Summary
Астроциты являются одним из наиболее важных ключевых игроков в центральной нервной системе (ЦНС). Здесь мы приводим практический метод Sexed гиппокампа протокола астроцитов культуры с целью изучения механизмов , лежащих в основе функции астроцитов в мужских и женских новорожденных мышат после того, как в лабораторных условиях ишемии.
Abstract
Астроглиоза следующие гипоксия / ишемия (HI) черепно-мозговой травмой о связанных играет определенную роль в росте заболеваемости и смертности новорожденных. Недавние клинические исследования указывают на то, что тяжесть черепно - мозговой травмы , как представляется, секс зависит, и что мужчины новорожденные более восприимчивы к воздействию HI-связанной травмы головного мозга, что приводит к более тяжелых неврологических осложнений по сравнению с женщинами с сопоставимыми черепно - мозговых травм. Разработка надежных методов, чтобы изолировать и поддерживать высокую обогащенные популяции Sexed гиппокампа астроцитов имеет важное значение для понимания клеточной основы половых различий в патологических последствий новорожденных HI. В данном исследовании мы опишем метод для создания секс - специфические гиппокампа культуры астроцитов , которые подвергаются модели в лабораторных условиях ишемии, кислородно-глюкозы лишения, с последующим реоксигенация. Последующее реактивная астроглиоз был осмотрен immunostaiнин для глиального фибриллярного кислого белка (GFAP) и S100B. Этот метод является полезным инструментом для изучения роли мужского и женского пола гиппокампа астроцитов следующий новорожденных HI, отдельно.
Introduction
Астроциты являются одним из наиболее важных ключевых игроков в центральной нервной системе (ЦНС). Все больше фактов указывает на то, что роли астроцитов больше, чем предоставление поддержки нейронов. На самом деле, роли астроцитов в физиологических условиях может быть очень сложным, например, направляя миграцию развивающихся аксонов 1, регулируя ЦНС кровотока 2, поддерживая рН гомеостаза синаптическую межклеточной жидкости 3, а также участвует в гематоэнцефалического барьера 4 и 5 синаптической передачи. При патологических условиях, астроциты реагируют на повреждения с помощью процесса , называемого реактивного астроглиоз , в котором морфология, количество, расположение, рельеф местности (по расстоянию от инсульта) и функции астроцитов может измениться в гетерогенной образом 6,7. Астроглиоза видел следующие неонатальной гипоксической ишемической энцефалопатии, возможно, вносит свой вклад в заболеваемость и смертность новорожденных Недавние клинические и экспериментальные исследования указывают на то, что тяжесть черепно-мозговой травмой, как представляется, секс-зависимым и что мужчины новорожденные более восприимчивы к воздействию гипоксии / ишемии (HI) черепно-мозговой травмой о связанных, в результате чего в более тяжелых неврологических осложнений по сравнению с самки с сопоставимыми черепно - мозговых травм 9-11. Хотя локализация повреждения зависит от гестационного возраста и продолжительности и степени тяжести инсульта, гиппокамп является одним из наиболее часто осуществляется областей в ЦНС после срока новорожденных HI, и увеличилась гиппокампа астроглиоз подтверждена повышающую регуляцию протеин глиального фибриллярного Кислая (GFAP) 3 d после неонатального HI 7,10,12,13. Половые различия в функции астроцитов были показаны в обоих новорожденных и взрослых грызунов после ишемии головного мозга 14,15. Кроме того, мужчина астроцитов восприимчивость к экстракорпорального ишемии проявляется увеличением CELл смерть по сравнению с женским корковых астроцитов в культуре 16. Половые различия начинаются в утробе матери и продолжается до смерти 17. За последнее десятилетие, важность включения полов в экспериментальных условиях в клеточной культуре , так и в естественных условиях исследования были акцент Института медицины и NIH искать фундаментальные знания в половые различия видели в физиологических и патологических состояниях 17,18 , Разработка надежных методов для выделения и сохранения популяций Sexed гиппокампа астроцитов имеет важное значение для понимания клеточной основы половых различий в патологических последствий новорожденных HI. Настоящее исследование было разработано, чтобы обеспечить методы для подготовки обогащенные секс-специфические гиппокампа астроцитов культуры от новорожденных мышей с целью оценки роли GFAP-иммунореактивных астроцитов следующих кислорода / глюкозы Лишение (OGD) и реоксигенация (REOX), вызываяHI в среде клеточной культуры. Этот метод может быть использован для тестирования любую гипотезу, имеющую отношение к гиппокампа астроцитов у новорожденных самцов и самок при нормоксических и ишемических состояний.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Примечание: Данное исследование было проведено в соответствии с рекомендацией Руководства по уходу и использованию лабораторных животных Национального института здравоохранения. Протокол был утвержден животных в Университете Висконсин-Мэдисон, Институциональные уходу и использованию животных комитета. Первичный протокол культуры астроцитов , который представлен здесь принимается из протоколов , представленных Zhang Y 19 и др. И Дженгиза P 20 и др. , С некоторыми изменениями.
