Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

הבדלים בין המינים עכבר בהיפוקמפוס האסטרוציטים לאחר Published: October 25, 2016 doi: 10.3791/53695
Automatic Translation
1, 2, 1, 1, 1,3, 1,3
1Waisman Center, University of Wisconsin, 2Department of Neurological Surgery, University of Wisconsin, 3Department of Pediatrics, University of Wisconsin

Summary

האסטרוציטים הם אחד משחקני המפתח החשובים ביותר במערכת העצבים המרכזית (CNS). כאן אנו מדווחים על שיטה מעשית של פרוטוקול תרבות astrocyte בהיפוקמפוס חרמנית על מנת ללמוד את המנגנונים העומדים בבסיס תפקוד astrocyte גורים הילוד זכר ונקבה לאחר חוץ גופית איסכמיה.

Abstract

Astrogliosis הבא היפוקסיה / איסכמיה (HI) פגיעה מוחית -related ממלא תפקיד בתחלואה ותמותה מוגברות בילודים. מחקרים קליניים שנערכו לאחרונה מראים כי חומרת פגיעה מוחית להיראות מין תלותי, וכי התינוקות ממין הזכר רגישים יותר להשפעות של פגיעה מוחית הקשורה HI, וכתוצאה מכך הם מסוגלים נוירולוגים חמורים יותר לעומת נשים עם ניזק מוחי דומה. פיתוח שיטות אמינות לבודד ולשמור אוכלוסיות מועשרות של האסטרוציטים בהיפוקמפוס חרמנית חיוני להבין את הבסיס התאי של הבדלים בין מיני ההשלכות פתולוגית של HI בילוד. במחקר זה, אנו מתארים שיטה ליצירת תרבויות astrocyte מסוימת בהיפוקמפוס מין כי הם נתון מודל של איסכמיה חוץ גופית, מניעת גלוקוז חמצן, ואחריו reoxygenation. astrogliosis תגובתי לאחר נבדק על ידי immunostaiנינג עבור חלבון חומציים גליה fibrillary (GFAP) ו S100B. שיטה זו מספקת כלי שימושי כדי ללמוד את התפקיד של זכר האסטרוציטים בהיפוקמפוס הנקבה הבא HI בילוד, בנפרד.

Introduction

האסטרוציטים הם אחד משחקני המפתח החשובים ביותר במערכת העצבים המרכזית (CNS). הגוף של ראיות הולכות ומצטברות עולה כי התפקידים של האסטרוציטים הם יותר מאשר לספק תמיכה העצבית. למעשה, את התפקידים של האסטרוציטים בתנאים פיסיולוגיים יכול להיות מאוד מורכב, כמו הדרכת הגירה של אקסונים פיתוח 1, ויסות זרימת הדם CNS 2, שמירה על הומאוסטזיס pH של נוזל ביניים הסינפטי 3, והשתתפות מחסום דם מוח 4 ו -5 בשידור סינפטי. בתנאים פתולוגיים, האסטרוציטים להגיב על פשע עם תהליך הנקרא astrogliosis תגובתי שבו מורפולוגיה, מספר, מיקום, טופוגרפיה (ביחס המרחק בין עלבון) ותפקוד של האסטרוציטים עשויה להשתנות בצורה הטרוגנית 6,7. Astrogliosis לראות הבאים אנצפלופתיה איסכמית בילוד היפוקסי אולי תורם תחלואה ותמותה של ילודים

מחקרים קליניים וניסויים שנערכו לאחרונה מראים כי חומרת פגיעה מוחית שנראית מין תלוי וכי התינוקות ממין הזכר רגישים יותר להשפעות של היפוקסיה / איסכמיה (HI) פגיעה המוחית -related, וכתוצאה מכך הם מסוגלים נוירולוגים חמורים יותר לעומת נקבות עם נזק מוחי דומה 9-11. למרות הלוקליזציה של הפגיעה תלוי גיל ההריון ואת המשך וחומרת העלבון, ההיפוקמפוס הוא אחד האזורים שיבוצעו הנפוצים ביותר במערכת העצבים המרכזית לאחר תקופת הכהונה בילוד HI, וגדילת astrogliosis בהיפוקמפוס אושר על ידי עד-רגולציה של חלבון חומציים גליה fibrillary (GFAP) 3 ד לאחר HI בילוד 7,10,12,13. הבדלים בין מינים בתפקוד astrocyte הוצגו בשני בילודים ומכרסמים מבוגרים לאחר איסכמיה מוחית 14,15. בנוסף, הרגישות astrocytic זכר לאיסכמיה חוץ גופית הוצגה על ידי cel גדלl למוות בהשוואה האסטרוציטים קליפת המוח הנשי בתרבות 16.

ההבדלים בין המינים להתחיל ב-ברחם ולהמשיך עד מוות 17. בעשור האחרון, את החשיבות של כולל המינים בתנאי ניסוי בתרבות התא ב- vivo מחקרים כבר הדגש של המכון לרפואה NIH לחפש ידע בסיסי ב ההבדלים בין המינים לראות בתנאים פיזיולוגיים ופתולוגיים 17,18 . פיתוח שיטות אמינות לבודדים ולשמור אוכלוסיות של האסטרוציטים בהיפוקמפוס חרמנית חיוני להבין את הבסיס התאי של הבדלים בין מיני ההשלכות פתולוגית של HI בילוד. המחקר הנוכחי נועד לספק את הטכניקות להכין תרבויות astrocyte מועשר מין ספציפי בהיפוקמפוס מעכברים היילוד על מנת להעריך את התפקידים של האסטרוציטים GFAP-immunoreactive הבאים חמצן / מניעת גלוקוז (OGD) ו reoxygenation (REOX), גרימתHI בסביבת תרבית תאים. טכניקה זו יכולה לשמש כדי לבחון כל שערה נוגע האסטרוציטים בהיפוקמפוס אצל זכרים ונקבות בילוד בתנאי normoxic ו איסכמי.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

הערה: המחקר נערך בהתאם להמלצת המדריך לטיפול ושימוש בחי מעבדה של המכון הלאומי לבריאות. פרוטוקול בבעלי חיים אושרה על ידי אוניברסיטת ויסקונסין-מדיסון, טיפול בבעלי חיים מוסדיים ועדת שימוש. פרוטוקול תרבות astrocyte ראשי המוצג כאן היא אמץ הפרוטוקולים שהוצגו על ידי ג'אנג Y 19 et al. ו ג'נגיס P 20 et al. עם כמה שינויים.

