Summary
Tillvägagångssätt för att testa effekterna av antipsykotiska läkemedel (APD) i Caenorhabditis elegans demonstreras. Analyser beskrivs för att testa läkemedelseffekter på utveckling och livskraft och på svalgpumphastighet. Dessa metoder är också tillämpliga för farmakogenetiska experiment med andra än APDs läkemedelsklasser.
Abstract
Caenorhabditis elegans är en enkel genetisk organism mottaglig för storskaliga framåt och bakåt genetiska skärmar och kemiska genetiska skärmar. The C. elegans genomet innefattar potentiell antipsykotisk drog (APD) mål konserverade hos människor, inklusive gener som kodar för proteiner som krävs för neurotransmittersyntesen och för synaptisk struktur och funktion. APD exponering ger utvecklingsförsening och / eller dödlighet i nematoder på ett koncentrationsberoende sätt. Dessa fenotyper orsakas delvis av APD-inducerad hämning av svalg pumpa 1,2. Sålunda har utvecklings fenotyp en neuromuskulär basis, vilket gör det lämpligt för farmakogenetiska studier av neuroleptika. Här kan vi visa detaljerade förfaranden för testning APD effekter på nematod utveckling och svalg pumpning. För utvecklingsanalys, synkroniseras embryon som placeras på nematod tillväxtmedium (NGM) plattor som innehåller APDs, och de olika stadierna i utvecklingen av animals därefter görs dagligen. För analys av svalgpumphastigheten, iscensatt unga vuxna djur testas på NGM plattor innehållande APDs. Antalet pharyngeal pumpar per tidsenhet registreras och pumpningshastigheten beräknas. Dessa analyser kan användas för att studera många andra typer av små molekyler eller till och med stora molekyler.
Introduction
Caenorhabditis elegans är en enkel genetisk organism mottaglig för storskaliga framåt och bakåt genetiska skärmar och kemiska genetiska skärmar. C. elegans är känslig för ett brett spektrum av bioaktiva föreningar och har därför använts med framgång för att definiera mekanismen av handlingen av en mängd sådana föreningar. Till exempel, bioaktiva föreningar studeras med hjälp av snäckfarmakogenetik innefattar acetylkolin receptor-agonister (t.ex. levamisol, nikotin, morantel och pyrantel), bedövningsmedel (t.ex. halotan), koffein, kolinesterashämmare (t ex aldikarb, lannate och triklorfon), fluorid, GABA-relaterade föreningar (t.ex. GABA och muscimol), ivermektin, parakvat, forbolestrar och serotoninrelaterade läkemedel (t.ex. serotonin och imiprimine) 3. Vidare C. elegans har använts för stora små molekyler skärmar, vilket gör upptäckten av nya bioaktiva förenings och identifiering av nya genetiska mål 4.
The C. elegans genomet innehåller potentiella antipsykotiska läkemedel (APD) mål bevarade hos människor, inklusive gener som kodar för proteiner som krävs för signalsubstansen syntes och för synaptiska struktur och funktion 5. Sålunda C. elegans Neurogenetik och neurobiologi erbjuder metoder för att upptäcka nya molekylära verkningsmekanismer av APD. I nematoder, APD exponering tidigt i utveckling ger utvecklingsförsening, och vid högre koncentrationer, dödlighet 2,6. APD exponering under vuxenlivet ger beteendemässiga fenotyper. Exempelvis hämmar klozapin exponering locomotion och svalg pumpa och förbättrar äggläggning 1,2,7.
