咽頭ポンピング速度は、野生型のそれよりも大きいながらしかしながら、MUT1の減少咽頭ポンピング速度は、野生型のものよりも小さい。
図1。クロザピン誘発性の発達遅延と致死性の実証。野生型動物（N2）コントロール上に成長した NGMプレート（A）および200μg/ mlの（612μM）を補ったNGMプレート上のクロザピン（B）。 （C）野生型（N2）、サプレッサー変異体（MUT1）、およびエンハンサー変異体（MUT2）に対するクロザピンの効果を示す発達遅延/致死アッセイの代表的結果。 （a）および（b）<再印刷された画像におけるhttp://www.nature.com/npp/journal/v34/n8/full/npp200935a.html 神経精神から> 34（8）、1968から1978（5月、2009）。 拡大画像を表示するには、ここをクリックしてください 。
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図2。咽頭ポンピングクロザピン誘導阻害の実証。野生型（N2）、サプレッサー変異体（MUT1）、およびエンハンサー変異体（MUT2）に対するクロザピンの効果を示す咽頭ポンプアッセイのための典型的な結果。データは、統計的なソフトウェアプログラムRを使用して、2方向ANOVAを用いて分析した拡大画像を表示するには、ここをクリックしてください 。
表1。クロザピンの使用液の調製。量は、各濃度での4ウェルについてです。
| クロザピン濃度 | 0μM | 300μMの | 400μMの | 500μMの |
|---|---|---|---|---|
| HACソリューション | 270μL | 270μL | 270μL | 270μL |
| クロザピン原液 | - | 30μL | 40μL | 50μL |
| DMSO | 50μL | 20μL | 10μL | 0μL |
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Discussion
ここでは、C.の開発および動作上のAPDの効果を試験するための方法を記載虫 。薬物は水に比較的不溶性であるため、DMSO又はエタノール、クロザピンを溶解するために使用される。溶媒は、C.に影響を与えることが報告されているので、 エレガンス生物 12は 、DMSO単独またはエタノール単独の対照群は、必須である。私たちのアッセイで使用のDMSOの最高濃度は、C上の明らかな効果を持っていない最大3％であり、開発エレガンス 。 DMSOは、さらに多くの小分子、またはいくつかの大きな分子、 例えば、脂質のアミノ酸のために使用することができる。
これらのアッセイにおいて使用されるAPD濃度は、ヒトに与えられたものより高い。これはC言語のほとんどの小分子の研究に共通している虫 、高濃度での浸透のために必要とされるため、キューティクルエレガンス 。 HPLCの研究は、Cのクロザピンのレベル発達ASSA中の虫組織Yは、人間の脳2で予想されるものに近い。
キューティクルの浸透は大きな分子の研究のための特別な関心事である。このようなACS-20の変異体とバス（B acterially U N-Sのウォーレン）変異体などのキューティクルバリアの欠陥を持つ変異体は、この問題を回避するために13つのアプローチを提供します。バス変異体は病原体のミクロのnematophilumによる感染に対する抵抗性に基づいて単離されている。例えば、 バス-8の弱い対立遺伝子は、この遺伝子がキューティクル表面の産生において役割を果たすことを示している。細菌が宿主の表面に結合することができないため、これらの変異体は、感染に抵抗性である。重要なのは、キューティクルの形成の破壊も、この遺伝的背景14における増加薬剤感受性の原因となる。
ここで説明する発達アッセイは、液体cultuでアッセイを実施することで、大規模な遺伝子スクリーニング用にスケールアップすることができる再。ゲノムワイドRNA干渉（RNAi）の画面には、例えば、プロトコルは、上記と同様であるが、摂食のRNAi細菌をOP50細菌15を代入する。液体培養アッセイはプレートアッセイ（未発表の観察）よりも低い薬剤濃度を必要とします。当研究室では、クロザピン誘発性発達遅延の抑制のためのそのようなゲノムワイドRNAiスクリーニングを行い、〜17000 程度の画面から40サプレッサーを得虫の遺伝子8。
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Disclosures
著者は、関係する利害の衝突がないことを宣言します。
Acknowledgments
作品は、NIH臨床科学開発賞K08NS002083、Shervertフレイジャー研究所グラント、そしてエドガー·A.ビュトナーにNARSAD若手研究者賞によってサポートされていました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Clozapine | Sigma | C6305 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | D8418 | |
| Acetic acid (HAC) | Fisher | BP2401 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | EMD | SX0590-13 | |
| Hypochlorite | Sigma-Aldrich | 425044 | |
| Centrifuge 5810 | Eppendorf | 5810 000.017 | |
| Incubator shaker | New Brunswick Scientific | M1246-0006 | |
| Low temperature incubator 815 | Precision Scientific | J1790-1B | |
| Stereomicroscope | Olympus | SZX12 | |
| Petri dish 35 x 10 mm | Fisher Scientific | NC9434271 | |
| 12-well Tissue culture plate | BD Falcon | REF 353043 |
References
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