1. בהיפוקמפוס Dissection ו astrocyte תרבות

  1. יש להכין את כל ריאגנטים החומרים הדרושים כולל מספריים כירורגיות, מלקחיים בסדר חלקה, מלקחיים קצה שטוח, מגבות נייר, שקית פסולת, אתנול 70% ו -2 מנות לנתח (קוטר 3.5 ס"מ) על קרח מלא עם 2 תמיסת מלח מאוזן של מ"ל האנק (HBSS) כל . ודא של ציוד הכירורגים הם סטריליים (חיטוי) לפני ההליך ולהשתמש בכל חומר אחר (astrocyte ציפוי בינוני: DMEM + 5% סוס סרום +1% פניצילין, סטרפטומיצין, סוס בסרום, HBSS, 0.25% טריפסין, coverslips זכוכית, צלחות פטרי, 15/50 צינורות מ"ל, צלוחיות T25, וכו ') כמו מראש סטרילית.
  2. צמד בעדינות ולרסס את הראש והצוואר של גור עכבר עם אתנול 70% ו לערוף באמצעות מספרי סטרילי חד [איור 1 (1)].
  3. בצע חתך קו אמצע מן אחורי אל קדמי גולגולת עם מספריים קטנים לאורך הקרקפת כדי לחשוף את המוח [איור 1 (2-3)].
  4. חותכים את הגולגולת בקפידה מהצוואר אל האף עם מספריים קטנים. ואז לחתוך קדמי גולגולת כדי נורה חוש הריח ונחות המוחון לנתק את הגולגולת מבסיס הגולגולת.
  5. לעשות חתך קטן בבסיס הגולגולת לחתוך לאורך קו האמצע. שימוש במלקחיים שטוח טיפ סטרילי לקלף את הגולגולת. סור גזע המוח בעזרת מלקחיים מעוקלים. סר המוח של הגולגולת ומקום לתוך צלחת לנתח הראשונה [איור 1 (4-9)] 21.
  6. בעזרת מלקחיים מעוקל, להעיף את המוח כך את פני השטח הגחון של המוח הוא פונה כלפי מעלה ולאחר מכן נפרד בשתי ההמיספרות עם להב כירורגי סטרילי חד [איור 1 (10,11)]
  7. לקלף בחזרה את אונות מוח ובזהירות להסיר את רקמת המוח תיכונה ו התלמוס הבולטת עם מלקחיים שטוחים מעוקלים סטרילי לחשוף את ההיפוקמפוס, מבנה קטן, סוסון ים בצורה באונת הרקתית המדיאלי [איור 1 (12-14)].
  8. הסר את שתי האונות בהיפוקמפוס [איור 1 (15,16)] ובזהירות לנתח את קרומי המוח מן האונות ידי משיכת עם מלקחיים בסדר. צעד זה ימנע זיהום של התרבות astrocyte הסופית על ידי תאי קרום המוח ו פיברובלסטים.
  9. מעביר את האונות בהיפוקמפוס המוכנות לתוך התבשיל השני מלא HBSS ולהחזיר אותו על קרח [איור 1 (17,18)]. ברכה בשתי אונות בהיפוקמפוס מתוך עכבר אחת (P0 - P2) להכנת היפופוטםתרבויות astrocyte campal. זה נותן את הצפיפות הנכונה astrocyte. לרכך אונות בהיפוקמפוס באמצעות סכין כירורגית סטרילית חד (כ 4 פעמים).
  10. לשאוב HBSS מצלחת באמצעות קצה סטרילי מחוברת פיפטה 1 מ"ל ולהוסיף 3 מ"ל של טריפסין 0.25%, לערבב, להעביר צינור חרוטי 15 מ"ל סטרילי דגירה הרקמה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות עם רעד עדין.
  11. צינור צנטריפוגה XG ב 300 במשך 5 דקות. לשאוב supernatant בזהירות בעזרת פיפטה זכוכית סטרילית מצורפת קו ריק. הוסף 10 מ"ל astrocyte ציפוי בינוני ו triturate (20 - 30 פעמים) באמצעות פיפטה מזכוכית אש מלוטש עד פיסות הרקמה homogenize.
  12. צינור צנטריפוגה XG ב 300 במשך 5 דקות. לשאוב supernatant ולהוסיף 2 מיליליטר של תקשורת ציפוי astrocyte prewarmed הטריה. Pass תאים דרך מסנן רשת 70 מיקרומטר (מסננת תא) לתוך צינור 50 מיליליטר חרוטים חדש.
  13. פלייט ההשעיה התא כולו על בקבוקון Poly-D- ליזין / Laminin מצופה תרבות T25 סטרילי המכיל 3 מ"ל שלastrocyte ציפוי התקשורת, ואז דגירה את הבקבוק ב 37 מעלות צלזיוס CO 2 באינקובטור 5%.
  14. לשאוב התקשורת כולה דיי אני n-גופית (DIV) 1, DIV 3 ו DIV 7, ולהחליף עם 2 מ"ל של התקשורת ציפוי astrocyte טריים. שים את התקדמות מפגש astrocytic תחת מיקרוסקופ אור בכל פעם תוך החלפת מדיה ציפוי astrocyte.
    הערה: בשלב DIV 1, כל האסטרוציטים קיימא מחוברים אל פני השטח של הבקבוק התרבות תאים מתים או גוססים הכוללים נוירונים מרחפים supernatant. בשעה DIV 3, תאים המצורפת להתחיל לחלק ליצירת שכבת התאים astrocytic. בהעדר התנאים התומכים, התרבות היא כמעט נטולה כל צמיחה עצבית. בשעת DIV 7, שכבת astrocyte הם כ -80 - 90% ומחוברים וכמה microglia וכן תאי מבשר oligodendrocyte נמצאת על גבי שכבת astrocytic.
  15. לשאוב את המדיום ציפוי מהבקבוק, להוסיף 2 מ"ל של מדיום ציפוי astrocyte prewarmed טריים, ולשטוףnd להסיר שוב ב -11 DIV, כאשר האסטרוציטים הם ומחובר ומוכנים תת culturing.
  16. הוסף 2 מ"ל של טריפסין 0.25%, בעדינות לסובב את הבקבוק כמה פעמים טריפסין לשאוב באמצעות pipet זכוכית סטרילית.
  17. הוסף 2 מ"ל של טריפסין 0.25% ולתת את הבקבוק לשבת למכסה המנוע בתרבית רקמה עבור 4 - 5 דקות ב RT.
  18. הסר את טריפסין ולשמור את הבקבוק על 37 מעלות צלזיוס חממה 5% CO 2 למשך 10 דקות. הוסף 5 מ"ל prewarmed astrocyte ציפוי בינוני ולנתק את שכבת astrocytic ידי הקשה על הבקבוק על כף היד שלך (3 - 4 פעמים) ואחריו טחינה דקה ועדינה להשיג ניתוק מוחלט לאסוף את האסטרוציטים צינור חרוטי 15 מ"ל.
  19. צינור צנטריפוגה XG ב 300 במשך 5 דקות, לשאוב supernatant, ולהוסיף 1 בינוני astrocyte ציפוי טרי מ"ל.
  20. הוסף 10 μL של השעית תא hemocytometer ולספור את התאים באזור gridded המרכזי הגדול (1 מ"מ 2) באמצעות מיקרוסקופ לעומת שלב הפוך (אובייקטיבי 10X). מולtiply ידי 10 4 להעריך את מספר התאים לכל מ"ל. בקבוק T25 אחת יניב ~ 1 x 10 תאים 6 סך ניתק. זרע ~ 1 x 10 5 תאים 2 astrocyte מ"ל בינוני ציפוי על coverslip זכוכית 12 מ"מ קוטר Poly-D- ליזין precoated בבאר של תרבות צלחת 24 גם.
  21. לדגור על 37 מעלות צלזיוס חממה 2 5% CO. בצע OGD / REOX ב DIV 12 - 14 (סעיף 2).
  22. פנק את תרבויות astrocyte ב DIV 3 עם 5 המ"מ L- לאוצין מהתיל אסתר (LME) hydrochloride עד DIV 11 אם תרבויות בהיפוקמפוס נטולות microglia הן רצויות. לאחר דגירת LME, תרבויות בכפופות רועד (300 סל"ד עבור 1 ח) כדי להסיר זיהום microglia.
    הערה: LME הוא סוכן ציטוטוקסי microglial כי כבר נעשה שימוש נרחב כשיטה לחסל מתרבים microglia 22.

