Summary
الخلايا النجمية هي واحدة من اللاعبين الرئيسيين الأكثر أهمية في الجهاز العصبي المركزي (CNS). هنا، نحن الإبلاغ عن طريقة عملية من تلاعب الحصين بروتوكول ثقافة نجمية من أجل دراسة الآليات الكامنة وراء وظيفة نجمية في الذكور والإناث الجراء الوليد بعد في المختبر نقص التروية.
Abstract
دباق النجمي التالية نقص الأكسجة / نقص التروية (مرحبا) إصابات الدماغ ذات الصلة ب يلعب دورا في زيادة معدلات الاعتلال والوفيات عند الولدان. وتشير الدراسات السريرية الحديثة أن شدة إصابات الدماغ يبدو أن ممارسة الجنس تعتمد، وأن الولدان الذكور أكثر عرضة لآثار إصابات الدماغ المرتبطة مرحبا، مما أدى إلى نتائج عصبية أشد بالمقارنة مع الإناث مع إصابات الدماغ قابلة للمقارنة. تطوير وسائل موثوق بها لعزل والمحافظة على السكان عالي التخصيب من الخلايا النجمية الحصين بالغت أمر ضروري لفهم الأساس الخلوي للفروق بين الجنسين في النتائج المرضية مرحبا حديثي الولادة. في هذه الدراسة، ونحن تصف طريقة لخلق الجنس الثقافات نجمية الحصين المحددة التي تتعرض للنموذج في المختبر نقص التروية، والحرمان من الأوكسجين الجلوكوز، تليها عودة التأكسج. تم فحص دباق النجمي رد الفعل لاحق من immunostaiنينغ للبروتين الدبقية ييفي الحمضية (GFAP) وS100B. هذا الأسلوب يوفر أداة مفيدة لدراسة دور الذكور والإناث النجمية الحصين التالية مرحبا حديثي الولادة، كل على حدة.
Introduction
الخلايا النجمية هي واحدة من اللاعبين الرئيسيين الأكثر أهمية في الجهاز العصبي المركزي (CNS). متزايد من الأدلة يشير إلى أن أدوار الخلايا النجمية هي أكثر من مجرد تقديم الدعم العصبية. في الواقع، يمكن للأدوار الخلايا النجمية في ظل الظروف الفسيولوجية تكون معقدة جدا، مثل توجيه الهجرة من محاور تطوير 1، وتنظيم الجهاز العصبي المركزي تدفق الدم 2، والحفاظ على توازن درجة الحموضة في السائل الخلالي متشابك 3، والمشاركة في حاجز الدم في الدماغ 4 وانتقال متشابك 5. في ظل ظروف مرضية، النجمية تستجيب للإصابة مع عملية تسمى دباق النجمي رد الفعل الذي التشكل، عدد، موقع، والطوبوغرافيا (فيما يتعلق المسافة من الإهانة) وظيفة من وظائف الخلايا النجمية قد تتغير بطريقة متجانسة 6،7. دباق النجمي ينظر التالية حديثي الولادة الاعتلال الدماغي نقص تروية ميتة ربما يسهم في الإصابة بالأمراض والوفيات بين حديثي الولادة وتشير الدراسات السريرية والتجريبية الحديثة أن شدة إصابات الدماغ ويبدو أن تعتمد على الجنس وأن الولدان الذكور أكثر عرضة لآثار نقص الأكسجة / نقص التروية (مرحبا) إصابات الدماغ ذات الصلة ب، مما أدى إلى نتائج عصبية أشد بالمقارنة مع الإناث مع إصابات المخ مقارنة 9-11. على الرغم من أن توطين إصابة يعتمد على عمر الحمل ومدة وشدة الإهانة، قرن آمون هو واحد من أكثر المناطق تنفذ عادة في الجهاز العصبي المركزي بعد مرحبا حديثي الولادة المدى، وزيادة تم تأكيد دباق النجمي الحصين بنسبة تصل التنظيم من البروتين الدبقية ييفي الحمضية (GFAP) 3 د بعد مرحبا حديثي الولادة 7،10،12،13. وقد أظهرت الفروق بين الجنسين في وظيفة الخلايا النجمية في كل من حديثي الولادة والقوارض الكبار بعد نقص التروية الدماغية 14،15. وبالإضافة إلى ذلك، فقد تبين قابلية نجمي الذكور إلى نقص التروية في المختبر عن طريق زيادة سلالموت ل بالمقارنة مع الخلايا النجمية القشرية الإناث في الثقافة 16. تبدأ الفروق بين الجنسين في الرحم وتستمر حتى الموت 17. على مدى العقد الماضي، كانت أهمية إدراج الجنسين في ظروف تجريبية في زراعة الخلايا وفي الدراسات المجراة التركيز من معهد الطب والمعاهد الوطنية للصحة لطلب المعرفة الأساسية في الفروق بين الجنسين ينظر في الظروف الفسيولوجية والمرضية 17،18 . تطوير وسائل موثوق بها لعزل والمحافظة على السكان من الخلايا النجمية الحصين بالغت أمر ضروري لفهم الأساس الخلوي للفروق بين الجنسين في النتائج المرضية مرحبا حديثي الولادة. وقد تم تصميم هذه الدراسة لتوفير التقنيات اللازمة لإعداد المخصب مصنفة حسب الجنس الثقافات نجمية الحصين من الفئران حديثي الولادة من أجل تقييم أدوار الخلايا النجمية GFAP-مناعيا التالية الأوكسجين / الجلوكوز الحرمان (OGD) وعودة التأكسج (REOX)، الأمر الذي أدىمرحبا في بيئة زراعة الخلايا. هذه التقنية يمكن استخدامها لاختبار أي فرضية تتعلق النجمية قرن آمون في الذكور والإناث حديثي الولادة في ظل ظروف normoxic والدماغية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ملاحظة: تم إجراء هذه الدراسة وفقا لتوصية دليل لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية من المعهد الوطني للصحة. وتمت الموافقة على بروتوكول الحيوان من جامعة ويسكونسن ماديسون، رعاية الحيوان المؤسسية واللجنة الاستخدام. تم اعتماد بروتوكول الثقافة نجمية الأساسي الذي يرد هنا من البروتوكولات التي قدمها تشانغ Y 19 آخرون. وجنكيز P 20 آخرون مع بعض التعديلات.