APD-inducerad utvecklingsförsening och dödlighet är kraftfulla fenotyper för storskaliga kemiska genetiska skärmar. Dessa fenotyper är komplexa i den mån de sannolikt har mer än en cell-och genetiska basier. Därför är sådana genetiska skärmar förväntas ge en mängd olika läkemedelsmål indirekt. Dock har vårt laboratorium genomfört kandidatgenen skärmar och en genomet hela RNAi skärm för dämpning av APD-inducerad utvecklingsförsening och dödlighet och har framgångsrikt återhämtat gener som sannolikt kodar direkta mål, bland annat dopamin, insulin, och nikotinacetylkolinreceptorer 2,8. Genetiska skärmar baserade på APD-inducerade beteenden i vuxen har också lett till identifiering av nya APD mål, och vi är nu validering av nya från både utvecklings-och beteende skärmar i däggdjur 7. Således verkar en ryggradslös kemisk genetisk metod för att upptäcka nya molekylära verkningsmekanismer för APDs vara genomförbart 5,8.
The C. elegans svalget är ett organ som omfattar 20 neuroner, 20 muskelceller, och 20 hjälpceller, insvept av en basalmembran. I likhet med däggdjur hjärta, är svalget autonoma and pumpar ständigt mat i från den yttre miljön 9. Hämning av svalg pumphastigheten äventyrar livsmedelsupptag, och därmed mutationer eller läkemedel som hämmar svalg pumpning orsaka utvecklingsförsening eller gripa 9. APDs hämmar svalgpumphastigheten och står delvis för deras effekter på utveckling och livskraft 1,2. Här använder vi den atypiska APD klozapin som ett exempel för att påvisa drog analyser för nematod utveckling och svalg pumpning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Developmental Delay / Leta analys: vildtyp (N2) och två Mutant (Mut1 och Mut2) Stammar testas i tre klozapin Halter i en 12-brunnar
- På dag 1, häll 2 ml NGM mediet 10 i varje brunn i en 12-brunnsplatta (varje brunn med en 2 cm diameter) och låt härda på bänken vid rumstemperatur (RT) över natten. Samma dag plocka en koloni av Escherichia coli OP50 bakterier infekterar en flaska av 50 ml LB-lösning och kultur den i en 37 ° C skakapparat vid 220 varv per minut rotation över natt.
- På dag 2, överför 20 pl OP50 bakteriekultur på mitten av varje NGM väl. Inkubera plattorna i en 37 ° C inkubator eller lämna dem vid rumstemperatur över natten för att tillåta bakteriemattan att växa tjockare.
- Gör en 80 mM klozapin stamlösning genom att lösa klozapin i DMSO (dimetylsulfoxid) lösningsmedel. Gör sedan en 80 l arbetslösning med stamlösningen späds i 1,7 mM ättiksyra bå grundval av tabell 1.
Obs: Arbets lösningen för ett visst läkemedel av intresse måste bestämmas genom att göra en serie tester preliminära koncentration för att hitta den mest lämpliga koncentrationen för att skilja den vilda typen av mutanter. - Överför 80 pl klozapin arbetslösning på den seedade NGM plattan väl och snurra plattan att låta lösningen att fördela jämnt på ytan. Vänta på plattan för att torka. Använd plattan för analysen på samma dag eller placera den i ett 20 ° C inkubator för att användas nästa dag.
Obs: Arbetslösning är en läkemedelssuspension på grund av den låga lösligheten av klozapin, speciellt vid högre koncentration. Därför vortexblanda röret innan överföring av lösningen till drogen plattan för att säkerställa att läkemedelskoncentrationen är korrekt. - Tvätta maskar bort en 3,5 cm platta som innehåller många gravida vuxna med M9 buffert och sedan snurra ner dem i en 15 ml tubvid 2000 rpm under 1 min.
- Aspirera supematanten. Tillsätt 5 ml blekmedel (NaOH: hypoklorit: DDH 2 O kl 04:01:05) och störa de nematoder genom att försiktigt vända rören.
- Observera djuren tills hälften av dem löses i ca 5 min. Spinn ner äggen vid 2000 rpm i 1 minut.
- Aspirera supernatanten och tillsätt 14 ml M9 buffert snabbt.
- Centrifugera ner äggen vid 2000 rpm under 1 min och aspirera supernatanten och lämna ungefär 100 | il lösning. Vortex att skjuta äggen.