2. OGD / REOX טיפול

  1. תקשורת לשאוב coverslip המכילה תרבות astrocyte חסידה (DIV 12 - 14) ולשטוף 3 פעמיםעל ידי בעדינות לסובב את המנה תרבות 24 גם מחזיק את coverslip כמה פעמים עם 1 מ"ל איזוטוני OGD פתרון (pH 7.4) המכיל (מ"מ): 0 גלוקוז, 21 NaHCO 3, 120 NaCl, 5.36 KCl, 0.33 Na 2 HPO 4, 0.44 KH 2 PO 4, 1.27 CaCl 2, ו- 0.81 MgSO 4.
  2. להוסיף 0.2 מ"ל פתרון OGD כדי גם כדי לכסות את coverslip ו דגירה עבור 2 שעות באינקובטור היפוקסי המכיל 94% N 2, 1% O 2, ו 5% CO 2. לערבב בעדינות עם שייקר מסלולית (50 סל"ד) עבור היפוקסיה 30 דקות של הראשון כדי להקל חילוף הגזים.
  3. דגירה לתאי קבוצת normoxic עבור 2 שעות ב 5% CO 2 ו אוויר אטמוספרי חיץ זהה הפתרון OGD למעט תוספת של גלוקוז 5.5 מ"מ.
  4. לקבלת REOX, פתרון OGD לשאוב ולהוסיף 2 מ"ל של astrocyte ציפוי בינוני. מדגירים 5% CO 2 ו אוויר אטמוספרי ב 37 מעלות צלזיוס במשך 5 שעות.

3. Immunocytochemical מכתים </ P>

  1. לשאוב התקשורת והתרבות בעזרת פיפטה זכוכית סטרילית המצורפת קו ואקום ובמהירות לשטוף coverslip פעם על ידי הוספת 1mL של 0.1 M טריס בופר (TBS) (154 mM NaCl, 16 Base מ"מ Trizma, 84 mM Tris-HCl, pH 7.4) אל הבאר. לשאוב ולהוסיף 2 מ"ל של paraformaldehyde 4% (PFA) ב 1x בופר פוספט (PBS). דגירה במשך 15 דקות ב RT.
  2. לשאוב ולהוסיף 1 מ"ל של 0.1 M TBS, ואז למקם על שייקר נדנדה למשך 2 דקות. חזור 3 פעמים. הוסף 1 מ"ל פתרון לחסימת (סרום עיזים 10%, 10 מ"ג / מ"ל ​​BSA, 0.025% Triton X-100 ב 0.1 M TBS) דגירה במשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס על שייקר נדנדה.
  3. לשאוב פתרון חסימת ולהוסיף נוגדנים נגד GFAP חד שבטיים העכבר העיקרי (0.2 מ"ל של דילול 1: 500 בחסימת פתרון) ארנב polyclonal אנטי-S100B (1: 500) או ארנבת polyclonal אנטי HIF1α (1: 200) למשך 60 דקות ב 37 ° C על שייקר נדנדה.
  4. לחילופין, האסטרוציטים כמה מודגרת עם אנטי IBA1 polyclonal ארנב (1: 200) ועכבר monאנטי MAP2 oclonal לגשת טוהר התרבות.
  5. לשאוב העיקרי נוגדן ולשטוף coverslip על ידי הוספת 1 מ"ל של 0.1 M TBS והצבת על שייקר נדנדה למשך 2 דקות ואז לשאוב. חזור פעמיים.
  6. להוסיף 0.2 מ"ל של דילול 1: 200 של נוגדנים משני עז נגד ארנב 488 מצומדות ואנטי עכבר 568 מצומדות בחסימת פתרון עבור 60 דקות ב 37 מעלות צלזיוס על שייקר נדנדה.
  7. לשאוב משני נוגדן ולשטוף coverslip על ידי הוספת 1 מ"ל של 0.1 M TBS ומניחים על שייקר נדנדה למשך 2 דקות ואז לשאוב. חזור פעמיים.
  8. הסר coverslip מבאר ויבש ידי הצבת בשקופית ניצב על יבש שקופיות. coverslip הר בשקופית חדשה על ידי היפוך על טיפה אחת של Vectashield hardset הרכבה בינונית עם DAPI (1.5 ng / μL).
  9. coverslips תמונה על מיקרוסקופ confocal או באמצעות 20X אובייקטיבי שמן יבש או 60X. לרכוש תמונות (512 x 512) עבור DAPI (לשעבר ננומטר 405/450 ננומטר em) ו fluorochrome 488 מתויג נוגדן GFAP (לשעבר ננומטר 488/515 ננומטרem). שמור פרמטרי רכישה קבועים בתוך 20X ו 60X קבוצות.