1. الحصين تشريح ونجمية الثقافة
- إعداد جميع الكواشف والمواد اللازمة بما في ذلك مقص جراحي، ملقط الدقيقة على نحو سلس، ملقط غيض مسطحة، والمناشف الورقية، كيس النفايات، و 70٪ من الإيثانول و 2 أطباق تشريح (3.5 سم القطر) على الجليد مليئة 2 مل هانك في محلول الملح المتوازن (HBSS) كل . تأكد من أن المعدات الجراحية هم عقيمة (الأوتوكلاف) قبل إجراء واستخدام كل المواد الأخرى (نجمية تصفيح المتوسطة: المصل DMEM + 5٪ حصان +1٪ البنسلين ستربتومايسين، مصل الحصان، HBSS، 0.25٪ التربسين، coverslips الزجاج، أطباق بتري، 15/50 مل أنابيب، قوارير T25، الخ)، وقبل عقيمة.
- عقد بلطف ورذاذ الرأس والرقبة من الجرو الفأر مع الايثانول 70٪ وقطع رأس باستخدام مقص العقيمة حادة [الشكل 1 (1)].
- إجراء شق خط الوسط من الخلفية إلى الأمامية الجمجمة مع مقص صغير على طول فروة الرأس لفضح الدماغ [الشكل 1 (3/2)].
- قطع الجمجمة بعناية من الرقبة إلى الأنف مع مقص صغير. ثم قطع الجمجمة الأمامي إلى بصيلات الشم وأقل شأنا من المخيخ إلى فصل الجمجمة من قاعدة الجمجمة.
- إجراء شق صغير في قاعدة الجمجمة وقطع على طول خط الوسط. استخدام معقم ملقط غيض المسطحة لقشر بعيدا الجمجمة. إزالة جذع الدماغ بمساعدة ملقط منحنية. إزالة الدماغ من الجمجمة ووضع في طبق تشريح الأول [الشكل 1 (9/4)] (2)1.
- باستخدام ملقط المنحنية، والوجه الدماغ بحيث السطح البطني من الدماغ يواجه وحتى ذلك الحين فصل نصفي الكرة الأرضية مع شفرة جراحية معقمة حادة [الشكل 1 (10،11)]
- قم بتقشير نصفي الكرة المخية وبعناية إزالة أنسجة المخ الأوسط والمهادية انتفاخ العقيمة مع ملقط المنحنية المسطحة للكشف الحصين، لذلك، بنية صغيرة على شكل فرس البحر في الفص الصدغي وسطي [الشكل 1 (12-14)].
- إزالة كل الفصوص الحصين [الشكل 1 (15،16)] وتشريح بعناية السحايا من فصوص عن طريق سحب مع ملقط غرامة. هذه الخطوة يتجنب تلوث ثقافة نجمية النهائية من قبل خلايا السحائي والخلايا الليفية.
- نقل فصوص الحصين مستعدة في طبق الثاني مليئة HBSS وإعادته على الجليد [الشكل 1 (17،18)]. تجمع كلا الحصين فصوص من ماوس واحدة (P0 - P2) لإعداد فرس النهرالثقافات campal نجمية. وهذا يعطي كثافة نجمية المناسبة. فرم فصوص قرن آمون باستخدام شفرة جراحية معقمة حادة (حوالي 4 مرات).
- نضح HBSS من الطبق باستخدام طرف العقيمة تعلق على مل ماصة 1 وإضافة 3 مل من التربسين 0.25٪، مزيج، ونقل إلى 15 مل أنبوب مخروطي العقيمة واحتضان الأنسجة عند 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة مع اهتزاز لطيف.
- أنبوب الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 5 دقائق. نضح طاف بعناية باستخدام ماصة زجاجية معقمة تعلق على خط فراغ. إضافة 10 مل نجمية تصفيح المتوسطة ويسحن (20 - 30 مرات) باستخدام النار مصقول ماصة الزجاج حتى التجانس قطعة نسيج.
- أنبوب الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 5 دقائق. طاف نضح وإضافة 2 مل من وسائل الاعلام نجمية الطلاء prewarmed الطازجة. تمر الخلايا من خلال شبكة تصفية 70 ميكرون (مصفاة الخلية) إلى 50 أنبوب جديد مل المخروطية.
- لوحة الخلية تعليق كامل على العقيمة قارورة ثقافة T25 بولي-D-ليسين / Laminin المغلفة التي تحتوي على 3 مل منوسائل الإعلام نجمية الطلاء، ثم احتضان القارورة عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO 2 الحاضنة.
- نضح وسائل الاعلام بأكمله في اليوم-ط ن المختبر (DIV) 1، DIV 3 و DIV 7، واستبدالها مع 2 مل من وسائل الاعلام نجمية طلاء جديدة. مراقبة التقدم والتقاء نجمي الخلايا تحت المجهر الضوئي في كل مرة في حين استبدال وسائل الإعلام نجمية الطلاء.
ملاحظة: في DIV 1، يتم إرفاق جميع الخلايا النجمية قابلة للحياة على سطح القارورة ثقافة والخلايا الميتة أو التي تحتضر والتي تشمل الخلايا العصبية تطفو في طاف. في DIV 3، الخلايا تعلق تبدأ لتقسيم لتشكيل طبقة الخلايا نجمي. في غياب الظروف داعمة، والثقافة هي تقريبا خالية من أي نمو الخلايا العصبية. في DIV 7، طبقة نجمية حوالي 80-90٪ متموجة وعدد قليل من الخلايا الدبقية الصغيرة وكذلك خلايا السلائف دبقية قليلة التغصن موجودة على الجزء العلوي من طبقة نجمي. - نضح المتوسطة الطلاء من القارورة، إضافة 2 مل من prewarmed نجمية تصفيح متوسطة جديدة، شطفالثانية إزالة مرة أخرى في DIV 11، عندما الخلايا النجمية هي متكدسة وجاهزة للزراعة الباطن.