- Överför 2 pl ägg suspenderade i M9 på en vanlig NGM platta för att testa hur många ägg överförs. Justera volymen för de suspenderade äggen för att se till att det finns cirka 30-35 ägg i varje överföring. Överför 30-35 ägg till varje brunn i analysplattan och sedan inkubera i en 20 ° C inkubator i 24 timmar.
- På den första dagen för analysen, poäng antalet ägg kläckta. Justera det totala antalet kläckta djur att 25/well genom picking av de extra maskar om det behövs.
- På de följande dagarna, observera djur och göra dem varje 24 timmar. Develop skede görs baserat på storleken på djuret och formen hos vulvan 11. Försöket varar i 5-6 dagar med den mest robusta effekten normalt sett på den tredje eller fjärde dag.
- Mata in data i en Excel-fil och beräkna andelen djur vid varje utvecklingsstadium för varje dag av experimentet. Generera grafer med funktionen '100% Staplad kolumn "i kolumnen '2-D"-menyn.
2. Pharyngeal Pump analys: unga vuxna djur för vildtyp och muterade stammar görs på Clozapine analysplattor
- Analysplattan är tillverkad i enlighet med samma protokoll som används för analys av utvecklingsförsening / dödlighet.
- Pick 50 L4 djur för varje stam till ympade NGM plattor 24 h före analysen och inkubera maskarna vid 20 ° C.
- Pick 10 djur till en assay plattan väl. Sedan plocka 10 djur till nästa väl varje 15-20 min.
- När djuren i den första brunnen har utsatts för läkemedel under 30 minuter, startar analysen genom att observera svalg pumpning i en dissektion mikroskop och poäng pumparna för 20 sek 9. När svalg pumpning görs, plocka masken av plattan.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
1. Utvecklingsförsening / dödlighet analysresultat
Ett typiskt resultat för analys av utvecklingsförsening / dödlighet demonstreras i figur 1a och 1b. När vildtyp djur i kontrollgruppen har vuxit till en dräktig vuxenstadiet (Figur 1a), vildtyp djur som exponerats för klozapin är fortfarande i unga larvstadier eller är döda (Figur 1b). Figur 1c visar ett representativt resultat att jämföra en suppressor mutant (Mut1) och en förstärkare mutant (Mut2) med vildtypen vid tre olika klozapin koncentrationer. Vid alla tre klozapin koncentrationer, är dödligheten i Mut1 lägre än vildtypen och dödlighet i Mut2 är högre. Överlevande Mut1 djur vidare till mer avancerade larvstadier än vildtypen, medan överlevande Mut2 djur visar utvecklingsförsening jämfört med vildtypen. </ P>
2. Pharyngeal pumpningshastighet analysresultatet
Figur 2 visar en representativ faryngeal pumpningsanalysresultatet att jämföra en suppressor-mutant (Mut1) och en enhancer-mutanten (Mut2) med vildtypen vid två klozapin koncentrationer. Klozapin exponering minskar svalgpumpningshastigheterna för vildtyp och muterade stammar i ett koncentrationsberoende sätt. Emellertid är den minskade svalgpumpningshastighet av Mut1 mindre än den hos den vilda typen, medan den minskade svalgpumpningshastighet av Mut2 är större än den hos den vilda typen.