4. קביעת מין באמצעות PCR

  1. הבוהן הגור חום או קטעי האצבע על 95 מעלות צלזיוס למשך 45 דקות ב 50 מ"מ NaOH ולנטרל עם נפח שווה של 1 M טריס, pH 6.8.
  2. הוסף 1 μL של פתרון ה- DNA חילוץ 19 μL של התערובת הבאה: 5 pmoles של פריימרים עבור הגנים Myog ו Sry, מאגר התגובה 1x, 0.2 מ"מ כל deoxynucleotide ו -8 פולימראז תקי U.
  3. השתמש רצפים פריימרים; Sry 5'TCATGAGACTGCCAACCACAG3 ', 5'CATGACCACCACCACCACCAA3' ו Myog 5'TTACGTCCATCGTGGACAGC3 ', 5'TGGGCTGGGTGTTAGTCTTA3' 23.
  4. בצע את פרוטוקול ה- PCR הבא: 95 מעלות צלזיוס במשך 3 דקות ולאחר מכן 30 מחזורים של denaturation על 95 מעלות צלזיוס למשך 15 שניות, חישול ב 58 מעלות צלזיוס למשך 15 שניות, ואת ההתארכות ב 72 מעלות צלזיוס במשך 1 דקות. בעקבות 30 זה מחזורי, התגובה מסכמת עם התארכות C סופית 72 מעלות במשך 1 דקות.
  5. PC הנפרדמוצרי R electrophoretically על ג'ל agarose ethidium ברומיד-המכיל 2% ולדמיין תחת תאורת UV. (איור 2 א). זהירות! Ethidium ברומיד הוא קרצינוגן פוטנציאליים חייב להיות מטופל בזהירות מסולק כראוי על פי התקנות של המוסד.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

הבנת התפקידים של פונקציות astrocyte חרמנית בתנאים פיסיולוגיים או pathophysiological כבר הובהר מאוד על ידי culturing תאים אלה בתנאים במבחנה. ההיבט החשוב של ביצוע culturing חרמנית הוא לקבוע את מינו של גור העכבר לפני השימוש בו. אנחנו נקבע את מינו של העכבר גנטי על ידי PCR ועל ידי הערכה חזותית (איור 2) 16. המתודולוגיה של קביעת מין באמצעות PCR אומצה עם שינויים מן McClive ו סינקלייר, הוא מהיר, פשוט, מאוד לשחזור שיטה 23. איור 2 א מראה את תוצאות הנציג של קביעת מין באמצעות PCR. מוצרי ה- PCR נוצרו עם DNA מופק שני חיתוכי נציג זכר ונקבת P1 זנב. התגובה כוללת זוגות פריימר מרובבים עבור גני Sry ו Myog שיוצרים להקות ספציפיות זכר של 441 נ"ב specif נקבהלהקות ic של 245 נ"ב, בהתאמה. נחישות חזותית של ילוד (P 1 - 3) עכבר יחסים מין עם בעין בלתי מזוינת הוקמה על ידי מחפש את הנוכחות של מקום אפלולי קטן בין פתחי anogenital רק בזכרים (תרשים 2B) 16,24.

אמנם, culturing של האסטרוציטים הוא נוח וקל יחסית להקים תחת מעבדה להגדיר, יתרון זה יכול להתעכב על ידי זיהומו בעיקר עם microglia או נוירונים ובמידה פחותה. זיהום של האסטרוציטים ניתן לקבוע בקלות על ידי immunolabeling של תאים בתרבית עם סמנים תאים ספציפיים עבור כל אחת microglia (IBA1) או נוירונים (MAP2). במחקר הנוכחי, האסטרוציטים בהיפוקמפוס גדלו בתרבויות בשכבה עיקריות נצפו להיות ~ 6% microglia זיהום ב DIV 14, כפי שהוצעו על ידי כמה תאים הביעו IBA1 (איור 3). נהפוך הוא, אף אחד בתאים נמצאו להביע MAP2 דבר המצביע התרבות הייתה לחלוטין נטול זיהום עצבי (איור 3). זיהום microglial הקטין שנצפה תרבותנו הוא בהתאם דיווחים אחרים, שבו המחברים דיווחו על זיהום microglial 5% בתרבויות astrocyte קליפת המוח העיקריות שלהם נגזרו 1 - 3 ימים בן עכבר גורים 25. האסטרוציטים להחזיק cytoarchitecture מסוים שמאפשר להם להגיב לשינויי microenvironment שלהם כולל היפוקסיה. על מנת לקבוע כל תגובה astrocytic ספציפי מין לאיסכמיה חוץ גופית, נתון אנו האסטרוציטים בהיפוקמפוס שמיניותה OGD / REOX. אינדוקציה מוצלחת של OGD / REOX נקבעה על ידי הביטוי הגרעיני המוגבר אלפא 1 גורם מושרה היפוקסיה (HIF1α שנצפתה האסטרוציטים GFAP + נתון 2 h OGD ואחריו 5 h REOX לעומת ביטויי HIF1α בתאים בתנאי normoxic (איור 4 ).