1. гиппокампа Вскрытие и астроцитов культуры
- Подготовьте все необходимые реагенты и материалы, в том числе хирургических ножниц, гладкие тонким пинцетом, плоским наконечником пинцет, бумажные полотенца, мешок отходов, 70% этанола и 2 рассекающих Петри (диаметр 3,5 см) на льду, заполненных 2 мл Хэнкса сбалансированный солевой раствор (HBSS) каждого , Убедитесь, что хирургическое оборудование являются стерильными (автоклав) до процедуры и использовать все другие материалы (астроцитов металлизированный среда: DMEM + 5% лошадиной сыворотки +1% пенициллина-стрептомицина, лошадиной сыворотки, HBSS, 0,25% трипсина, покровные стекла, чашки Петри, 15/50 мл пробирки, колбы Т25 и т.д.) в качестве предварительно стерильно.
- Придерживая и распылить голову и шею детеныша мыши с 70% этанолом и обезглавить с помощью острых стерильных ножниц [Рисунок 1 (1)].
- Выполните срединный разрез от задней к передней черепа с маленькими ножницами вдоль головы , чтобы обнажить мозг [Рисунок 1 (2-3)].
- Аккуратно вырежьте череп от шеи к носу с маленькими ножницами. Затем вырежьте черепе впереди от обонятельной луковицы и уступает мозжечка, чтобы отключить череп от основания черепа.
- Сделайте небольшой надрез у основания черепа и разрезают вдоль средней линии. Используйте стерильные с плоским наконечником пинцет, чтобы очистить от черепа. Удалить ствол мозга с помощью изогнутого пинцета. Удалить мозг из черепной коробки и поместить в первый рассекает блюдо [Рисунок 1 (4-9)] 21.
- С помощью изогнутых щипцов, флип мозг таким образом , что вентральная поверхность головного мозга была обращена вверх , а затем отделить обоих полушарий с острым стерильным хирургическим скальпелем [Рисунок 1 (10,11)]
- Отогните полушарий головного мозга и осторожно удалить выдавленные и среднего мозга ткани зрительного бугра с стерильным плоскими изогнутыми щипцами , чтобы выявить гиппокамп, небольшой Seahorse-образной структуры в медиальной височной доле [Рисунок 1 (12-14)].
- Удалить как гиппокампа мочки [Рисунок 1 (15,16)] и тщательно препарировать мозговые оболочки из лепестков, потянув с тонким пинцетом. Этот шаг позволяет избежать загрязнения конечного астроцитов культуры путем менингеальных клеток и фибробластов.
- Перенести подготовленные гиппокампа лепестка во второе блюдо , заполнены HBSS и вернуть его на лед [Рисунок 1 (17,18)]. Бассейн и гиппокампа мочки от одной мыши (P0 - P2) для подготовки бегемотаcampal астроцитов культуры. Это дает Астроцитарная нужную плотность. Фарш гиппокампа мочки используя острый стерильный хирургический нож (примерно в 4 раза).
- Отберите HBSS с блюдом с использованием стерильного наконечника, прикрепленный к 1 мл пипеткой и добавляют 3 мл 0,25% трипсина, перемешать, переносят в 15 мл стерильного коническую пробирку и инкубировать ткани при температуре 37 ° С в течение 20 мин при осторожном встряхивании.
- Центрифуга трубки при 300 мкг в течение 5 мин. Отберите супернатант осторожно с помощью стерильной стеклянной пипетки, прикрепленный к вакуумной линии. Добавляют 10 мл астроцитов гальваническое среды и тритурата (20 - 30 раз) с использованием огня полированного стекла пипетку до кусочки ткани не гомогенизируют.
- Центрифуга трубки при 300 мкг в течение 5 мин. Отберите супернатант и добавьте 2 мл свежего подогретую астроцитов гальванического СМИ. Pass клеток через фильтр с диаметром 70 мкм меш (клеточный фильтр) в новую 50 мл коническую трубку.
- Тарелка Всю суспензию клеток на поли-D-лизином / ламинина покрытием стерильной Т25 культуральную колбу, содержащую 3 мластроцитов металлизированный носитель, а затем инкубировать колбы при 37 ° С в 5% СО 2 инкубатора.
- Отберите все средства массовой информации в дня- я н-витро (ДИВ) 1, 3 и ДИВ ДИВ 7, и заменить 2 мл свежих астроцитов металлизированный сред. Обратите внимание на прогрессию и астроцитов впадения под световым микроскопом каждый раз при замене астроцитов осажденный СМИ.
Примечание: В Div 1, все жизнеспособные астроциты прикреплены к поверхности колбы культуры и мертвые или умирающие клетки, которые включают нейроны плывут в надосадочной жидкости. В DIV 3, прикрепленные клетки начинают делиться с образованием астроцитов слоя клеток. При отсутствии Поддерживающий условий, культура практически лишена какого-либо роста нейронов. На 7 DIV, астроцитов слой составляет около 80 - 90% сплошности и несколько микроглии, а также клетки-предшественники олигодендроцитов присутствуют на верхней части слоя астроцитов. - Аспирируйте осажденный среду из колбы, добавляют 2 мл свежего подогретую астроцитов металлизированный среды, полоскатьй удалить снова в DIV 11, когда астроциты сливная и готовы к югу культивирования.