- إضافة 2 مل من 0.25٪ التربسين، وتناوب بلطف القارورة عدة مرات ونضح التربسين باستخدام الماصة زجاجية معقمة.
- إضافة 2 مل من 0.25٪ التربسين والسماح للقارورة الجلوس في نسيج الثقافة هود ل4-5 دقيقة في RT.
- إزالة التربسين والحفاظ على قارورة عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO 2 الحاضنة لمدة 10 دقيقة. إضافة 5 مل prewarmed نجمية تصفيح المتوسطة وفصل طبقة نجمي من خلال الاستفادة من قارورة ضد كف يدك (3-4 مرات) تليها سحن لطيف لتحقيق حياد تام وجمع الخلايا النجمية في أنبوب مخروطي 15 مل.
- أنبوب الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 5 دقائق، نضح طاف، وإضافة 1 مل نجمية جديدة الطلاء المتوسطة.
- إضافة 10 ميكرولتر من خلية إلى تعليق عدادة الكريات وعدد الخلايا في كبيرة في منطقة الشبكية المركزية (1 ملم 2) باستخدام النقيض المجهر المرحلة مقلوب (الهدف 10X). مولtiply بنسبة 10 4 لتقدير عدد الخلايا لكل مليلتر. وسيكون أحد قارورة T25 تسفر ~ 1 × 10 6 المجموع فصل الخلايا. البذور ~ 1 × 10 5 الخلايا في 2 مل نجمية تصفيح المتوسطة على 12 مم بولي-D-ليسين ساترة الزجاج المكسوة مسبقا والمحمولة في بئر طبق ثقافة 24-جيدا.
- احتضان عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO 2 الحاضنة. أداء OGD / REOX في DIV 12-14 (القسم 2).
- علاج الثقافات نجمية في DIV 3 مع 5 ملي الميثيل استر (LME) هيدروكلوريد-L يسين حتى DIV 11 إذا رغبت الثقافات الحصين خالية من الخلايا الدبقية الصغيرة. بعد LME حضانة والثقافات خاضعة للاهتزاز (300 دورة في الدقيقة لمدة 1 ساعة) لإزالة تلويث الخلايا الدبقية الصغيرة.
ملاحظة: LME هو وكيل السامة للخلايا دبقية التي استخدمت على نطاق واسع كوسيلة للقضاء على تكاثر الخلايا الدبقية الصغيرة 22.
2. OGD / REOX العلاج
- وسائل الإعلام نضح من ساترة تحتوي على ثقافة نجمية ملتصقة (DIV 12-14)، وشطف 3 مراتبواسطة بلطف الدورية للطبق ثقافة 24-جيدا عقد ساترة بضع مرات مع 1 مل من محلول متساوي التوتر OGD (7.4 درجة الحموضة) تحتوي على (مم): 0 الجلوكوز، 21 NaHCO 3، 120 كلوريد الصوديوم، 5.36 بوكل، 0.33 نا 2 هبو 4، 0.44 KH 2 PO 4، 1.27 CaCl 2، و 0.81 MgSO 4.
- إضافة 0.2 مل من محلول OGD إلى جانب لتغطية ساترة واحتضان لمدة 2 ساعة في حاضنة نقص الأوكسجين التي تحتوي على 94٪ N 2، 1٪ O 2 و 5٪ CO 2. المزيج بلطف مع شاكر المداري (50 دورة في الدقيقة) ل30 دقيقة الأولى من نقص الأكسجين لتسهيل تبادل الغازات.
- احتضان الخلايا السيطرة normoxic لمدة 2 ساعة في 5٪ CO 2 والهواء الجوي في منطقة عازلة متطابقة إلى حل OGD باستثناء إضافة 5.5 ملي الجلوكوز.
- لREOX، نضح الحل OGD وإضافة 2 مل من نجمية تصفيح المتوسطة. احتضان في 5٪ CO 2 و الهواء في الغلاف الجوي عند 37 درجة مئوية لمدة 5 ساعات.
3. Immunocytochemical تلطيخ </ P>
- نضح في وسائل الإعلام الثقافة باستخدام ماصة زجاجية معقمة تعلق على خط فراغ وبسرعة شطف ساترة مرة واحدة عن طريق إضافة من 1mL 0.1 M تريس مخزنة المالحة (TBS) (154 ملي مول كلوريد الصوديوم، و 16 ملي Trizma قاعدة، 84 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 7.4) إلى البئر. نضح وإضافة 2 مل من 4٪ لامتصاص العرق (PFA) في 1X الفوسفات مخزنة المالحة (PBS). احتضان لمدة 15 دقيقة في RT.
- نضح وإضافة 1 مل من 0.1 M TBS، ثم وضع على شاكر هزاز لمدة 2 دقيقة. كرر 3 مرات. إضافة 1 مل عرقلة الحل (10٪ مصل الماعز، و 10 ملغ / مل BSA، 0.025٪ تريتون X-100 في 0.1 M TBS)، واحتضان لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية على شاكر هزاز.
- نضح عرقلة الحل وإضافة الأولية وحيدة النسيلة الماوس GFAP مكافحة الأجسام المضادة (0.2 مل من التخفيف 1: 500 في عرقلة الحل) وبولكلونل الأرنب مكافحة S100B (1: 500) أو بولكلونل الأرنب مكافحة HIF1α (1: 200) لمدة 60 دقيقة عند 37 درجة مئوية على شاكر هزاز.
- بدلا من ذلك، يتم تحضين بعض الخلايا النجمية مع الأرنب بولكلونل مكافحة IBA1 (1: 200) ومون الماوسoclonal مكافحة MAP2 للوصول إلى نقاء الثقافة.
- نضح الأجسام المضادة الأولية وشطف ساترة عن طريق إضافة 1 مل من 0.1 M TBS ووضع على شاكر هزاز لمدة 2 دقيقة ثم نضح. كرر مرتين.