בתוך-page = "1"> מכתים Immunocytochemical של האסטרוציטים תרבותי בהיפוקמפוס חרמנית עם GFAP או S100B (בוגרת סמן astrocyte) הביא דפוס מכתים סלקטיבית מאוד לשחזור (איור 5). GFAP ו S100B היו colocalized בגופים הציטופלסמה ותא של האסטרוציטים, מאפיינת שלב התפתחותי astrocytic התבגר שבו תאים אלה נוטים לאבד תא הגזע העצבי שלהם (המל"ל) פוטנציאל 26. מורפולוגיה וצפיפות של GFAP או immunoreactivities S100B היו דומים בשתי תרבויות astrocyte זכר ונקבה כפי שנצפה normoxic שלהם ו OGD / קבוצות הטיפול REOX. בתנאי normoxic, האסטרוציטים בהיפוקמפוס הציגו מצולעים כדי כישורים ומורפולוגיה שטוחה [איור 5 א ', ב' (normoxia 60X; חץ)], כפי שהוערכו באמצעות מיקרוסקופ confocal. תאים אלה הצליחו לחלק עד ומחוברות כ 2 שבועות לפני הגיוס של OGD / REOX. לאחר 2 OGD שעות ו 5 שעות REOX, האסטרוציטים הציג Reacti קלאסיתve מורפולוגיה astrocyte מוצגות התהליכים הבסיסיים חזר בו, היפרטרופיה של סומה ותהליכים, וביטוי מוגבר GFAP או S100B [איור 5 א ', ב' (OGD / REOX, 60X; ראש חץ)]. בעקבות OGD / REOX, מכתים GFAP / S100B גם הציג meshwork נרחב הארכת ברחבי הציטופלסמה בשני הזכר האסטרוציטים בהיפוקמפוס הנשי. חוסר מכתים GFAP שנצפה האסטרוציטים בהיפוקמפוס התרבותיים מעכברי null GFAP שמש כביקורת שלילית (איור 5 ב, הבלעה). התוצאות מעל לספק עדות ישירה כי המורפולוגיה של האסטרוציטים GFAP / S100B-immunoreactive עובר שינויים משמעותיים כאשר נתון OGD-REOX.

איור 1
באיור 1. איורים של טכניקה להסרת בהיפוקמפוס מעכברים P1. 1. לערוף גור כדי להסיר את הראש.2, 3. בעזרת מספריים בסדר, לעשות חתך קו אמצע של העור, אחורי אל קדמי, לקלף בחזרה את העור בעזרת מלקחיים שטוח קצה. 4, 5, 6. לעשות חתך קטן בבסיס של גולגולת. חותך את הגולגולת לאורך קו האמצע ו לקלף לשני חצאים כדי לחשוף את המוח. 7, 8. הסר מוח קטן בעזרת מלקחיים מעוקלים. 9. מוציא בזהירות מוח של הגולגולת והמקום לתוך צלחת פטרי סטרילית. 10, 11. תהפוך את המוח כך את פני שטח הגחון של המוח הוא פונה כלפי מעלה באמצעות מלקחיים מעוקלים, פרד ההמיספרות הן עם להב כירורגי סטרילי חדה. 12, 13, 14. הסרת רקמת המוח התיכונה ו התלמוס הבולטת עזיבת השלמים שבבסיס אונה ומגלה ההיפוקמפוס. 15, 16. הסר את ההיפוקמפוס (מבנה C בצורה קטן). 17, 18. מייד למקום האונות בהיפוקמפוס מתקבל הן של ההמיספרות בתוך פטרי צלחת נפרדת המכילה סטרילי HBSS. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2
קביעת מין איור 2. של עכברים ילודים. A. עכבר המין נקבע גנטית על ידי PCR עם פריימרים ספציפיים אל Myog (כרומוזום X) ו Sry (כרומוזום Y) גנים באמצעות DNA מופק גזרי אצבע או בוהן (F 1; M 1). הלהקות של ה- PCR היו דמיינו על ג'ל agarose 2% עם Ethidium ברומיד תחת תאורת UV. F 2 ו- M 2 שמשו בקרות חיוביות באשר נשית וגברית, בהתאמה. ב. נחישות חזותית של זכר מנקבה הוקמה על ידי זיהוי מקום חשוך בין פתחי anogenital (החץ).urce.jove.com/files/ftp_upload/53695/53695fig2large.jpg "target =" _ blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3
איור 3. טוהר של astrocyte בהיפוקמפוס העכבר הראשי התרבות. Immunostaining של תרבות astrocyte עם MAP2 סמן העצבי (אדום) ו microglia סמן IBA1 (ירוק). גרעינים מגואלים 4 ', 6'-diamidino-2-phenylindole (DAPI) (כחול). החץ מצביע על זיהום microglia. סרגל קנה מידה:. 50 מיקרומטר אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 4
איור 4. HIF1α הביטוי היהמקומטת בהיפוקמפוס Cultured האסטרוציטים חשופים OGD / REOX. תמונות immunofluorescent נציג מראה GFAP (אדום) ו HIF1α (ירוק) תיוג האסטרוציטים נתון (א) normoxia או (ב) OGD (2 h) / REOX (5 שעות). גרעינים מגואלים 4 ', 6'-diamidino-2-phenylindole (DAPI) (כחול). חץ, ביטוי HIF1α נמוך; ראש החץ, מוגבה ביטוי גרעיני HIF1α. סרגל קנה מידה:. 25 מיקרומטר אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 5
איור 5. Up-רגולציה של S100B או הביטוי GFAP בתרבויות חרמנית בהיפוקמפוס astrocyte הבאים OGD-REOX. האסטרוציטים בהיפוקמפוס תרבותי חרמנית היו מוכתמים עבור S110b או ביטוי GFAP בתנאים normoxic או אחרי 2h OGD ואחריו 5 שעות של REOX (OGD / REOX). הבלעה: image 60X מ האסטרוציטים בהיפוקמפוס מתורבת מעכברים null GFAP. סרגל קנה מידה: 30 מיקרומטר.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