- Добавить 2 мл 0,25% трипсина, аккуратно поверните колбы несколько раз, и аспирата трипсина, используя стерильную стеклянную пипетку.
- Добавляют 2 мл 0,25% трипсина и пусть колбу сидеть в культуре ткани капот в течение 4 - 5 мин при комнатной температуре.
- Удалить трипсина и держать колбу при 37 ° С в 5% CO 2 инкубаторе в течение 10 мин. Добавить 5 мл предварительно нагретые астроцитов гальваническое среды и снять астроцитов слой, нажав колбу против вашей ладони (3 - 4 раза) с последующим растиранием нежным, чтобы добиться полного отряд и собирать астроциты в 15 мл коническую трубку.
- Центрифуга трубки при 300 мкг в течение 5 мин, аспирация супернатант и добавьте 1 мл свежего астроцитов осажденный среды.
- Добавьте 10 мкл суспензии клеток в гемоцитометра и подсчета клеток в большом центральном сетчатом участке (1 мм 2) с использованием контрастного микроскопа инвертированный по фазе (10x цель). Multiply от 10 4 до оценки количества клеток на мл. Один T25 колбу даст ~ 1 × 10 6 клеток всего диссоциированы. Семенной ~ 1 × 10 5 клеток в 2 мл астроцитов обшивке среды на 12 мм диаметр поли-D-лизин с предварительным покрытием покровного стекла в лунку культуральной чашке 24-луночного.
- Инкубировать при 37 ° С в 5% СО 2 инкубатора. Выполните OGD / REOX в DIV 12 - 14 (раздел 2).
- Относитесь астроцитов культуры на 3 с DIV L-лейцина (LME) гидрохлорида 5 мМ до 11, если DIV гиппокампа культуры лишенные микроглии желательны. После инкубации LME, при условии культур встряхивании (300 оборотов в минуту в течение 1 ч), чтобы удалить загрязняющие микроглии.
Примечание: LME является микроглии цитотоксический агент , который широко используется в качестве метода для устранения пролиферирующих микроглии 22.
2. OGD / REOX Лечение
- Аспирируйте средств массовой информации из покровного содержащие клейкий астроцитов культуры (ДИВ 12 - 14) и полоскать 3 разаосторожно вращая 24-луночного культуры блюдо держит покровного пару раз с 1 мл изотонического раствора OGD (рН 7,4) , содержащей (в мМ): 0 глюкозы, 21 NaHCO 3, 120 NaCl, 5,36 KCl, 0,33 Na 2 HPO 4, 0,44 KH 2 PO 4, 1,27 CaCl 2 и 0,81 MgSO 4.
- Добавить 0,2 мл раствора OGD в лунку для покрытия покровное и инкубировать в течение 2 ч в гипоксических инкубаторе , содержащем 94% N 2, 1% O 2, и 5% CO 2. Аккуратно перемешайте с орбитальном шейкере (50 оборотов в минуту) в течение первых 30 мин гипоксии для облегчения обмена газа.
- Выдержите нормоксических контрольные клетки в течение 2 ч в 5% СО 2 и атмосферного воздуха в буфере , идентичный раствору OGD для добавления 5,5 мМ глюкозы , за исключением.
- Для REOX, аспирация раствор OGD и добавляют 2 мл астроцитов металлизированный среды. Выдержите в 5% CO 2 и атмосферного воздуха при 37 ° С в течение 5 часов.
3. Иммуноцитохимическая Окрашивание </ Р>
- Аспирируйте культуральной среды с помощью стерильной стеклянной пипетки, прикрепленный к вакуумной линии и быстро прополоскать покровное один раз добавлением 1 мл 0,1 М Трис-буферном солевом растворе (TBS) (154 мМ NaCl, 16 мМ Trizma основание, 84 мМ Трис-HCl, рН 7,4) к колодцу. Отберите и добавляют 2 мл 4% параформальдегида (PFA) в 1x фосфатным буферным физиологическим раствором (PBS). Инкубируют в течение 15 мин при комнатной температуре.
- Отберите и добавить 1 мл 0,1 М TBS, а затем поместить на ротационном шейкере в течение 2 мин. Повторите 3 раза. Добавьте 1 мл блокирующего раствора (10% козьей сыворотки, 10 мг / мл БСА, 0,025% Тритон Х-100 в 0,1 М TBS) и инкубируют в течение 30 мин при 37 ° С на ротационном шейкере.
- Отберите блокирующего раствора и добавить первичный Мышиные моноклональные анти-GFAP антитела (0,2 мл 1: 500 разбавление в блокирующем растворе) и кроличьи поликлональные анти-S100B (1: 500) или кроличьи поликлональные анти-HIF1α (1: 200) в течение 60 мин при 37 ° с на ротационном шейкере.
- С другой стороны, некоторые астроциты инкубируют с кроличьей поликлональной анти-Iba1 (1: 200) и мыши пнoclonal анти-MAP2 для доступа чистоты культуры.
- Отберите первичное антитело и прополоскать покровное путем добавления 1 мл 0,1 М TBS и размещения на ротационном шейкере в течение 2 мин, а затем аспирата. Повторите дважды.