- إضافة 0.2 مل من 1: 200 التخفيف من الماعز الثانوية المضادة للأرنب الأجسام المضادة 568 مترافق 488 مترافق ومكافحة فأر في عرقلة الحل لمدة 60 دقيقة عند 37 درجة مئوية على شاكر هزاز.
- نضح الضد الثانوية وشطف ساترة عن طريق إضافة 1 مل من 0.1 M TBS ومكان على شاكر هزاز لمدة 2 دقيقة ثم نضح. كرر مرتين.
- إزالة ساترة من جانب والجافة عن طريق وضع على شريحة وضعه على شريحة جفافا. جبل ساترة على شريحة جديدة من قلب على قطرة واحدة من VECTASHIELD hardset المتوسطة المتزايدة مع دابي (1.5 نانوغرام / ميكرولتر).
- coverslips الصورة على المجهر متحد البؤر باستخدام 20X الجافة أو 60X الهدف النفط. الحصول على صور (512 × 512) لدابي (405 نانومتر السابق / 450 نانومتر م) وتألقي 488 الموسومة GFAP الضد (488 نانومتر السابق / 515 نانومترم). الحفاظ المعلمات الاستحواذ ثابتة داخل 20X 60X والجماعات.
4. تحديد الجنس عن طريق PCR
- حرارة الجرو أخمص القدمين أو قصاصات بأصابع الاتهام إلى 95 درجة مئوية لمدة 45 دقيقة في 50 ملي هيدروكسيد الصوديوم وتحييد مع حجم مساو من 1 M تريس، ودرجة الحموضة 6.8.
- إضافة 1 ميكرولتر من محلول الحمض النووي المستخرج إلى 19 ميكرولتر من الخليط التالي: 5 pmoles الاشعال للجينات Myog وجمهورية يوغوسلافيا، رد فعل العازلة 1X، 0.2 ملي كل deoxynucleotide و 8 U طق البلمرة.
- استخدام التمهيدي متواليات. جمهورية يوغوسلافيا 5'TCATGAGACTGCCAACCACAG3، 5'CATGACCACCACCACCACCAA3 "وMyog 5'TTACGTCCATCGTGGACAGC3، 5'TGGGCTGGGTGTTAGTCTTA3" 23.
- أداء بروتوكول PCR التالية: 95 درجة مئوية لمدة 3 دقائق ثم 30 دورات تمسخ في درجة حرارة 95 درجة مئوية لمدة 15 ثانية، الصلب في 58 درجة مئوية لمدة 15 ثانية، واستطالة عند 72 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة. وبعد هذا 30 دورات، ويخلص التفاعل مع وجود النهائية 72 درجة مئوية استطالة لمدة 1 دقيقة.
- كمبيوتر منفصلمنتجات R electrophoretically على هلام الاغاروز 2٪ إيثيديوم بروميد التي تحتوي على وتصور تحت إضاءة الأشعة فوق البنفسجية. (الشكل 2A). تنبيه! إيثيديوم بروميد هو مادة مسرطنة محتملة ويجب التعامل معه بحرص شديد والتخلص منها بشكل صحيح وفقا للوائح المؤسسة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
فهم الأدوار وظائف نجمية بالغت في ظل الظروف الفسيولوجية أو المرضية تم توضيحها بشكل كبير عن طريق زراعة هذه الخلايا في ظل ظروف في المختبر. على جانب هام من جوانب أداء زراعة بالغت هو تحديد جنس الجرو الماوس قبل استخدامه. نحن مصممون جنس الفأر وراثيا بواسطة PCR وتقييم البصرية (الشكل 2) 16. اعتمد منهجية تحديد الجنس باستخدام PCR مع بعض التعديلات من McClive وسنكلير، سريعة وبسيطة، واستنساخه للغاية طريقة 23. ويبين الشكل 2A نتائج تمثيلية تحديد الجنس باستخدام PCR. تم إنشاؤها المنتجات PCR مع الحمض النووي المستخرج من اثنين P1 الذكور والإناث ذيل القصاصات التمثيلية. يتضمن رد فعل أزواج التمهيدي المضاعفة للجينات جمهورية يوغوسلافيا وMyog التي تولد العصابات محددة الذكور من 441 سنة مضت وspecif الإناثالعصابات جيم من 245 نقطة أساس، على التوالي. تأسست الجنس الفأر مع بالعين المجردة من خلال البحث عن وجود بقعة صغيرة مظلمة بين الفتحات الشرجية التناسلية فقط في الذكور (الشكل 2B) 16،24 - تقرير مرئي لحديثي الولادة (3 ف 1).
وعلى الرغم من زراعة الخلايا النجمية هي مريحة وسهلة نسبيا لإنشاء مختبر تحت إعداد، هذه الميزة يمكن أن يعوقها التلوث في المقام الأول مع الخلايا الدبقية الصغيرة أو الخلايا العصبية إلى حد أقل. تلوث الخلايا النجمية يمكن تحديدها بسهولة عن طريق immunolabeling من الخلايا المستزرعة مع خلية علامات محددة إما الخلايا الدبقية الصغيرة (IBA1) أو الخلايا العصبية (MAP2). في هذه الدراسة، لوحظ النجمية الحصين المتنامي في الثقافات أحادي الطبقة الأولية أن يكون ~ 6٪ من الخلايا الدبقية الصغيرة الملوثة في DIV 14، كما اقترح عدد قليل من الخلايا التي أعرب IBA1 (الشكل 3). على العكس من ذلك، تم العثور على أي من الخلايا للتعبير عن MAP2 يشير كانت ثقافة تخلو تماما من أي تلوث الخلايا العصبية (الشكل 3). التلوث دبقية طفيف لوحظ في ثقافاتنا هو وفقا لتقارير أخرى، حيث ذكرت والكتاب تلوث دبقية 5٪ في الثقافات القشرية الأولية لهم نجمية مستمدة من 1 - الجراء الماوس القديمة التي استمرت 3 أيام 25. الخلايا النجمية تمتلك التهندس الخلوي المحددة التي تسمح لهم على الاستجابة للتغيرات في المكروية بهم بما في ذلك نقص الأكسجة. من أجل تحديد أي جنس استجابة نجمي محددة إلى المختبر في ونقص التروية، أخضعنا النجمية الحصين بالغت في OGD / REOX. تم تحديد الحث الناجح لOGD / REOX عن طريق زيادة التعبير النووي من نقص الأكسجة عامل محرض 1 ألفا (HIF1α لوحظ في GFAP + الخلايا النجمية تعرض لOGD 2 ساعة تليها 5 ح REOX بالمقارنة مع تعبيرات HIF1α في الخلايا تحت الظروف normoxic (الشكل 4 ).