על מנת ללמוד את ההבדלים בין המינים במאפייני ותפקוד של האסטרוציטים בתנאים פיזיולוגיים ופתולוגיים, הכנת האסטרוציטים העיקרי חרמנית תרבית תאים הוא כלי חשוב לנצל. במחקר הנוכחי אנו מדווחים יעילים שיטה לשחזור לתרבות אוכלוסיה הומוגנית מועשר של האסטרוציטים בהיפוקמפוס חרמנית מן היילוד (P0-P2) C57Bl / 6 (סוג בר) או K19F (null GFAP) גורים העכבר חוץ גופית. הקמת מתודולוגיה זו מסייעת לחוקרים להבין את פונקציות פיזיולוגיים ופתולוגיים של האסטרוציטים בהיפוקמפוס חרמנית לאחר איסכמיה חוץ גופית.

ישנם שני שלבים קריטיים קביעת המתודולוגיה זה כולל התחזוקה של עקרות ועיכול נאות אונות בהיפוקמפוס במהלך trypsinization ואחריו טחינה הדקה של הרקמה מתעכלת על מנת להשיג השעית התא הבודדה. מניעת האסטרוציטים ראשית ממנהלמקבל מזוהם הוא אחד האתגרים הגדולים ביותר לאורך כל תהליך התרבות. חיידקי ו / או פטרייתי הם שני מצבים נפוצים של זיהום שיכולים להפוך תאים בתרבית חסר תועלת אם טיפול נאות הוא לא אימץ בזמן ביצוע הטכניקה. לפיכך, על מנת להבטיח הצלחה ניסיון, זה הכרחי כדי לבצע את התהליך תחת הגדרת עבודה סטרילית הכוללת, חיטוי במקום העבודה לפני שימוש, באמצעות ציוד כירורגי סטרילי וחומרים, להימנע ממגע של חומרים מעוקרים עם משטחי nonsterile, באמצעות מכסה מנוע זרימה למינרית ולהימנע לוקח צלוחיות תרבות סגורות ופתוחות מתוך מכסה המנוע למינרית. בנוסף, במהלך דיסוציאציה האנזימטית, דגירה ארוכה יותר של רקמה בהיפוקמפוס עם טריפסין ואחריו טחינה דקה גופנית מקיפה יכולה להוביל העיכול מעל שלה וכתוצאה מכך כדאי תא עניות מצורפת יעילה של תאים ניתקים צלוחיות תרבות.

נהפוך הוא, underdigestion של רקמת המוח מספק מספיקדיסוציאציה של תאי גליה ובכך וכתוצאה מכך יבול דל וזריעה של תאים כמו גושים גדולים. לכן, על מנת לקבל תרבויות astrocyte בריאות, יש צורך לייעל ריכוז טריפסין, זמן דגירת טחינה דקה כדי להשיג עיכול אופטימלי של הרקמה בהיפוקמפוס. בידיים שלנו, הדגירה של האונות בהיפוקמפוס עם ריכוז העבודה של טריפסין 0.25% למשך 20 דקות ב RT ואחריו טחינה דקה עדינה למשך 20 - 30 פעמים הניב חסיד חזק, בריא ותרבויות astrocyte מאוד לשחזור. כמו כן, חזר הקפאה להפשרה של ריאגנטים לפני השימוש בכל פעם עשוי להפחית את יעילותן. לכן, חשוב מאוד כדי ריאגנטים aliquot בכמויות ולהקפיא רצוי קטנים. לדוגמה, חנות טריפסין, פניצילין / סטרפטומיצין כמו 5 aliquots מ"ל ו בסרום שור העובר כמו aliquots 50 מ"ל ב צינורות חרוטי סטרילי רבים ב -20 ° C עד השימוש. אנו ממליצים לא להשתמש באנטיביוטיקה מעבר לתאריך התפוגה.

GFAP הוא awell מאופיין סמן של האסטרוציטים סיבי תגובתי. בעקבות OGD / REOX, upregulation ביטוי GFAP בתגובת astrogliosis תגובתי דווח 20. אמנם, הוצע כי ביטוי יתר GFAP יכול לשמש יעד ספציפי עבור אסטרטגיות תיקון עצבי 27 ותפקידה הניזק בהיפוקמפוס לאחר HI בילודים עדיין לא ברור. מכתים immunohistochemical של האסטרוציטים עם GFAP מאפשר לנו לזהות ולאפיין תאים אלה בתנאים פיזיולוגיים ופתולוגיים. מכתים GFAP כמו כל סמן אחר יש מספר מגבלות, כי צריך להיות מוכרות. אחת המגבלות של מכתים של האסטרוציטים GFAP הוא שלא כל האסטרוציטים להביע GFAP בתנאים פיזיולוגיים. במיוחד שיעור ביטוי astrocyte בשלה של GFAP אינו עולה על 40% בתנאים פיזיולוגיים 28. בהתאם לשימוש לגיל וסוג ספציפי של האסטרוציטים, וסמנים אחרים של בחירה יכולים להיחשב כגון GLAST, תלדH1L1, BLBP, aquaporin-4 ו S100B 29.

יתר על כן, נוכחות של NSCs מחופש האסטרוציטים בתרבויות הראשוניות לא ניתן לשלול. NSCs אלה הוכחו להציג מאפיינים phenotypical ו ultrastructural דומה להבשיל האסטרוציטים כולל את הביטוי של GFAP. לכן, זיהוי סמנים מולקולריים ומתאימים עבור האסטרוציטים מבודלים התבגרו מלאים היא חובה. האסטרוציטים דווחו S100B הביע בשלבים התפתחותיים מאוחר יותר מלא הבדיל שלהם. לאחרונה, זה כבר דווח כי GFAP קליפת המוח בילוד + האסטרוציטים לאבד פוטנציאל תאי גזע מולידם עם תחילת ביטוי S100B שקורה סביב DIV 15 26. באופן דומה, בתנאי התרבות שלנו ב 14 DIV, 91% של תאי מבטאי GFAP נמצאו coexpress S100B, אשר מראה כי התרבויות מורכבות האסטרוציטים בהיפוקמפוס סופני בדיל התבגרו בעיקר.