- Добавить 0,2 мл 1: 200 разбавлением вторичного козы к антителам кролика 488-конъюгированных и анти-мышь 568-конъюгированных антител в блокирующем растворе в течение 60 мин при 37 ° С на ротационном шейкере.
- Отберите вторичное антитело и полоскать покровное путем добавления 1 мл 0,1 М TBS и место на ротационном шейкере в течение 2 мин, а затем аспирата. Повторите дважды.
- Удалить покровное из скважины и сухой путем размещения на слайде, расположенный на слайде-осушителя. Гора покровное на новый слайд путем переворачивания на одной капле Vectashield hardset монтажной среды с DAPI (1,5 нг / мкл).
- Image покровные на конфокальной микроскопии с использованием либо 20X сухой или 60X цели масла. Получение изображений (512 х 512) для DAPI (405 нм ех / 450 нм EM) и флуорохромом 488 помечено GFAP антитела (488 нм ех / 515 нмЭм). Держите параметры получения постоянной в пределах 20X и 60X групп.
4. Секс Определение с помощью ПЦР
- Тепло щениться носок или обрывы пальцев при 95 ° С в течение 45 мин в 50 мМ NaOH и нейтрализуют с равным объемом 1 М Трис, рН 6,8.
- Добавить 1 мкл раствора ДНК, извлеченной до 19 мкл следующей смеси: 5 пмоль праймеров для генов Myog и SRY, 1x реакционного буфера, 0,2 мМ каждого дезоксинуклеотид и 8 U Taq-полимеразы.
- С помощью праймеров последовательностей; Sry 5'TCATGAGACTGCCAACCACAG3 ', 5'CATGACCACCACCACCACCAA3' и Myog 5'TTACGTCCATCGTGGACAGC3 ', 5'TGGGCTGGGTGTTAGTCTTA3' 23.
- Выполните следующие ПЦР-протокол: 95 ° С в течение 3 мин, затем 30 циклов денатурации при 95 ° С в течение 15 с, отжиг при 58 ° С в течение 15 с, а относительное удлинение при 72 ° С в течение 1 мин. Вслед за этим в 30 циклов, реакция завершается конечной 72 ° C Удлинение в течение 1 мин.
- Отдельный ПКR продукты электрофоретически на этидий бромидом, содержащего 2% -ном агарозном геле и визуализировать под действием УФ-освещении. (Рисунок 2A.) ВНИМАНИЕ! Бромистый этидий является потенциальным канцерогеном и должны быть тщательно обработаны и утилизировать надлежащим образом в соответствии с правилами учреждения.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Понимание роли Sexed функций астроцитов в физиологических или патофизиологических условиях были чрезвычайно выяснены путем культивирования этих клеток в условиях в пробирке. Важным аспектом выполнения Sexed Культивирование, чтобы определить пол детеныша мыши до его использования. Мы определили пол мыши генетически с помощью ПЦР и путем визуальной оценки (рисунок 2) 16. Методология определения пола с помощью ПЦР был принят с изменениями от McClive и Синклера, быстро, просто и легко воспроизводимым методом 23. Рисунок 2А показывает репрезентативные результаты определения пола с помощью ПЦР. ПЦР-продукты были произведены с ДНК, извлеченной из двух репрезентативных P1 мужского и женского хвоста надрезами. Реакция включает уплотненные пары праймеров для генов SRY и Myog , которые генерируют мужские специфические полосы 441 п.н. и женской specifIC полосы 245 б.п., соответственно. Визуальное определение новорожденных (P 1 - 3) мыши секс с невооруженным глазом было установлено, глядя на наличие небольшого потемневшего пятна между аногенитальные отверстий только у самцов (рис 2В) 16,24.
Несмотря на то, культивирование астроцитов удобно и относительно легко установить под лаборатории, созданной, это преимущество может быть затруднено его загрязнения в первую очередь с микроглии или нейроны в меньшей степени. Заражение астроцитов может быть легко определено с помощью иммунноокрашивания из культивируемых клеток с клеточными специфическими маркерами либо микроглии (Iba1) или нейронов (map2). В настоящем исследовании, наблюдались гиппокампа астроцитов , произрастающие в первичных культурах монослоя иметь ~ 6% загрязняющими микроглии в DIV 14, как это было предложено несколько ячеек, выраженных Iba1 (рисунок 3). Наоборот, не было обнаружено ни одна из ячеек, чтобы выразить map2 предполагаякультура была полностью лишена какой - либо нейронного загрязнения (рисунок 3). Незначительные микроглии загрязнение наблюдается в наших культурах в соответствии с другими отчетами, в которых авторы сообщили микроглии загрязнения 5% в своих первичных корковых астроцитов культур , полученных из 1 - 3-дневных крысят мыши 25. Астроциты обладают специфическим цитоархитектуры, что позволяет им реагировать на изменения в их микросреды, включая гипоксию. Для того чтобы определить какой - либо конкретный секс астроцитов ответ на экстракорпоральное ишемии, мы подвергали Sexed гиппокампа астроцитов к OGD / REOX. Успешная индукция OGD / REOX определялась увеличением ядерной экспрессии индуцируемого гипоксией фактора 1 - альфа (HIF1α наблюдается в GFAP + астроциты , подвергнутых 2 ч OGD , а затем 5 ч REOX по сравнению с HIF1α выражений в клетках при нормоксических условиях (рисунок 4 ).