Figur 1. Demonstration av klozapin-inducerad utvecklingsförsening och dödlighet. Vildtyp djur (N2) odlas på en kontroll NGM platta (a) och på en NGM platta kompletterat med 200 | ig / ml (612 | iM) klozapin (b). (C) Ett representativt resultat av analysen av utvecklingsförsening / dödlighet visar klozapin påverkan på vildtyp (N2), en suppressor mutant (Mut1), samt en förstärkare mutant (Mut2). Bilderna i (a) och (b) återges < http://www.nature.com/npp/journal/v34/n8/full/npp200935a.html > från Neuropsychopharmacology. 34 (8), 1968-1978 (juli , 2009). Klicka här för att visa en större bild .
ig1.jpg "width =" 600px "/>
Figur 2. Demonstration av klozapin-inducerad hämning av svalg pumpning. Ett typiskt resultat för svalgpumpnings assay visar klozapin effekt på vildtyp (N2), en suppressor-mutanten (Mut1) och en enhancer-mutanten (Mut2). Data analyserades med tvåvägs ANOVA med hjälp av statistikprogrammet R. Klicka här för att visa en större bild .
Tabell 1. Beredning av arbetslösning av klozapin. Beloppet är för 4 brunnar vid varje koncentration.
| Clozapine koncentration | 0 pM | 300 pM | 400 pM | 500 pM |
|---|---|---|---|---|
| HAC lösning | 270 | il | 270 | il | 270 | il | 270 | il |
| Clozapine stamlösning | - | 30 | il | 40 | il | 50 | il |
| DMSO | 50 | il | 20 | il | 10 | il | 0 il |
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Här beskriver vi metoder för att testa effekterna av APDs på utveckling och beteende hos C. elegans. DMSO eller etanol användes för att upplösa klozapin, eftersom läkemedlet är relativt olösligt i vatten. Eftersom lösningsmedel har rapporterats påverka C. elegans biologi 12, DMSO-alone eller etanol enbart kontrollgrupper är viktiga. Den högsta koncentrationen av DMSO som används i våra analyser är upp till 3%, vilket inte har någon uppenbar effekt på C. elegans-utveckling. DMSO kan användas för många små molekyler, eller till och med några stora molekyler, t.ex. lipid syror.
APD-koncentrationer som användes i dessa analyser är högre än de som ges till människor. Detta är vanligt för de flesta små molekyler studier i C. elegans, eftersom höga koncentrationer erfordras för penetrering av C. elegans ytterhud. HPLC-studier tyder på att nivåerna av klozapin i C. elegans vävnad i utvecklings assay är nära de som förväntas i mänskliga hjärnor 2.
Penetration av nagelband är ett särskilt bekymmer för studier av stora molekyler. Mutanter med defekter i nagelbanden barriären, såsom ACS-20 mutanter och Bus (B acterially U n-S wollen) mutanter, erbjuder ett sätt att kringgå detta problem 13. Buss mutanter har isolerats på basis av deras resistens mot infektion genom patogenen Microbacterium nematophilum. Till exempel, svaga alleler av buss-8 visar att denna gen spelar en roll i produktionen av nagelband yta. Dessa mutanter är resistenta mot infektion, på grund av att bakterien inte kan binda till den mottagande ytan. Viktigt är störningar i nagelbandsbildning orsakar också ökad läkemedelskänslighet i denna genetiska bakgrund 14.
Den utvecklings analys som beskrivs här kan skalas upp för stora genetiska skärmar genom att utföra analysen i flytande kulture. För genomet hela RNA-interferens (RNAi) skärmar, till exempel, är det protokoll som liknar det som beskrivits ovan, men som matar RNAi bakterier substituerar OP50 bakterier 15. Analysen flytande kultur kräver en lägre läkemedelskoncentration än plattanalys (opublicerad observation). Vårt laboratorium utfört en sådan genomet hela RNAi skärm för dämpning av klozapin-inducerad utvecklingsförsening och fick 40 dämpning från en skärm på ~ 17.000 C. elegans gener 8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att det inte finns intresse konflikt inblandade.