זה כמעט בלתי אפשרי להשיג תרבויות astrocyte בהיפוקמפוס העיקרית טהורות נטולות לחלוטין של זיהום תאי microglial הנמצאים מעל ומתחת monolayer astrocyte. לכן, חשוב לדעת את שיעור זיהום microglia בתרבויות astroglial וגם לשמור על יחס זה נמוך ככל האפשר. במחקר הנוכחי אנו מוכתמים תרבויות astrocyte עם IBA1 סמן הספציפי microglia או MAP2 סמן העצבי על מנת לקבוע הנוכחות של כל microglia או נוירונים כמזהמים פוטנציאליים. חלקם של microglia בתרבות astrocyte מכרסם עשוי להשתנות בין 1% ל 30%, תלוי במספר גורמים הכוללים גיל חיה, מינים, באזור, בינוני התרבות, subculturing שיטה ומטלטל 30. בתרבויות שלנו צפינו כ -6% של זיהום microglial אשר ניתן להשוות עם דיווחים אחרים 25. אם השימוש המיועד של תרבות astrocyte הוא ללמוד את התפקיד של האסטרוציטים בהיפוקמפוס בדלקת קיימת הכרחלטיפול התרבויות עם 5 מ"מ LME במשך 10 ד כדי למנוע זיהום microglial אפשרי בתרבויות astrocyte החל DIV 3. LME הוא סוכן ציטוטוקסי microglial כי כבר נעשה שימוש נרחב כשיטה להסיר מתרבים microglia 20,22. בנוסף, תרבויות שטופלו LME צריך להיות נתון פרוטוקול רועד (300 סל"ד עבור 1 ח).

אתגר טכני נוסף בביצוע OGD / REOX הוא לקבוע אם מידה מספקת של היפוקסיה הושגה על מנת לגרום astrogliosis. מרקר היפוקסיה האסטרוציטים כולל את התקנה עד של GFAP ואת האינדוקציה של-1α HIF. לפיכך, היפוקסיה במחקר זה אושר על ידי בית הגידול immunoreactivity GFAP (מידע לא מוצג) ואת הגברת הביטוי של מכתים HIF1-α (איור 4).

לסיכום, התוצאות שהתקבלו מתרבויות astrocyte בהיפוקמפוס בילוד חרמנית הראה מצורף תא מוצלח עם di שכבת astrocyte הומוגנית בריאמפשק אותן למעלה ולמטה מורפולוגיה טיפוסית על coverslips ואת הביטוי של GFAP הסמנים astrocytic תגובתי הגדול S100B על אינדוקציה של איסכמיה חוץ גופייה. אנו מאמינים כי פרוטוקול אימצה כאן יש פוטנציאל לענות על שאלות מכניסטית translational חשוב הנוגעים תפקידו של האסטרוציטים בפיתוח המוח זכר ונקבה. ההליך culturing כולו בניגוד למרבית שיטות מקובלות מייצר האסטרוציטים בהיפוקמפוס חרמנית בוגרת ומחוברות בעוד שבועיים, מתן תפנית מהירה של ניסויים ואת הפשטות של הטכניקה יקל על השימוש בשיטה culturing astrocytic ככלי ללמוד המין התפקיד הספציפי של תאי גליה בפיתוח המוח ובכך לאפשר התפוצה הנרחבת שלה בחקר המוח.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

אף אחד מהמחברים יש מתחרים או אינטרסים מנוגדים.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Astrocyte culture media
DMEM, high glucose cellgro 10-013-CV
Horse Serum Gibco 26050-070 Final Concentration: 10%
Penicillin-Streptomycin Cellgro  30-002-CI Final Concentration: 1%
L-Leucine methyl ester hydrochloride Aldrich L1002-25G Final Concentration: 5 mM
Solution for brain tissue digestion
HBSS Life Technologies 14170-088
Trypsin cellgro 25-050-CI Final Concentration: 0.25%
Other
70% (vol/vol) ethanol Roth 9065.2
Poly-D-Lysine (PDL) 12 mm round coverslips  Corning 354087
Water Sigma W3500 Cell-culture grade
PBS cellgro 21-040-CV Cell-culture grade
0.05% Trypsin-EDTA  Life Technologies 25300-062
70 μm Sterile cell strainer  Fisher scientific 22363548
3.5 cm Petri dish BD Falcon 353001
15 mL Falcon tube BD Falcon 352096
50 mL Falcon tube BD Falcon 352070
Forceps, fine  Dumont 2-1032; 2-1033 # 3c; # 5
Forceps, flat tip KLS Martin 12-120-11
13 cm surgical scissors Aesculap BC-140-R
Confocal Microscope Nikon A1RSi 
Centrifuge Eppendorf 5805000.017 5804R
Orbital Shaker Thermo Scientific SHKE 4450-1CE MaxQ 4450 
Anti-IBA1 Wako 019-19741 Rabbit monoclonal
Anti-MAP2 Sigma M2320 Mouse monoclonal
Anti-HIF1alpha abcam ab179483 Rabbit monoclonal
Anti-S100B Sigma HPA015768 Rabbit polyclonal
Anti-GFAP (cocktail) Biolegend 837602
VECTASTAIN Elite ABC Kit (Rabbit IgG) Vector Labs PK-6101 Contains 4 Reagents 
Goat Anti Rabbit Alexa-Fluor 488 Invitrogen A11070
Goat Anti Mouse Alexa-Fluor 568 Invitrogen A11004