(рисунок 5). GFAP и S100B были локализуется в цитоплазме и клеточных тел астроцитов, характеризующих зрелую астроцитов стадии развития , когда эти клетки , как правило, теряют нервных стволовых клеток (НСК) потенциал 26. Морфология и плотность GFAP или S100B immunoreactivities были одинаковыми в обеих мужских и женских астроцитов культур, как отмечено в соответствующих нормоксических и группах лечения OGD / REOX. Под нормоксических условиях, гиппокампа астроцитов представил многоугольной к веретеновидный и плоской морфологии [Рисунок 5A, B (нормоксии 60X; стрелка)], оцениваемое с помощью конфокальной микроскопии. Эти клетки были способны не делить до конфлюэнтного в течение примерно 2 недель до индукции OGD / REOX. Через 2 ч OGD и 5 ч REOX, астроциты выставлены классические Reactiве астроцитов морфологии , отображающее УБРАНЫ первичных процессов, гипертрофию сомы и процессов, а также повышенную экспрессию GFAP или S100B [Рисунок 5A, B (OGD / REOX, 60X; стрелолист)]. После OGD / REOX, окрашивание GFAP / S100B также показали обширную сетчатую структуру, проходящую через цитоплазму в обоих мужского и женского пола гиппокампа астроцитов. Отсутствие GFAP окрашивания наблюдается в культивированных гиппокампа астроцитов из GFAP нулевых мышей служили в качестве отрицательного контроля (Фиг.5В, вставка). Приведенные выше результаты дают прямые свидетельства того, что морфология GFAP / S100B-иммунореактивного астроцитов претерпевает значительные изменения при воздействии OGD-REOX.
Рисунок 1. Иллюстрации гиппокампа Снятие Техника из P1 мышей. 1. Обезглавьте детеныша, чтобы удалить голову.2, 3. С помощью тонких ножниц, сделать срединный разрез кожи, задней к передней, и отогните кожу с помощью плоским наконечником пинцетом. 4, 5, 6. Сделайте небольшой надрез на основании череп. Вырезать череп вдоль средней линии и отслаиваться две половинки , чтобы обнажить мозг. 7, 8. Удалить мозжечок с помощью изогнутого пинцета. 9. Осторожно вынуть мозг из черепной коробки и поместить в стерильную чашку Петри. 10, 11. Флип мозг таким образом , что вентральная поверхность головного мозга была обращена вверх , используя изогнутым пинцетом, а затем отделить обоих полушарий с острым стерильным хирургическим скальпелем. 12, 13, 14. Снимите выпирающий и среднего мозга , оставляя ткани зрительного бугра неповрежденного , лежащий в основе полушарие и раскрывающий гиппокамп. 15, 16. Удалите гиппокамп (малый с-образную структуру). 17, 18. Сразу же место гиппокампа мочки , полученные от обеих полусферы в отдельный чашку Петри , содержащую стерильный HBSS. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2. Определение Пол неонатальных мышей. A. Мышь секс был генетически детерминированных с помощью ПЦР с использованием праймеров , специфичных для Myog (Х - хромосомы) и генов Sry (Y - хромосомы) с использованием ДНК , выделенной из палец или вырезок (F 1; M 1). Полосы ПЦР визуализировали на агарозном геле 2% этидиумбромидом при ультрафиолетовом освещении. F 2 и М 2 служили в качестве положительного контроля для женского и мужского пола, соответственно. B. Визуальное определение самца от самки была создана путем выявления затемненное место между отверстиями аногенитальной (стрелка).urce.jove.com/files/ftp_upload/53695/53695fig2large.jpg "целевых =" _blank "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 3. Чистота первичной мыши гиппокампа астроцитов культуры. Иммунным астроцитов культуры с нейронного маркера MAP2 (красный) и микроглии маркером Iba1 (зеленый). Ядра окрашиваются 4 ', 6'-диамидино-2-фенилиндола (DAPI) (синий). Стрелка указывает на загрязнение микроглии. Шкала бар:. 50 мкм Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 4. HIF1α Выражение было вмятые в культивируемых гиппокампа астроцитов выдержан в OGD / REOX. Представитель иммунофлуоресцентные изображения , показывающие GFAP (красный) и HIF1α (зеленый) маркировки в астроциты подвергнутых (А) нормоксии или (B) OGD (2 ч) / REOX (5 ч). Ядра окрашиваются 4 ', 6'-диамидино-2-фенилиндола (DAPI) (синий). Стрелка, низкое выражение HIF1α; стрелолист, повышенные ядерное выражение HIF1α. Шкала бар:. 25 мкм Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 5. повышающая регуляция S100B или GFAP экспрессии в Sexed гиппокампа астроцитов культур ниже OGD-REOX. Sexed культивированные астроциты гиппокампа окрашивают для S110b или экспрессии GFAP при нормоксических условиях или после того, как 2ч OGD затем 5 ч REOX (OGD / REOX). Врезка: 60X изображение из гиппокампа астроцитов культивируют из GFAP нулевых мышей. Шкала бар: 30 мкм.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Для изучения половых различий в свойствах и функции астроцитов при физиологических и патологических состояниях, подготовка Sexed первичных астроцитов в культуре клеток является важным инструментом для использования. В настоящем исследовании мы сообщаем высокоэффективным и воспроизводимый метод для культивирования сильно обогащены гомогенной популяции Sexed гиппокампа астроцитов от новорожденных (P0-P2) C57BL / 6 (дикий тип) или K19F (GFAP нуль) щенками мыши в пробирке. Установление этой методики помогает следователям понять физиологические и патологические функции Sexed гиппокампа астроцитов после того, как в лабораторных условиях ишемии.