ضمن الصفحات = "1"> أدى تلطيخ Immunocytochemical من الخلايا النجمية مثقف الحصين بالغت مع GFAP أو S100B (تنضج نجمية علامة) في نمط تلطيخ انتقائية للغاية وقابلة للتكرار (الشكل 5). تم colocalized GFAP وS100B في الهيئات السيتوبلازم وخلية من الخلايا النجمية، واصفا مرحلة تنموية نجمي نضجت حيث تميل هذه الخلايا إلى يفقدون الخلايا الجذعية العصبية (NSC) المحتملين 26. كان التشكل وكثافة GFAP أو immunoreactivities S100B مماثلة في كل من الذكور والإناث الثقافات نجمية كما لوحظ في normoxic كل منهما ومجموعات العلاج OGD / REOX. في ظل ظروف normoxic، قدمت النجمية الحصين ومتعدد الأضلاع إلى مغزلي والتشكل شقة [الشكل 5A، B (normoxia 60X، السهم)]، وتقييمها باستخدام متحد البؤر المجهري. وكانت هذه الخلايا قادرة على الانقسام حتى متموجة لحوالي 2 أسابيع قبل تحريض OGD / REOX. بعد 2 ساعة OGD و 5 ح REOX، أظهرت الخلايا النجمية reacti الكلاسيكيةلقد مورفولوجيا الخلايا النجمية التي تظهر العمليات الأولية تراجع، وتضخم من سوما والعمليات، وزيادة التعبير عن GFAP أو S100B [الشكل 5A، B (OGD / REOX، 60X، رأس السهم)]. بعد OGD / REOX، كما عرضت تلطيخ GFAP / S100B على شبكه واسعة تمتد عبر السيتوبلازم في كل من الذكور والإناث النجمية الحصين. عدم وجود GFAP تلطيخ لوحظ في الخلايا النجمية الحصين مثقف من GFAP الفئران لاغيا بمثابة سيطرة سلبية (الشكل 5B، أقحم). وتوفر هذه النتائج دليلا مباشرا على ان مورفولوجية GFAP النجمية / S100B-مناعيا يخضع لتغيرات كبيرة عندما تتعرض لOGD-REOX.
الشكل 1. الرسوم التوضيحية للتقنية إزالة الحصين من P1 الفئران 1. قطع رأس الجرو لإزالة الرأس.2، 3. باستخدام مقص غرامة، وجعل شق خط الوسط من الجلد، الخلفية إلى الأمامية، وقشر يعود الجلد بمساعدة ملقط غيض شقة 4، 5، 6. وجعل شق صغير في قاعدة الجمجمة. قطع الجمجمة على طول خط الوسط وقشر بعيدا نصفين لفضح الدماغ. 7، 8. إزالة المخيخ مع مساعدة من ملقط المنحنية. 9. إزالة بعناية الدماغ من الجمجمة ومكان في طبق بتري معقمة. 10، 11. الوجه الدماغ بحيث السطح البطني من الدماغ يكون مواجها لها باستخدام ملقط المنحني، ثم فصل نصفي الكرة الأرضية مع شفرة جراحية معقمة حادة. 12، 13، 14. إزالة انتفاخ الأنسجة الدماغ المتوسط والمهادية ترك سليمة الكامنة وراء نصف الكرة الأرضية وكشف الحصين. 15، 16. إزالة الحصين (صغير هيكل على شكل C) 17، 18. وضع فصوص الحصين تم الحصول عليها من كل من مباشرة نصفي الكرة الأرضية في طبق منفصل بتري تحتوي العقيمة HBSS. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم تحديد 2. الجنس من الفئران حديثي الولادة. A. وقد قررت الماوس الجنس وراثيا بواسطة PCR مع الاشعال محددة إلى Myog (الكروموزوم (اكس)) والجينات جمهورية يوغوسلافيا (Y كروموسوم) باستخدام الحمض النووي المستخرج من إصبع أو أخمص القدمين قصاصات (F 1، M 1). وتصور عصابات PCR على هلام الاغاروز 2٪ مع إيثيديوم بروميد تحت إضاءة الأشعة فوق البنفسجية. F 2 وم 2 خدم الضوابط الإيجابية للإناث والذكور على التوالي. ب. تأسست تقرير البصرية من الذكور من الإناث عن طريق تحديد بقعة مظلمة بين الفتحات الشرجية التناسلية (السهم).urce.jove.com/files/ftp_upload/53695/53695fig2large.jpg "الهدف =" _ فارغة "> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3. الطهارة من الماوس الابتدائية الحصين نجمية الثقافة. المناعية للثقافة نجمية مع MAP2 العصبية علامة (الحمراء)، وIBA1 الخلايا الدبقية الصغيرة علامة (الخضراء). هي ملطخة النوى مع 4 "، 6'-diamidino-2-phenylindole (دابي) (الأزرق). السهم يشير إلى تلوث الخلايا الدبقية الصغيرة. مقياس شريط: 50 ميكرومتر الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4. HIF1α التعبير كان فيمجعدة في مثقف الحصين النجمية تتعرض لOGD / REOX. الصور مناعي الممثل تظهر GFAP (الحمراء)، وHIF1α (الأخضر) وضع العلامات في الخلايا النجمية تعرض ل(A) normoxia أو (ب) OGD (2 ح) / REOX (5 ساعات). هي ملطخة النوى مع 4 "، 6'-diamidino-2-phenylindole (دابي) (الأزرق). السهم والتعبير HIF1α منخفضة؛ رأس السهم، رفع التعبير النووي HIF1α. مقياس شريط: 25 ميكرومتر الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 5. يصل تنظيم S100B أو التعبير GFAP في الثقافات تلاعب الحصين نجمية التالية OGD-REOX. كانت ملطخة تلاعب النجمية الحصين مثقف لS110b أو التعبير GFAP في ظل ظروف normoxic أو بعد 2ح OGD تليها 5 ساعات من REOX (OGD / REOX). أقحم: صورة 60X من الخلايا النجمية الحصين مثقف من GFAP الفئران فارغة. شريط الحجم: 30 ميكرون.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
من أجل دراسة الفروق بين الجنسين في خصائص وظيفة الخلايا النجمية في ظل الظروف الفسيولوجية والمرضية، وإعداد الخلايا النجمية الأولية بالغت في زراعة الخلايا هو أداة هامة في الاستفادة منها. في هذه الدراسة فإننا الإبلاغ عن كفاءة عالية وأسلوب استنساخه للثقافة التخصيب السكان متجانسة من الخلايا النجمية الحصين بالغت من الأطفال حديثي الولادة (P0-P2) C57BL / 6 (النوع البري) أو K19F (GFAP فارغة) الجراء الماوس في المختبر. إنشاء هذه المنهجية يساعد المحققين فهم الوظائف الفسيولوجية والمرضية من الخلايا النجمية الحصين بالغت بعد نقص التروية في المختبر.
هناك نوعان من الخطوات الحاسمة في إقامة هذه المنهجية بما في ذلك صيانة من العقم والهضم كافية من فصوص الحصين خلال trypsinization تليها سحن من الأنسجة هضمها من أجل تحقيق تعليق خلية واحدة. منع الخلايا النجمية الأولية منالحصول على الملوثة هي واحدة من أكبر التحديات في جميع مراحل العملية الثقافة. بكتيريا و / أو الفطرية وضعان المشتركة من التلوث التي يمكن أن تجعل الخلايا المستزرعة عديمة الفائدة إذا لم يتم إقرار الرعاية المناسبة أثناء أداء هذه التقنية. وبالتالي، من أجل ضمان نجاح التجربة، لا بد من إجراء عملية تحت بيئة العمل العقيمة التي تضم وتطهير مكان العمل قبل استخدامها، وذلك باستخدام المعدات والمواد الجراحية المعقمة، وتجنب الاتصال من المواد المعقمة مع الأسطح غير معقمة، وذلك باستخدام الصفحي غطاء تدفق وتجنب اتخاذ قوارير ثقافة لم يسبق لهم اللعب من غطاء محرك السيارة الصفحي. وبالإضافة إلى ذلك، خلال تفكك الأنزيمية، حضانة أطول من الأنسجة قرن آمون مع التربسين تليها سحن مادية واسعة النطاق يمكن أن يؤدي إلى الإفراط في الهضم والذي ينتج عنه سوء بقاء الخلية والتعلق غير الكفء للخلايا نأت إلى قوارير الثقافة.
على العكس من ذلك، underdigestion من أنسجة المخ تقدم غير كافتفكك الخلايا الدبقية مما يؤدي إلى ضعف المحصول والبذر من الخلايا كما كتل كبيرة. ولذلك، من أجل الحصول على الثقافات نجمية صحية، فمن الضروري لتحسين تركيز التربسين، فترة حضانة وسحن لتحقيق الهضم الأمثل من الأنسجة قرن آمون. في أيدينا، حضانة فصوص الحصين مع تركيز العمل من 0.25٪ التربسين لمدة 20 دقيقة في RT تليها سحن لطيف لمدة 20 - 30 مرات أسفرت تمسكا قويا وصحية والثقافات نجمية استنساخه للغاية. أيضا، تجميد والذوبان من الكواشف السابقة لاستخدامه في كل مرة قد يقلل من فعاليتها المتكررة. وبالتالي، فمن المهم جدا أن الكواشف قسامة بكميات مرغوب الصغيرة والتجميد. على سبيل المثال، مخزن التربسين، البنسلين / الستربتومايسين إلى 5 مليلتر مأخوذة والمصل البقري الجنين إلى 50 مليلتر مأخوذة في العديد من أنابيب مخروطية العقيمة في -20 درجة مئوية حتى الاستخدام. ونحن ننصح بعدم استخدام المضادات الحيوية بعد تاريخ انتهاء الصلاحية.
GFAP هو فصيل عبد الواحدعلامة من الخلايا النجمية ليفية رد الفعل الذراع-تتميز. وقد أبلغ التالية OGD / REOX، upregulation من التعبير GFAP ردا على دباق النجمي رد الفعل 20. وعلى الرغم من أنه اقترح أن GFAP overexpression يمكن أن تستخدم مستهدف محدد لاستراتيجيات إصلاح الخلايا العصبية 27 دورها في تلف الحصين بعد مرحبا في حديثي الولادة لا يزال غير واضح. تلطيخ المناعى من الخلايا النجمية مع GFAP تمكننا من تحديد وتوصيف هذه الخلايا تحت الظروف الفسيولوجية والمرضية. GFAP تلطيخ مثل أي علامة أخرى لديها بعض القيود التي ينبغي الاعتراف بها. واحد من أوجه القصور في تلطيخ GFAP من الخلايا النجمية هو أن ليس كل الخلايا النجمية تعبر عن GFAP في ظل الظروف الفسيولوجية. خصوصا معدل التعبير نجمية غير ناضج من GFAP لا تتجاوز 40٪ في ظل الظروف الفسيولوجية 28. اعتمادا على استخدام العمر ونوع محدد من الخلايا النجمية، ويمكن اعتبار علامات أخرى يختارها مثل GLAST، ALDH1L1، BLBP، Aquaporin-4 و S100B 29.
وعلاوة على ذلك، وجود NSCs متنكرين الخلايا النجمية في الثقافات الأولية لا يمكن استبعاده. وقد تبين أن هذه NSCs لتقديم خصائص phenotypical والتركيبية مماثلة لتنضج الخلايا النجمية بما في ذلك التعبير عن GFAP. لذلك، وتحديد الواسمات الجزيئية التي هي محددة لالخلايا النجمية متباينة تماما ونضجت أمر لا بد منه. تم الإبلاغ عن الخلايا النجمية لS100B أعرب في مراحل نمو متباينة في وقت لاحق بشكل كامل بهم. مؤخرا، تم الإبلاغ عن أن الأطفال حديثي الولادة القشرية GFAP + الخلايا النجمية تفقد السلف إمكانات الخلايا الجذعية مع بداية التعبير S100B التي تحدث حول DIV 15 26. وبالمثل، في ظروف ثقافتنا في DIV 14، تم العثور على 91٪ من الخلايا معربا عن GFAP ل coexpress S100B، والتي تشير إلى أن الثقافات تتكون من الخلايا النجمية الحصين نضجت في المقام الأول متباينة عضال.
يكاد يكون من المستحيل الحصول على نقية الثقافات نجمية الحصين الابتدائية تخلو تماما من تلويث الخلايا الدبقية الموجودة فوق وتحت أحادي الطبقة نجمية. وبالتالي، فمن المهم أن نعرف نسبة تلوث الخلايا الدبقية الصغيرة في الثقافات astroglial وأيضا للحفاظ على هذه النسبة منخفضة قدر الإمكان. في هذه الدراسة فإننا ملطخة الثقافات نجمية مع الخلايا الدبقية الصغيرة IBA1 علامة محددة أو العصبية MAP2 علامة من أجل تحديد وجود أي الخلايا الدبقية الصغيرة أو الخلايا العصبية كما الملوثات المحتملة. نسبة الخلايا الدبقية الصغيرة في الثقافة نجمية القوارض قد تختلف من 1٪ إلى 30٪ اعتمادا على عدة عوامل منها عمر الحيوان، والأنواع، والمنطقة، مستنبت، subculturing طريقة والهز 30. في ثقافاتنا لاحظنا ما يقرب من 6٪ من تلوث دبقية وهو مماثل للتقارير أخرى 25. إذا كان الاستخدام المقصود للثقافة نجمية هو دراسة دور الخلايا النجمية قرن آمون في التهاب يتحتملعلاج الثقافات مع 5 ملي LME لمدة 10 د للقضاء على احتمال تلوث دبقية في الثقافات نجمية بدءا من DIV 3. LME هو وكيل السامة للخلايا دبقية التي استخدمت على نطاق واسع كوسيلة لإزالة الخلايا الدبقية الصغيرة المنتشرة 20،22. وبالإضافة إلى ذلك، يجب أن يخضع الثقافات تعامل LME لبروتوكول تهز (300 دورة في الدقيقة لمدة 1 ساعة).
التحدي التقني آخر في أداء OGD / REOX هو تحديد ما إذا كان قد تم تحقيق درجة كافية من نقص الأكسجة للحث على دباق النجمي. وتشمل علامات لنقص الأكسجين في الخلايا النجمية ليصل تنظيم GFAP وتحريض مؤسسة الحرمين، 1α. وهكذا، في هذه الدراسة نقص الأكسجة ما أكده الزيادة في GFAP مناعية (لا تظهر البيانات) وupregulation من تلطيخ HIF1-α (الشكل 4).
وخلاصة القول، وأظهرت النتائج المتحصل عليها من بالغت حديثي الولادة الثقافات نجمية الحصين مرفق الخلية ناجحة مع صحي نجمية متجانسة طبقة ديالتفلطح مورفولوجيا نموذجية coverslips على والتعبير عن رد الفعل الرئيسي نجمي الخلايا علامات GFAP وS100B على تحريض نقص التروية في المختبر. ونحن نعتقد أن البروتوكول المعتمد هنا لديه القدرة على الإجابة على الأسئلة الميكانيكية ومتعدية الهامة المتعلقة بدور الخلايا النجمية في تطوير العقول من الذكور والإناث. إجراء زراعة كامل على عكس معظم التقنيات الموجودة يولد الخلايا النجمية الحصين ناضجة ومتموجة بالغت في غضون أسبوعين، منح التحول السريع من التجارب وبساطة هذه التقنية من شأنها تسهيل استخدام طريقة زراعة نجمي الخلايا كأداة لدراسة الجنس دور محدد من الخلايا الدبقية في تطوير الدماغ مما يسمح نشر على نطاق واسع في أبحاث الدماغ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
لا شيء المؤلفين وتتنافس أو المصالح المتضاربة.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Astrocyte culture media | |||
| DMEM, high glucose | cellgro | 10-013-CV | |
| Horse Serum | Gibco | 26050-070 | Final Concentration: 10% |
| Penicillin-Streptomycin | Cellgro | 30-002-CI | Final Concentration: 1% |
| L-Leucine methyl ester hydrochloride | Aldrich | L1002-25G | Final Concentration: 5 mM |
| Solution for brain tissue digestion | |||
| HBSS | Life Technologies | 14170-088 | |
| Trypsin | cellgro | 25-050-CI | Final Concentration: 0.25% |
| Other | |||
| 70% (vol/vol) ethanol | Roth | 9065.2 | |
| Poly-D-Lysine (PDL) 12 mm round coverslips | Corning | 354087 | |
| Water | Sigma | W3500 | Cell-culture grade |
| PBS | cellgro | 21-040-CV | Cell-culture grade |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25300-062 | |
| 70 μm Sterile cell strainer | Fisher scientific | 22363548 | |
| 3.5 cm Petri dish | BD Falcon | 353001 | |
| 15 mL Falcon tube | BD Falcon | 352096 | |
| 50 mL Falcon tube | BD Falcon | 352070 | |
| Forceps, fine | Dumont | 2-1032; 2-1033 | # 3c; # 5 |
| Forceps, flat tip | KLS Martin | 12-120-11 | |
| 13 cm surgical scissors | Aesculap | BC-140-R | |
| Confocal Microscope | Nikon | A1RSi | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5805000.017 | 5804R |
| Orbital Shaker | Thermo Scientific | SHKE 4450-1CE | MaxQ 4450 |
| Anti-IBA1 | Wako | 019-19741 | Rabbit monoclonal |
| Anti-MAP2 | Sigma | M2320 | Mouse monoclonal |
| Anti-HIF1alpha | abcam | ab179483 | Rabbit monoclonal |
| Anti-S100B | Sigma | HPA015768 | Rabbit polyclonal |
| Anti-GFAP (cocktail) | Biolegend | 837602 | |
| VECTASTAIN Elite ABC Kit (Rabbit IgG) | Vector Labs | PK-6101 | Contains 4 Reagents |
| Goat Anti Rabbit Alexa-Fluor 488 | Invitrogen | A11070 | |
| Goat Anti Mouse Alexa-Fluor 568 | Invitrogen | A11004 |
References
- Powell, E. M., Geller, H. M. Dissection of astrocyte-mediated cues in neuronal guidance and process extension. Glia. 26, 73-83 (1999).