Acknowledgments
Arbetet stöddes av en NIH Clinical Scientist Utveckling utmärkelse K08NS002083, en Shervert Frazier Forskningsinstitut Grant, och en NARSAD Young Investigator Award till Edgar A. Buttner.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Clozapine | Sigma | C6305 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | D8418 | |
| Acetic acid (HAC) | Fisher | BP2401 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | EMD | SX0590-13 | |
| Hypochlorite | Sigma-Aldrich | 425044 | |
| Centrifuge 5810 | Eppendorf | 5810 000.017 | |
| Incubator shaker | New Brunswick Scientific | M1246-0006 | |
| Low temperature incubator 815 | Precision Scientific | J1790-1B | |
| Stereomicroscope | Olympus | SZX12 | |
| Petri dish 35 x 10 mm | Fisher Scientific | NC9434271 | |
| 12-well Tissue culture plate | BD Falcon | REF 353043 |
References
- Donohoe, D. R., Jarvis, R. A., Weeks, K., Aamodt, E. J., Dwyer, D. S. Behavioral adaptation in C. elegans produced by antipsychotic drugs requires serotonin and is associated with calcium signaling and calcineurin inhibition. Neurosci. Res. 64, 280-289 (2009).
- Karmacharya, R., et al. Clozapine interaction with phosphatidyl inositol 3-kinase (PI3K)/insulin-signaling pathway in Caenorhabditis elegans. Neuropsychopharmacology. 34, 1968-1978 (2009).
- Rand, J. B., Johnson, C. D. Carnorhabditis elegans Modern Biological Analysis of an Organism. Estein, H. F., Shakes, D. C. 48, Academic Press, Inc.. 187-204 (1995).
- Kwok, T. C., et al. A small-molecule screen in C. elegans yields a new calcium channel antagonist. Nature. 441, 91-95 (2006).
- Wang, X., Sliwoski, G. R., Buttner, E. A. The relevance of Caenorhabditis elegans genetics for understanding human psychiatric disease. Harv. Rev. Psychiatry. 19, 210-218 (2011).
- Donohoe, D. R., Aamodt, E. J., Osborn, E., Dwyer, D. S. Antipsychotic drugs disrupt normal development in Caenorhabditis elegans via additional mechanisms besides dopamine and serotonin receptors. Pharmacol. Res. 54, 361-372 (2006).
- Karmacharya, R., et al. Behavioral effects of clozapine: involvement of trace amine pathways in C. elegans and M. musculus. Brain Res. 1393, 91-99 (2011).
- Saur, T., et al. A Genome-Wide RNAi Screen in Caenorhabditis elegans Identifies the Nicotinic Acetylcholine Receptor Subunit ACR-7 as an Antipsychotic Drug Target. PLoS Genet. 9, (2013).
- Avery, L., You, Y. J. C. elegans feeding. WormBook, ed. The C. elegans Research Community, doi:10.1895/wormbook.1.150.1. , Available from: http://www.wormbook.org (2012).
- Chaudhuri, J., Parihar, M., Pires-daSilva, A. An introduction to worm lab: from culturing worms to mutagenesis. J Vis Exp. 47, (2011).
- Lewis, J. A., Fleming, J. T. Carnorhabditis elegans Modern Biological Analysis of an Organism. Estein, H. F., Shakes, D. C. 48, Academic Press, Inc.. 3-29 (1995).
- Davis, J. R., Li, Y., Rankin, C. H. Effects of developmental exposure to ethanol on Caenorhabditis elegans. Alcohol Clin. Exp. Res. 32, 853-867 (2008).
- Kage-Nakadai, E., et al. Two very long chain fatty acid acyl-CoA synthetase genes, acs-20 and acs-22, have roles in the cuticle surface barrier in Caenorhabditis elegans. PLoS One. 5, (2010).
- Partridge, F. A., Tearle, A. W., Gravato-Nobre, M. J., Schafer, W. R., Hodgkin, J. The C. elegans glycosyltransferase BUS-8 has two distinct and essential roles in epidermal morphogenesis. Dev. Biol. 317, 549-559 (2008).
- Leung, C. K., Deonarine, A., Strange, K., Choe, K. P. High-throughput screening and biosensing with fluorescent C. elegans strains. J. Vis. Exp. (51), (2011).