Есть два важных шагов в создании этой методики в том числе поддержание стерильности и адекватного переваривания гиппокампа долей во время обработки трипсином с последующим растиранием переваренной ткани для достижения одноклеточной суспензии. Предотвращение первичных астроциты отполучение загрязненных является одной из самых больших проблем на протяжении всего процесса культивирования. Бактериальные и / или грибковой два распространенных режима загрязнения, которые могут оказывать культивируемые клетки бесполезны при надлежащем уходе не принимается во время выполнения техники. Следовательно, для того, чтобы обеспечить экспериментальный успех, необходимо, чтобы выполнять процесс в стерильной обстановке работы, которая включает в себя, дезинфицировать место работы перед использованием, с использованием стерильного хирургического оборудования и материалов, избегать контакта стерильных материалов с нестерильных поверхностей, с использованием ламинарный поток капот и избегать откупоренных колб культуры из ламинарным укрытием. Кроме того, во время ферментативной диссоциации, больше инкубацию ткани гиппокампа трипсином с последующим растиранием больших физических может привести к ее чрезмерной пищеварении приводит к плохой жизнеспособности клеток и неэффективному прикрепления диссоциированных клеток к культуре колб.
Напротив, underdigestion мозговой ткани обеспечивает недостаточноедиссоциации клеток глии, таким образом, что приводит к снижению урожайности и высева клеток как крупных комков. Поэтому для того, чтобы получить здоровых культур астроцитов, необходимо оптимизировать концентрацию трипсин, время инкубации и промывани с целью достижения оптимального перевариванию ткани гиппокампа. В наших руках, инкубация гиппокампа лепестков с рабочей концентрации 0,25% трипсина в течение 20 мин при комнатной температуре с последующим нежным растиранием в течение 20 - 30 раз дали сильный единомышленником, здоровым и высокой воспроизводимостью культуры астроцитов. Кроме того, повторное замораживание и размораживание реагентов перед использованием каждый раз, может привести к снижению их эффективности. Поэтому, очень важно аликвотных реагентов в небольших количествах, желательных и замораживания. Например, магазин трипсин, пенициллин / стрептомицин в 5 мл аликвоты и фетальной бычьей сыворотки в виде 50 мл аликвот в многочисленных стерильные конические пробирки при -20 ° С до использования. Мы рекомендуем не использовать антибиотики с истекшим сроком годности.
GFAP является авELL-маркер характеризуется реакционноспособных фиброзных астроцитов. После OGD / REOX, повышающая регуляция экспрессии GFAP в ответ на реактивную астроглиоза было сообщено 20. Несмотря на то , было высказано предположение , что избыточная экспрессия GFAP может быть использован в качестве конкретной цели для стратегий нейронный ремонтными 27 свою роль в гиппокампе повреждения после ГИ у новорожденных до сих пор неясно. Иммуногистохимическое окрашивание астроцитов с GFAP позволяет идентифицировать и охарактеризовать эти клетки в физиологических и патологических состояниях. GFAP окрашивания, как и любой другой маркер имеет некоторые ограничения, которые должны быть признаны. Одним из ограничений GFAP окрашивания астроцитов в том, что не все астроциты выразить GFAP в физиологических условиях. Особенно незрелые скорость экспрессии астроцитов в GFAP не превышает 40% при физиологических условиях 28. В зависимости от возраста и типа конкретного применения астроцитов, другие маркеры выбора можно считать такие, как GLAST, ALDH1L1, BLBP, аквапорин-4 и S100B 29.
Кроме того, наличие NSCs под видом астроциты в первичных культурах не может быть исключена. Эти NSC, было показано, что представить фенотипические и ультраструктурным аналогичные характеристики зрелых астроцитов в том числе экспрессию GFAP. Таким образом, идентификация молекулярных маркеров, которые являются специфическими для полностью дифференцированных и созревших астроцитов является обязательным. Астроциты были доведены до выраженной S100B на их позже полностью дифференцированных стадиях развития. В последнее время , было сообщено , что неонатальный кортикальный GFAP + астроциты утрачивают предшественников потенциал стволовых клеток с началом экспрессии S100B , которые происходят вокруг ДИВ 15 26. Точно так же, в наших условиях культивирования при ДИВ 14, 91% GFAP клеток , экспрессирующих было обнаружено , coexpress S100B, которые предполагают, что культуры состоят из главным образом терминально дифференцированных созревших гиппокампа астроцитов.