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Powell, E. M., Geller, H. M. Dissection of astrocyte-mediated cues in neuronal guidance and process extension. Glia. 26, 73-83 (1999).
  2. Koehler, R. C., Roman, R. J., Harder, D. R. Astrocytes and the regulation of cerebral blood flow. Trends in neurosciences. 32, 160-169 (2009).
  3. Seifert, G., Schilling, K., Steinhauser, C. Astrocyte dysfunction in neurological disorders: a molecular perspective. Nature reviews. Neuroscience. 7, 194-206 (2006).
  4. Ballabh, P., Braun, A., Nedergaard, M. The blood-brain barrier: an overview: structure, regulation, and clinical implications. Neurobiology of disease. 16, 1-13 (2004).
  5. Araque, A., Parpura, V., Sanzgiri, R. P., Haydon, P. G. Tripartite synapses: glia, the unacknowledged partner. Trends in neurosciences. 22, 208-215 (1999).
  6. Anderson, M. A., Ao, Y., Sofroniew, M. V. Heterogeneity of reactive astrocytes. Neuroscience letters. 565, 23-29 (2014).
  7. Cengiz, P., et al. Inhibition of Na+/H+ exchanger isoform 1 is neuroprotective in neonatal hypoxic ischemic brain injury. Antioxidants & redox signaling. 14, 1803-1813 (2011).
  8. Ferriero, D. M. Neonatal brain injury. The New England journal of medicine. 351, 1985-1995 (2004).
  9. Hill, C. A., Fitch, R. H. Sex differences in mechanisms and outcome of neonatal hypoxia-ischemia in rodent models: implications for sex-specific neuroprotection in clinical neonatal practice. Neurol Res Int. , 1-9 (2012).
  10. Cikla, U., et al. ERalpha Signaling Is Required for TrkB-Mediated Hippocampal Neuroprotection in Female Neonatal Mice after Hypoxic Ischemic Encephalopathy(1,2,3). eNeuro. 3, (2016).
  11. Uluc, K., et al. TrkB receptor agonist 7, 8 dihydroxyflavone triggers profound gender- dependent neuroprotection in mice after perinatal hypoxia and ischemia. CNS Neurol Disord Drug Targets. 12, 360-370 (2013).
  12. Cikla, U., et al. Suppression of microglia activation after hypoxia-ischemia results in age-dependent improvements in neurologic injury. J Neuroimmunol. 291, 18-27 (2016).
  13. McQuillen, P. S., Ferriero, D. M. Selective vulnerability in the developing central nervous system. Pediatr Neurol. 30, 227-235 (2004).
  14. Morken, T. S., et al. Altered astrocyte-neuronal interactions after hypoxia-ischemia in the neonatal brain in female and male rats. Stroke; a journal of cerebral circulation. 45, 2777-2785 (2014).
  15. Chisholm, N. C., Sohrabji, F. Astrocytic response to cerebral ischemia is influenced by sex differences and impaired by aging. Neurobiology of disease. 85, 245-253 (2016).
  16. Liu, M., Oyarzabal, E. A., Yang, R., Murphy, S. J., Hurn, P. D. A novel method for assessing sex-specific and genotype-specific response to injury in astrocyte culture. Journal of neuroscience methods. 171, 214-217 (2008).
  17. Exploring the biological contributions to human health: does sex matter?. Journal of women's health & gender-based. 10, 433-439 (2001).
  18. Collins, F. S., Tabak, L. A. Policy: NIH plans to enhance reproducibility. Nature. 505, 612-613 (2014).
  19. Zhang, Y., et al. Rapid single-step induction of functional neurons from human pluripotent stem cells. Neuron. 78, 785-798 (2013).
  20. Cengiz, P., et al. Sustained Na+/H+ exchanger activation promotes gliotransmitter release from reactive hippocampal astrocytes following oxygen-glucose deprivation. PloS one. 9, e84294 (2014).
  21. Landis, S. C., et al. A call for transparent reporting to optimize the predictive value of preclinical research. Nature. 490, 187-191 (2012).
  22. Hamby, M. E., Uliasz, T. F., Hewett, S. J., Hewett, J. A. Characterization of an improved procedure for the removal of microglia from confluent monolayers of primary astrocytes. J Neurosci Methods. 150, 128-137 (2006).
  23. McClive, P. J., Sinclair, A. H. Rapid DNA extraction and PCR-sexing of mouse embryos. Molecular reproduction and development. 60, 225-226 (2001).
  24. Wolterink-Donselaar, I. G., Meerding, J. M., Fernandes, C. A method for gender determination in newborn dark pigmented mice. Lab Anim (NY). 38, 35-38 (2009).
  25. Uliasz, T. F., Hamby, M. E., Jackman, N. A., Hewett, J. A., Hewett, S. J. Generation of primary astrocyte cultures devoid of contaminating microglia. Methods Mol Biol. 814, 61-79 (2012).
  26. Raponi, E., et al. S100B expression defines a state in which GFAP-expressing cells lose their neural stem cell potential and acquire a more mature developmental stage. Glia. 55, 165-177 (2007).
  27. Souza, D. G., Bellaver, B., Souza, D. O., Quincozes-Santos, A. Characterization of adult rat astrocyte cultures. PloS one. 8, e60282 (2013).
  28. Puschmann, T. B., Dixon, K. J., Turnley, A. M. Species differences in reactivity of mouse and rat astrocytes in vitro. Neuro-Signals. 18, 152-163 (2010).
  29. Schildge, S., Bohrer, C., Beck, K., Schachtrup, C. Isolation and culture of mouse cortical astrocytes. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2013).
  30. Saura, J. Microglial cells in astroglial cultures: a cautionary note. J Neuroinflammation. 4 (26), (2007).

Tags

Neuroscience גיליון 116 היפוקסיה איסכמיה ההיפוקמפוס תרבות astrocyte GFAP OGD-REOX הילוד
הבדלים בין המינים עכבר בהיפוקמפוס האסטרוציטים לאחר<em&gt; In-Vitro</em&gt; איסכמיה
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chanana, V., Tumturk, A., Kintner,… More

Chanana, V., Tumturk, A., Kintner, D., Udho, E., Ferrazzano, P., Cengiz, P. Sex Differences in Mouse Hippocampal Astrocytes after In-Vitro Ischemia. J. Vis. Exp. (116), e53695, doi:10.3791/53695 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter