Summary
Approcci per testare gli effetti dei farmaci antipsicotici (APD) in Caenorhabditis elegans sono dimostrati. I dosaggi sono descritti per testare gli effetti della droga sullo sviluppo e la redditività e sulla faringe velocità di pompaggio. Questi metodi sono applicabili per esperimenti di farmacogenetica con classi di farmaci diversi da APD anche.
Abstract
Caenorhabditis elegans è un organismo semplice genetica suscettibili di larga scala in avanti e retromarcia schermi genetici e schermi genetici chimici. La C. elegans genoma include potenziale farmaco antipsicotico (APD) obiettivi conservati negli esseri umani, compresi i geni che codificano le proteine necessarie per la sintesi dei neurotrasmettitori e per la struttura e la funzione sinaptica. L'esposizione APD produce ritardo di sviluppo e / o letalità in nematodi in modo concentrazione-dipendente. Questi fenotipi sono causati, in parte, mediante inibizione APD-indotta faringeo pompaggio 1,2. Così, il fenotipo di sviluppo ha una base neuromuscolare, rendendolo utile per studi di farmacogenetica dei neurolettici. Qui mostriamo le procedure dettagliate per testare gli effetti APD sullo sviluppo nematode e della faringe pompaggio. Per il saggio di sviluppo, gli embrioni sincronizzati sono immessi sul (NGM) piastre contenenti APD nematode mezzo di crescita, e le fasi di sviluppo di animali vengono quindi segnati giornalmente. Per il saggio faringeo tasso di pompaggio, in scena giovani animali adulti sono testati su piastre NGM contenenti APD. Il numero di pompe faringei per unità di tempo viene registrato, e la velocità di pompaggio è calcolato. Questi saggi possono essere utilizzati per studiare molti altri tipi di piccole molecole o anche grandi molecole.
Introduction
Caenorhabditis elegans è un organismo semplice genetica suscettibili di grandi schermi genetiche in avanti e all'indietro e schermi genetici chimici. C. elegans è sensibile ad un ampio spettro di composti bioattivi e pertanto è stato usato con successo per definire i meccanismi di azione di una varietà di tali composti. Ad esempio, i composti bioattivi studiate usando farmacogenetica vermi sono agonisti del recettore dell'acetilcolina (ad esempio Levamisolo, nicotina, morantel, e Pyrantel), anestetici (es. alotano), la caffeina, gli inibitori della colinesterasi (ad esempio aldicarb, Lannate, e triclorfon), fluoruro, GABA-correlate composti (ad esempio GABA e muscimolo), ivermectina, paraquat, esteri del forbolo, e farmaci serotonina legati (es. serotonina e imiprimine) 3. Inoltre, C. elegans è stato usato per grandi schermi piccole molecole, permettendo scoperta di nuovi composti bioattivis e identificazione di nuovi bersagli genetici 4.
La C. elegans genoma include potenziale farmaco antipsicotico (APD) obiettivi conservati negli esseri umani, compresi i geni che codificano le proteine necessarie per la sintesi dei neurotrasmettitori e per la struttura e la funzione sinaptica 5. Così, C. elegans neurogenetica e offrono neurobiologia metodi per la scoperta di nuovi meccanismi molecolari d'azione di APD. In nematodi, l'esposizione APD precoce dello sviluppo produce ritardo dello sviluppo, e a concentrazioni più elevate, letalità 2,6. L'esposizione APD durante l'età adulta produce fenotipi comportamentali. Ad esempio, l'esposizione clozapina inibisce la locomozione e faringea pompaggio e migliora la deposizione delle uova 1,2,7.
APD-indotta ritardo e letalità dello sviluppo sono fenotipi potenti per grandi schermi genetici chimici. Questi fenotipi sono complesse nella misura in cui probabilmente hanno più di un BASI cellulari e geneticis. Pertanto, tali schermi genetici dovrebbero produrre una varietà di bersagli indiretti droga. Tuttavia, il nostro laboratorio ha condotto candidati schermi di geni e uno schermo RNAi genome-wide per soppressori di APD indotta ritardi e letalità dello sviluppo e ha recuperato con successo geni che codificano probabili bersagli diretti, tra cui la dopamina, l'insulina, e recettori nicotinici 2,8. Schermi genetici basati sui comportamenti APD-indotte nel adulti hanno portato anche all'identificazione di nuovi bersagli APD, e ora stiamo convalida bersagli dagli schermi sia sviluppo e comportamentali nei mammiferi 7. Così, un approccio invertebrato chimica genetica per scoprire i meccanismi molecolari d'azione delle APD sembra essere fattibile 5,8.