Это почти невозможно получить чистые первичные гиппокампа астроцитов культуры полностью лишены загрязняя клеток микроглии, которые находятся выше и ниже астроцитов монослоя. Поэтому важно знать долю загрязняющего микроглии в астроглиальные культурах, а также сохранить эту долю как можно более низкой. В настоящем исследовании мы окрашивали астроцитов культуры с микроглии специфическим маркером Iba1 или нейронального маркера МАР2 для того, чтобы определить присутствие каких-либо микроглии или нейронов в качестве потенциальных загрязнителей. Доля микроглии в грызунах астроцитов культуре может варьировать от 1% до 30% в зависимости от нескольких факторов , которые включают животные возраст, видов, региона, культуральную среду, метод пересева и встряхивая 30. В наших культурах мы наблюдали приблизительно 6% микроглии загрязнения , которая сравнима с другими отчетами 25. Если предполагаемое использование астроцитов культуры является изучение роли гиппокампа астроцитов воспаления крайне важнодля лечения культур с 5 мМ LME на 10 г для устранения возможного загрязнения микроглии в астроцитов культур , начиная с DIV 3. LME является микроглии цитотоксический агент , который широко используется в качестве способа для удаления пролиферирующих микроглии 20,22. Кроме того, на LME-обработанные культуры должны быть подвергнуты качалке протоколу (300 оборотов в минуту в течение 1 ч).
Еще одна техническая проблема при выполнении OGD / REOX является определить, есть ли достаточная степень гипоксии была достигнута, чтобы побудить астроглиоза. Маркеры для гипоксии в астроциты включают повышающую регуляцию GFAP и индукцию HIF-1. Таким образом, в данном исследовании гипоксии было подтверждено увеличением GFAP иммунореактивности (данные не показаны) и повышающая регуляция HIF1-альфа окрашивания (рисунок 4).
Таким образом, результаты, полученные из Sexed неонатальных гиппокампа культур астроцитов показали успешное прикрепление клеток со здоровой гомогенный астроцитов слоя диsplaying типичная морфология на покровные и экспрессию основного реактивного астроцитов маркеров GFAP и S100B при индукции в лабораторных условиях ишемии. Мы считаем, что протокол принят здесь имеет потенциал, чтобы ответить на важные механистического и трансляционные вопросы, касающиеся роли астроцитов в развитии мужского и женского мозга. Вся процедура культивирования в отличие от большинства существующих методов создает зрелых и вырожденные сексуальны гиппокампа астроцитов в течение двух недель, предоставляя быстрый поворот экспериментов и простоту техники будет способствовать использованию астроцитов метода культивирования в качестве инструмента для изучения секса Особая роль глиальных клеток в развитии мозга, тем самым позволяя его широкое распространение в исследованиях мозга.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ни один из авторов не имеют конкурирующие или конфликтующие интересы.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Astrocyte culture media | |||
| DMEM, high glucose | cellgro | 10-013-CV | |
| Horse Serum | Gibco | 26050-070 | Final Concentration: 10% |
| Penicillin-Streptomycin | Cellgro | 30-002-CI | Final Concentration: 1% |
| L-Leucine methyl ester hydrochloride | Aldrich | L1002-25G | Final Concentration: 5 mM |
| Solution for brain tissue digestion | |||
| HBSS | Life Technologies | 14170-088 | |
| Trypsin | cellgro | 25-050-CI | Final Concentration: 0.25% |
| Other | |||
| 70% (vol/vol) ethanol | Roth | 9065.2 | |
| Poly-D-Lysine (PDL) 12 mm round coverslips | Corning | 354087 | |
| Water | Sigma | W3500 | Cell-culture grade |
| PBS | cellgro | 21-040-CV | Cell-culture grade |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25300-062 | |
| 70 μm Sterile cell strainer | Fisher scientific | 22363548 | |
| 3.5 cm Petri dish | BD Falcon | 353001 | |
| 15 mL Falcon tube | BD Falcon | 352096 | |
| 50 mL Falcon tube | BD Falcon | 352070 | |
| Forceps, fine | Dumont | 2-1032; 2-1033 | # 3c; # 5 |
| Forceps, flat tip | KLS Martin | 12-120-11 | |
| 13 cm surgical scissors | Aesculap | BC-140-R | |
| Confocal Microscope | Nikon | A1RSi | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5805000.017 | 5804R |
| Orbital Shaker | Thermo Scientific | SHKE 4450-1CE | MaxQ 4450 |
| Anti-IBA1 | Wako | 019-19741 | Rabbit monoclonal |
| Anti-MAP2 | Sigma | M2320 | Mouse monoclonal |
| Anti-HIF1alpha | abcam | ab179483 | Rabbit monoclonal |
| Anti-S100B | Sigma | HPA015768 | Rabbit polyclonal |
| Anti-GFAP (cocktail) | Biolegend | 837602 | |
| VECTASTAIN Elite ABC Kit (Rabbit IgG) | Vector Labs | PK-6101 | Contains 4 Reagents |
| Goat Anti Rabbit Alexa-Fluor 488 | Invitrogen | A11070 | |
| Goat Anti Mouse Alexa-Fluor 568 | Invitrogen | A11004 |
References
- Powell, E. M., Geller, H. M. Dissection of astrocyte-mediated cues in neuronal guidance and process extension. Glia. 26, 73-83 (1999).
- Koehler, R. C., Roman, R. J., Harder, D. R. Astrocytes and the regulation of cerebral blood flow. Trends in neurosciences. 32, 160-169 (2009).
- Seifert, G., Schilling, K., Steinhauser, C. Astrocyte dysfunction in neurological disorders: a molecular perspective. Nature reviews. Neuroscience. 7, 194-206 (2006).
- Ballabh, P., Braun, A., Nedergaard, M. The blood-brain barrier: an overview: structure, regulation, and clinical implications. Neurobiology of disease. 16, 1-13 (2004).
- Araque, A., Parpura, V., Sanzgiri, R. P., Haydon, P. G. Tripartite synapses: glia, the unacknowledged partner. Trends in neurosciences. 22, 208-215 (1999).
- Anderson, M. A., Ao, Y., Sofroniew, M. V.
- Cengiz, P., et al. Inhibition of Na+/H+ exchanger isoform 1 is neuroprotective in neonatal hypoxic ischemic brain injury. Antioxidants & redox signaling. 14, 1803-1813 (2011).
- Ferriero, D. M.
- Hill, C. A., Fitch, R. H. Sex differences in mechanisms and outcome of neonatal hypoxia-ischemia in rodent models: implications for sex-specific neuroprotection in clinical neonatal practice. Neurol Res Int. , 1-9 (2012).
- Cikla, U., et al. ERalpha Signaling Is Required for TrkB-Mediated Hippocampal Neuroprotection in Female Neonatal Mice after Hypoxic Ischemic Encephalopathy(1,2,3). eNeuro. 3, (2016).
- Uluc, K., et al. TrkB receptor agonist 7, 8 dihydroxyflavone triggers profound gender- dependent neuroprotection in mice after perinatal hypoxia and ischemia. CNS Neurol Disord Drug Targets. 12, 360-370 (2013).
- Cikla, U., et al. Suppression of microglia activation after hypoxia-ischemia results in age-dependent improvements in neurologic injury. J Neuroimmunol. 291, 18-27 (2016).
- McQuillen, P. S., Ferriero, D. M. Selective vulnerability in the developing central nervous system. Pediatr Neurol. 30, 227-235 (2004).
- Morken, T. S., et al. Altered astrocyte-neuronal interactions after hypoxia-ischemia in the neonatal brain in female and male rats. Stroke; a journal of cerebral circulation. 45, 2777-2785 (2014).
- Chisholm, N. C., Sohrabji, F. Astrocytic response to cerebral ischemia is influenced by sex differences and impaired by aging. Neurobiology of disease. 85, 245-253 (2016).
- Liu, M., Oyarzabal, E. A., Yang, R., Murphy, S. J., Hurn, P. D. A novel method for assessing sex-specific and genotype-specific response to injury in astrocyte culture. Journal of neuroscience methods. 171, 214-217 (2008).
- Exploring the biological contributions to human health: does sex matter?. Journal of women's health & gender-based. 10, 433-439 (2001).
- Collins, F. S., Tabak, L. A. Policy: NIH plans to enhance reproducibility. Nature. 505, 612-613 (2014).
- Zhang, Y., et al. Rapid single-step induction of functional neurons from human pluripotent stem cells. Neuron. 78, 785-798 (2013).
- Cengiz, P., et al. Sustained Na+/H+ exchanger activation promotes gliotransmitter release from reactive hippocampal astrocytes following oxygen-glucose deprivation. PloS one. 9, e84294 (2014).
- Landis, S. C., et al. A call for transparent reporting to optimize the predictive value of preclinical research. Nature. 490, 187-191 (2012).
- Hamby, M. E., Uliasz, T. F., Hewett, S. J., Hewett, J. A. Characterization of an improved procedure for the removal of microglia from confluent monolayers of primary astrocytes. J Neurosci Methods. 150, 128-137 (2006).
- McClive, P. J., Sinclair, A. H. Rapid DNA extraction and PCR-sexing of mouse embryos. Molecular reproduction and development. 60, 225-226 (2001).
- Wolterink-Donselaar, I. G., Meerding, J. M., Fernandes, C. A method for gender determination in newborn dark pigmented mice. Lab Anim (NY). 38, 35-38 (2009).
- Uliasz, T. F., Hamby, M. E., Jackman, N. A., Hewett, J. A., Hewett, S. J. Generation of primary astrocyte cultures devoid of contaminating microglia. Methods Mol Biol. 814, 61-79 (2012).
- Raponi, E., et al. S100B expression defines a state in which GFAP-expressing cells lose their neural stem cell potential and acquire a more mature developmental stage. Glia. 55, 165-177 (2007).
- Souza, D. G., Bellaver, B., Souza, D. O., Quincozes-Santos, A. Characterization of adult rat astrocyte cultures. PloS one. 8, e60282 (2013).
- Puschmann, T. B., Dixon, K. J., Turnley, A. M. Species differences in reactivity of mouse and rat astrocytes in vitro. Neuro-Signals. 18, 152-163 (2010).
- Schildge, S., Bohrer, C., Beck, K., Schachtrup, C. Isolation and culture of mouse cortical astrocytes. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2013).
- Saura, J. Microglial cells in astroglial cultures: a cautionary note. J Neuroinflammation. 4 (26), (2007).