- Koehler, R. C., Roman, R. J., Harder, D. R. Astrocytes and the regulation of cerebral blood flow. Trends in neurosciences. 32, 160-169 (2009).
- Seifert, G., Schilling, K., Steinhauser, C. Astrocyte dysfunction in neurological disorders: a molecular perspective. Nature reviews. Neuroscience. 7, 194-206 (2006).
- Ballabh, P., Braun, A., Nedergaard, M. The blood-brain barrier: an overview: structure, regulation, and clinical implications. Neurobiology of disease. 16, 1-13 (2004).
- Araque, A., Parpura, V., Sanzgiri, R. P., Haydon, P. G. Tripartite synapses: glia, the unacknowledged partner. Trends in neurosciences. 22, 208-215 (1999).
- Anderson, M. A., Ao, Y., Sofroniew, M. V.
- Cengiz, P., et al. Inhibition of Na+/H+ exchanger isoform 1 is neuroprotective in neonatal hypoxic ischemic brain injury. Antioxidants & redox signaling. 14, 1803-1813 (2011).
- Ferriero, D. M.
- Hill, C. A., Fitch, R. H. Sex differences in mechanisms and outcome of neonatal hypoxia-ischemia in rodent models: implications for sex-specific neuroprotection in clinical neonatal practice. Neurol Res Int. , 1-9 (2012).
- Cikla, U., et al. ERalpha Signaling Is Required for TrkB-Mediated Hippocampal Neuroprotection in Female Neonatal Mice after Hypoxic Ischemic Encephalopathy(1,2,3). eNeuro. 3, (2016).
- Uluc, K., et al. TrkB receptor agonist 7, 8 dihydroxyflavone triggers profound gender- dependent neuroprotection in mice after perinatal hypoxia and ischemia. CNS Neurol Disord Drug Targets. 12, 360-370 (2013).
- Cikla, U., et al. Suppression of microglia activation after hypoxia-ischemia results in age-dependent improvements in neurologic injury. J Neuroimmunol. 291, 18-27 (2016).
- McQuillen, P. S., Ferriero, D. M. Selective vulnerability in the developing central nervous system. Pediatr Neurol. 30, 227-235 (2004).
- Morken, T. S., et al. Altered astrocyte-neuronal interactions after hypoxia-ischemia in the neonatal brain in female and male rats. Stroke; a journal of cerebral circulation. 45, 2777-2785 (2014).
- Chisholm, N. C., Sohrabji, F. Astrocytic response to cerebral ischemia is influenced by sex differences and impaired by aging. Neurobiology of disease. 85, 245-253 (2016).
- Liu, M., Oyarzabal, E. A., Yang, R., Murphy, S. J., Hurn, P. D. A novel method for assessing sex-specific and genotype-specific response to injury in astrocyte culture. Journal of neuroscience methods. 171, 214-217 (2008).
- Exploring the biological contributions to human health: does sex matter?. Journal of women's health & gender-based. 10, 433-439 (2001).
- Collins, F. S., Tabak, L. A. Policy: NIH plans to enhance reproducibility. Nature. 505, 612-613 (2014).
- Zhang, Y., et al. Rapid single-step induction of functional neurons from human pluripotent stem cells. Neuron. 78, 785-798 (2013).
- Cengiz, P., et al. Sustained Na+/H+ exchanger activation promotes gliotransmitter release from reactive hippocampal astrocytes following oxygen-glucose deprivation. PloS one. 9, e84294 (2014).
- Landis, S. C., et al. A call for transparent reporting to optimize the predictive value of preclinical research. Nature. 490, 187-191 (2012).
- Hamby, M. E., Uliasz, T. F., Hewett, S. J., Hewett, J. A. Characterization of an improved procedure for the removal of microglia from confluent monolayers of primary astrocytes. J Neurosci Methods. 150, 128-137 (2006).
- McClive, P. J., Sinclair, A. H. Rapid DNA extraction and PCR-sexing of mouse embryos. Molecular reproduction and development. 60, 225-226 (2001).
- Wolterink-Donselaar, I. G., Meerding, J. M., Fernandes, C. A method for gender determination in newborn dark pigmented mice. Lab Anim (NY). 38, 35-38 (2009).
- Uliasz, T. F., Hamby, M. E., Jackman, N. A., Hewett, J. A., Hewett, S. J. Generation of primary astrocyte cultures devoid of contaminating microglia. Methods Mol Biol. 814, 61-79 (2012).
- Raponi, E., et al. S100B expression defines a state in which GFAP-expressing cells lose their neural stem cell potential and acquire a more mature developmental stage. Glia. 55, 165-177 (2007).
- Souza, D. G., Bellaver, B., Souza, D. O., Quincozes-Santos, A. Characterization of adult rat astrocyte cultures. PloS one. 8, e60282 (2013).
- Puschmann, T. B., Dixon, K. J., Turnley, A. M. Species differences in reactivity of mouse and rat astrocytes in vitro. Neuro-Signals. 18, 152-163 (2010).
- Schildge, S., Bohrer, C., Beck, K., Schachtrup, C. Isolation and culture of mouse cortical astrocytes. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2013).
- Saura, J. Microglial cells in astroglial cultures: a cautionary note. J Neuroinflammation. 4 (26), (2007).