La C. elegans faringe è un organo che include 20 neuroni, cellule muscolari, 20 e 20 cellule accessorie, avvolto da una membrana basale. Simile al cuore dei mammiferi, la faringe è un autonomond pompe costantemente cibo dall'ambiente esterno 9. L'inibizione del tasso di pompaggio faringeo compromette l'assorbimento di cibo, e quindi le mutazioni o farmaci che inibiscono faringeo pompaggio causa ritardo nello sviluppo o arresto 9. APD inibiscono il tasso faringeo di pompaggio, che rappresentano in parte per i loro effetti sullo sviluppo e la redditività 1,2. Qui, usiamo il atipico APD clozapina come esempio per dimostrare saggi di droga per lo sviluppo nematode e della faringe pompaggio.
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Protocol
1. Developmental Delay / letalità saggio: The Wild-Type (N2) e due Mutant (Mut1 e Mut2) ceppi sono stati testati in tre Clozapina concentrazioni in un 12-pozzetti
- Il giorno 1, versare 2 ml NGM medio 10 in ciascun pozzetto di una piastra 12 pozzetti (ogni pozzetto con un diametro di 2 cm) e lasciare indurire sul banco a temperatura ambiente (RT) per una notte. Lo stesso giorno, scegliere una colonia di batteri Escherichia coli OP50, infettare un flacone di 50 ml di soluzione LB, e la cultura in uno shaker 37 ° C a 220 giri al minuto di rotazione durante la notte.
- Il giorno 2, trasferire 20 microlitri coltura batterica OP50 sul centro di ogni NGM bene. Incubare le piastre in un incubatore a 37 ° C o lasciarli a temperatura ambiente nella notte per consentire il prato batterica di crescere più spessa.
- Fare un clozapina soluzione stock 80 mM sciogliendo clozapina in DMSO (dimetilsolfossido) solvente. Poi fare una soluzione operativa 80 microlitri di soluzione madre diluita in 1.7 mM acido acetico based nella Tabella 1.
Nota: La soluzione di lavoro per un particolare farmaco di interesse deve essere determinato effettuando una serie di prove preliminari di concentrazione per determinare la concentrazione più adeguato per distinguere il tipo selvaggio dai mutanti. - Trasferimento 80 microlitri clozapina soluzione di lavoro sulla piastra NGM seminato bene e agitare la piastra per consentire alla soluzione per distribuire uniformemente sulla superficie. Attendere che la piastra si asciughi. Utilizzare la piastra per il saggio lo stesso giorno o metterla in un incubatore a 20 ° C da utilizzare il giorno successivo.
Nota: La soluzione di lavoro è una sospensione farmaco a causa della bassa solubilità della clozapina, soprattutto a maggiore concentrazione. Pertanto, agitare la provetta prima di trasferire la soluzione alla piastra farmaco per garantire che la concentrazione di farmaco è accurato. - Lavare i vermi fuori un piatto 3,5 centimetri contenente molti adulti gravide con tampone M9 e poi girare giù in una provetta da 15 mla 2.000 rpm per 1 min.
- Aspirare il surnatante. Aggiungere 5 ml di soluzione di candeggina (NaOH: ipoclorito: DDH 2 O a 4:01:05) e disturbare i nematodi invertendo delicatamente i tubi.
- Osservare gli animali fino a metà di essi vengono sciolti a circa 5 min. Spin giù le uova a 2.000 rpm per 1 min.
- Aspirare il surnatante e aggiungere rapidamente 14 ml di tampone M9.
- Spin giù le uova a 2.000 rpm per 1 min e aspirare il surnatante, lasciando circa 100 microlitri soluzione. Vortex per sospendere le uova.
- Transfer 2 uova microlitri sospesi in M9 su una piastra NGM regolare per testare quante uova sono trasferiti. Regolare il volume delle uova sospese per garantire che ci sono circa 30-35 uova per ogni trasferimento. Trasferire 30-35 uova in ciascun pozzetto della piastra di dosaggio e quindi incubare in un incubatore a 20 ° C per 24 ore.
- Il primo giorno del test, segnerà il numero di uova schiuse. Regolare il numero totale di animali nati per 25/well da picking fuori i vermi supplementari, se necessario.
- Nei giorni successivi, osservare gli animali e il punteggio loro ogni 24 ore. Stadio di sviluppo è ottenuto in base alla dimensione dell'animale e la forma della vulva 11. L'esperimento dura 5-6 giorni con l'effetto più robusto genere visto il terzo o quarto giorno.
- Inserire i dati in un file di Excel e calcolare la percentuale di animali in ogni fase di sviluppo per ogni giorno dell'esperimento. Generare grafici con la funzione di '100% Stacked Colonna 'in '2-D colonna' menu.
2. Faringeo pompaggio saggio: Giovane adulto Animals per il wild-type e mutanti ceppi sono segnati a tavola Clozapina Assay
- La piastra di saggio viene effettuata seguendo lo stesso protocollo usato per il saggio ritardo dello sviluppo / letalità.
- Accompagnamento 50 L4 animali per ogni ceppo di piastre NGM seminati 24 ore prima del dosaggio e incubare i vermi a 20 ° C.
- Scegli 10 animali ad un assay pozzetti. Poi scegliere 10 animali al prossimo bene ogni 15-20 min.
- Dopo gli animali del primo pozzo sono stati esposti al farmaco per 30 minuti, iniziare l'analisi osservando faringeo pompaggio sotto un microscopio dissezione e segnare le pompe per 20 secondi 9. Una volta faringea pompaggio è segnato, scegliere il verme dalla piastra.
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Representative Results
1. Il ritardo dello sviluppo / letalità risultato del test
Un risultato tipico per il dosaggio ritardo dello sviluppo / letalità è dimostrato nelle figure 1a e 1b. Quando wild-type animali del gruppo di controllo sono cresciuti allo stadio adulto gravida (Figura 1a), wild-type animali esposti a clozapina sono ancora nelle giovani stadi larvali o sono morti (Figura 1b). Figura 1c mostra un risultato rappresentativo confronto un mutante soppressore (Mut1) e un mutante enhancer (Mut2) con il tipo selvaggio a tre diverse concentrazioni di clozapina. In tutti e tre concentrazioni clozapina, la letalità di Mut1 è inferiore wild type e la letalità di Mut2 è maggiore. Sopravvivere animali Mut1 progrediscono verso stadi larvali più avanzate di tipo selvaggio, mentre gli animali sopravvissuti Mut2 visualizzare ritardo nello sviluppo rispetto al wild-type. </ P>
2. Tasso faringeo pompaggio risultato del test
La Figura 2 mostra un rappresentante faringea pompaggio risultato del dosaggio confrontando un mutante soppressore (Mut1) e un mutante enhancer (Mut2) con il tipo selvatico a due concentrazioni clozapina. L'esposizione clozapina riduce i tassi di pompaggio faringei delle wild-type e mutanti ceppi in maniera concentrazione-dipendente. Tuttavia, la velocità di pompaggio faringea diminuito di Mut1 è inferiore a quella del tipo selvatico, mentre la velocità di pompaggio faringea diminuito di Mut2 è maggiore di quella del tipo selvatico.
Figura 1. Dimostrazione della clozapina indotta ritardo e la letalità dello sviluppo. Animali wild-type (N2) coltivate su un controllo Piastra NGM (a) e su una piastra NGM supplementato con 200 ug / ml (612 mM) clozapina (b). (C) Un risultato rappresentativo del saggio ritardo dello sviluppo / letalità mostra l'effetto della clozapina dal tipo selvatico (N2), un mutante soppressore (Mut1), e un mutante enhancer (Mut2). Le immagini in (a) e (b) vengono ristampati < http://www.nature.com/npp/journal/v34/n8/full/npp200935a.html > da Neuropsychopharmacology. 34 (8), 1968-1978 (luglio , 2009). Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita .
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Figura 2. Dimostrazione di inibizione indotta da clozapina di faringeo pompaggio. Un risultato tipico per il dosaggio faringea pompaggio che mostra l'effetto della clozapina dal tipo selvatico (N2), un mutante soppressore (Mut1), e un mutante enhancer (Mut2). I dati sono stati analizzati con ANOVA a due vie tramite il software statistico R. programma Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita .
Tabella 1. Preparazione della soluzione di lavoro di clozapina. L'importo è di 4 pozzi per ogni concentrazione.
| Concentrazione Clozapina | 0 micron | 300 micron | 400 micron | 500 micron |
|---|---|---|---|---|
| Soluzione HAC | 270 microlitri | 270 microlitri | 270 microlitri | 270 microlitri |
| Clozapina soluzione stock | - | 30 microlitri | 40 microlitri | 50 microlitri |
| DMSO | 50 microlitri | 20 microlitri | 10 microlitri | 0 microlitri |
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Discussion
Qui, descriviamo metodi per testare gli effetti della APD sullo sviluppo e comportamento di C. elegans. DMSO o etanolo è usato per sciogliere clozapina, in quanto il farmaco è relativamente insolubile in acqua. Dato che i solventi sono stati segnalati per influenzare C. elegans biologia 12, DMSO-alone o gruppi di controllo etanolo-alone sono essenziali. La massima concentrazione di DMSO utilizzata nei nostri test è fino al 3%, che non ha un effetto evidente sul C. elegans sviluppo. DMSO può essere usato per molte piccole molecole, o addirittura alcune grandi molecole, ad esempio acidi lipidici.
Concentrazioni APD utilizzati in questi test sono superiori a quelle indicate per l'uomo. Questo è comune per la maggior parte degli studi di piccole molecole in C. elegans, poiché alte concentrazioni sono necessarie per la penetrazione del C. elegans cuticola. HPLC studi indicano che i livelli di clozapina in C. tessuto elegans nel assa sviluppoy sono vicini a quelli attesi nel cervello umano 2.
La penetrazione della cuticola è una preoccupazione particolare per lo studio di molecole di grandi dimensioni. Mutanti con difetti nella barriera cuticola, come ACS-20 mutanti e bus (B acterially U n-S wollen) mutanti, offrono un approccio per aggirare questo problema 13. Bus mutanti sono stati isolati in base alla loro resistenza alle infezioni dal nematophilum patogeno Microbacterium. Ad esempio, alleli deboli del bus-8 dimostrano che questo gene svolge un ruolo nella produzione della superficie della cuticola. Questi mutanti sono resistenti alle infezioni, perché il batterio non può legarsi alla superficie ospitante. È importante sottolineare che, interruzione della formazione cuticola provoca anche una maggiore sensibilità ai farmaci in questo contesto genetico 14.
Il saggio di sviluppo qui descritto può essere scalato per schermi genetici su larga scala eseguendo il test in cul liquidori. Per interferenza RNA genoma di ampiezza schermi (RNAi), per esempio, il protocollo è simile a quello descritto sopra, ma alimentando batteri RNAi è sostituito da batteri OP50 15. Il saggio di coltura liquido richiede una concentrazione della droga inferiore al saggio piastra (osservazioni non pubblicate). Il nostro laboratorio ha eseguito una tale schermo RNAi genome-wide per soppressori di ritardo dello sviluppo indotta da clozapina e ottenuto 40 soppressori da uno schermo di ~ 17.000 C. elegans geni 8.
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Disclosures
Gli autori dichiarano che non vi sia conflitto di interesse coinvolti.
Acknowledgments
Il lavoro è stato supportato da un NIH premio Sviluppo Scienziato Clinico K08NS002083, un Shervert Frazier Research Institute Grant, e un NARSAD Young Investigator Award di Edgar A. Buttner.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Clozapine | Sigma | C6305 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | D8418 | |
| Acetic acid (HAC) | Fisher | BP2401 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | EMD | SX0590-13 | |
| Hypochlorite | Sigma-Aldrich | 425044 | |
| Centrifuge 5810 | Eppendorf | 5810 000.017 | |
| Incubator shaker | New Brunswick Scientific | M1246-0006 | |
| Low temperature incubator 815 | Precision Scientific | J1790-1B | |
| Stereomicroscope | Olympus | SZX12 | |
| Petri dish 35 x 10 mm | Fisher Scientific | NC9434271 | |
| 12-well Tissue culture plate | BD Falcon | REF 353043 |
References
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