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Neuroscience

Diferencias de sexo en el ratón del hipocampo después de astrocitos Published: October 25, 2016 doi: 10.3791/53695
Automatic Translation
1, 2, 1, 1, 1,3, 1,3
1Waisman Center, University of Wisconsin, 2Department of Neurological Surgery, University of Wisconsin, 3Department of Pediatrics, University of Wisconsin

Summary

Los astrocitos son uno de los jugadores clave más importantes en el sistema nervioso central (SNC). Aquí, estamos reportando un método práctico de protocolo de cultivo de astrocitos del hipocampo sexado con el fin de estudiar los mecanismos que subyacen a la función de los astrocitos en cachorros recién nacidos masculinos y femeninos después de la isquemia in vitro.

Abstract

Astrogliosis siguiente / isquemia (HI) -relacionado lesión cerebral por hipoxia juega un papel en el aumento de la morbilidad y la mortalidad en los recién nacidos. Los estudios clínicos recientes indican que la gravedad de la lesión cerebral parece ser dependiente del sexo, y que los recién nacidos varones son más susceptibles a los efectos de la lesión cerebral relacionada con HI, dando lugar a resultados neurológicos más graves en comparación con las mujeres con lesiones cerebrales comparables. El desarrollo de métodos fiables para aislar y mantener las poblaciones altamente enriquecidas de los astrocitos del hipocampo sexuado es esencial para entender las bases celulares de las diferencias sexuales en las consecuencias patológicas de HI neonatal. En este estudio, se describe un método para crear cultivos de astrocitos de hipocampo específicos del sexo que están sometidos a un modelo de isquemia in vitro, la privación de glucosa en oxígeno, seguido por la reoxigenación. astrogliosis reactiva subsiguiente fue examinado por immunostaiNing para la proteína glial fibrilar ácida (GFAP) y S100B. Este método proporciona una herramienta útil para estudiar el papel de los astrocitos del hipocampo masculinos y femeninos siguiente neonatal HI, por separado.

Introduction

Los astrocitos son uno de los jugadores clave más importantes en el sistema nervioso central (SNC). La creciente cuerpo de evidencia indica que las funciones de los astrocitos son más que proporcionar apoyo neuronal. De hecho, las funciones de los astrocitos en condiciones fisiológicas pueden ser muy complejos, como guía la migración de los axones en desarrollo 1, la regulación de CNS flujo de sangre 2, el mantenimiento de la homeostasis del pH del fluido intersticial sináptica 3, y participar en la barrera hematoencefálica 4 y 5 la transmisión sináptica. En condiciones patológicas, los astrocitos responden a la lesión con un proceso llamado astrogliosis reactiva en la que la morfología, el número, la ubicación, la topografía (con respecto a la distancia de insulto) y la función de los astrocitos pueden cambiar de una manera heterogénea 6,7. Astrogliosis visto después de la encefalopatía hipóxico-isquémica neonatal puede que contribuye a la morbilidad y la mortalidad de los recién nacidos

estudios clínicos y experimentales recientes indican que la gravedad de la lesión cerebral parece ser dependiente del sexo y que los recién nacidos masculinos son más susceptibles a los efectos de la hipoxia / isquemia (HI) lesión cerebral -related, resultando en resultados neurológicos más graves en comparación con las mujeres con lesiones cerebrales comparables 9-11. Aunque la localización de la lesión depende de la edad gestacional y la duración y la gravedad de la lesión, el hipocampo es una de las regiones más comúnmente realizada en el SNC después neonatal HI plazo, y astrogliosis hipocampo ha sido confirmado por la sobre regulación de aumento la proteína glial fibrilar ácida (GFAP) 3 d después de la HI neonatal 7,10,12,13. Las diferencias de sexo en función de los astrocitos se muestran en ambos neonatos y roedores adultos después de la isquemia cerebral 14,15. Además, la susceptibilidad astrocytic macho a la isquemia in vitro se demostró por el aumento de cell muerte en comparación con los astrocitos corticales femeninas en la cultura 16.

Las diferencias de sexo comienzan en el útero y continúan hasta la muerte 17. Durante la última década, la importancia de incluir los sexos en condiciones experimentales en cultivo celular y estudios in vivo han sido el énfasis del Instituto de Medicina y los NIH para buscar el conocimiento fundamental de las diferencias sexuales observadas en condiciones fisiológicas y patológicas 17,18 . El desarrollo de métodos fiables para aislar y mantener las poblaciones de astrocitos del hipocampo sexuado es esencial para entender las bases celulares de las diferencias sexuales en las consecuencias patológicas de HI neonatal. El presente estudio fue diseñado para proporcionar las técnicas para preparar cultivos de astrocitos del hipocampo sexo-específicas enriquecidas a partir de ratones recién nacidos con el fin de evaluar el papel de los astrocitos GFAP-inmunorreactivas siguientes oxígeno / glucosa Privación (OGD) y reoxigenación (Reox), induciendoHI en el ambiente de cultivo celular. Esta técnica se puede utilizar para probar cualquier hipótesis relativa a los astrocitos del hipocampo en los machos y hembras neonatales en condiciones de normoxia e isquémicos.

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Protocol

NOTA: Este estudio se realizó de conformidad con la recomendación de la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio del Instituto Nacional de Salud. El animal protocolo fue aprobado por la Universidad de Wisconsin-Madison, Institucional Cuidado de Animales y el empleo. Protocolo de cultivo de astrocitos primarios que se presenta aquí se adopta a partir de los protocolos presentados por Zhang Y 19 et al., Y Cengiz P 20 et al., Con algunas modificaciones.

1. La disección y del hipocampo Astrocyte Cultura

  1. Preparar todos los reactivos y materiales necesarios, incluyendo tijeras quirúrgicas, pinzas finas lisas, pinzas de punta plana, toallas de papel, bolsas de basura, 70% de etanol y 2 platos de disección (3,5 cm de diámetro) en el hielo llenos de 2 Solución de ml salina equilibrada de Hank (HBSS) cada . Asegúrese de que el equipo quirúrgico son estériles (autoclave) antes del procedimiento y el uso de todos los demás materiales (Astrocyte medio de baño: suero de DMEM + 5% + caballo1% de penicilina-estreptomicina, suero de caballo, HBSS, 0,25% de tripsina, cubreobjetos de vidrio, placas de Petri, 15/50 ml tubos, matraces T25, etc.) como pre-estéril.
  2. Coloque un lado y rociar la cabeza y el cuello de la cría de ratón con un 70% de etanol y decapitar con unas tijeras estériles afiladas [Figura 1 (1)].
  3. Realizar una incisión en la línea media de posterior a anterior cráneo con unas tijeras pequeñas a lo largo del cuero cabelludo para exponer el cerebro [Figura 1 (2-3)].
  4. Cortar el cráneo con cuidado desde el cuello hasta la nariz con pequeñas tijeras. A continuación, corte anterior cráneo hasta los bulbos olfativos e inferior al cerebelo para desconectar el cráneo desde la base del cráneo.
  5. Hacer una pequeña incisión en la base del cráneo y cortar a lo largo de la línea media. El uso de fórceps de punta plana estériles para despegar el cráneo. Quitar el tallo cerebral con la ayuda de unas pinzas curvas. Retire el cerebro del cráneo y el lugar en el primer plato de disección [Figura 1 (4-9)] 21.
  6. Usando unas pinzas curvas, darle la vuelta al cerebro de manera que la superficie ventral del cerebro esté orientada hacia arriba y luego separar los dos hemisferios con una cuchilla quirúrgica estéril aguda [Figura 1 (10,11)]
  7. Despegue los hemisferios cerebrales y cuidadosamente retire el tejido del cerebro medio y el tálamo abultada con unas pinzas curvas planas estériles para revelar el hipocampo, una estructura pequeña, con forma de caballito de mar en el lóbulo temporal medial [Figura 1 (12-14)].
  8. Eliminar tanto los lóbulos del hipocampo [Figura 1 (15,16)] y diseccionar cuidadosamente las meninges de los lóbulos tirando con las pinzas finas. Este paso evita contaminación del cultivo de astrocitos definitiva por células de las meninges y los fibroblastos.
  9. La transferencia de los lóbulos del hipocampo preparados en el segundo plato lleno de HBSS y devolverlo en hielo [Figura 1 (17,18)]. Piscina, tanto del hipocampo lóbulos de un solo ratón (P0 - P2) para la preparación de hipopótamocultivos de astrocitos campal. Esto le da a la densidad apropiada de astrocitos. Picar lóbulos del hipocampo utilizando una cuchilla afilada quirúrgico estéril (aproximadamente 4 veces).
  10. Aspirar HBSS del plato utilizando una punta estéril conectada a una pipeta de 1 ml y añadir 3 ml de tripsina al 0,25%, mezcla, transferir a un tubo cónico estéril de 15 ml e incubar el tejido a 37 ° C durante 20 minutos con agitación suave.
  11. Tubo de centrífuga a 300 xg durante 5 min. Aspirar el sobrenadante con cuidado usando una pipeta de vidrio estéril conectada a una línea de vacío. Añadir 10 ml de astrocitos medio y se tritura chapado (20 - 30 veces) usando una pipeta de vidrio pulida al fuego hasta que las piezas de tejido homogeneizar.
  12. Tubo de centrífuga a 300 xg durante 5 min. Aspirar el sobrenadante y añadir 2 ml de medio de astrocitos chapado fresca precalentada. Pase células a través de un filtro de malla 70 micras (filtro de células) en un nuevo tubo cónico de 50 mL.
  13. toda la placa de suspensión de células en un matraz de cultivo T25 estéril poli-D-lisina / laminina recubierta que contiene 3 ml demedios de astrocitos chapado, a continuación, se incuba el matraz a 37 ° C en una incubadora de CO2 al 5%.
  14. Toda Aspirar los medios de comunicación en día- i n-vitro (DIV) 1, 3 y DIV DIV 7, y reemplazar con 2 ml de medio fresco de astrocitos en placas. Observar la progresión y la confluencia de los astrocitos bajo microscopio de luz cada vez, mientras que la sustitución de los medios de comunicación astrocito chapado.
    NOTA: En DIV 1, todos los astrocitos viables están unidas a la superficie del matraz de cultivo y las células muertas o moribundas que incluyen neuronas están flotando en el sobrenadante. En DIV 3, las células unidas comienzan a dividirse para formar la capa de células de los astrocitos. En ausencia de las condiciones de apoyo, la cultura es casi desprovisto de cualquier crecimiento neuronal. En DIV 7, la capa de astrocitos es de aproximadamente 80 - 90% confluentes y unos pocos microglia, así como precursores de oligodendrocitos están presentes en la parte superior de la capa de astrocitos.
  15. Aspirar el medio en placa del matraz, añadir 2 ml de medio precalentado astrocito chapado fresca, enjuague unand remover de nuevo en DIV 11, cuando los astrocitos son confluentes y listo para sub cultivo.
  16. Añadir 2 ml de tripsina al 0,25%, gire suavemente el frasco unas cuantas veces y tripsina aspirado utilizando una pipeta de vidrio estéril.
  17. Añadir 2 ml de tripsina al 0,25% y dejó que el matraz se sienta en la campana de cultivo de tejidos durante 4 - 5 min a temperatura ambiente.
  18. Retire la tripsina y mantener el matraz a 37 ° C en una incubadora de CO2 al 5% durante 10 min. Añadir 5 ml precalentado astrocito medio en placa y separar la capa de astrocito tocando el frasco contra la palma de la mano (3 - 4 veces) seguido por trituración suave para lograr la separación completa y recoger los astrocitos en un tubo cónico de 15 ml.
  19. tubo de centrifugación a 300 xg durante 5 minutos, aspirar el sobrenadante, y se añade 1 ml de medio fresco astrocito chapado.
  20. Añadir 10 l de la suspensión celular a un hemocitómetro y contar las células en la gran zona cuadriculada central (1 mm 2) usando un microscopio de contraste de fases invertido (objetivo 10X). multiply por 10 4 para estimar el número de células por ml. Un matraz T25 rendirá ~ 1 x 10 6 células totales disociado. Seed ~ 1 x 10 5 células en 2 ml de astrocitos medio en placa en un 12 mm de diámetro de poli-D-lisina cubreobjetos de vidrio con capa preliminar en el pocillo de una placa de cultivo de 24 pocillos.
  21. Se incuba a 37 ° C en una incubadora de CO2 al 5%. Realizar OGD / Reox en DIV 12 - 14 (apartado 2).
  22. El tratamiento de los cultivos de astrocitos en DIV 3 con clorhidrato de 5 mM de L-leucina metil éster (LME) hasta DIV 11 si se desean cultivos de hipocampo carentes de la microglia. Después de la incubación de la LME, los cultivos sometidos a agitación (300 rpm durante 1 h) para eliminar la contaminación de la microglía.
    NOTA: LME es un agente citotóxico microglial que se ha utilizado ampliamente como un método para eliminar la proliferación de microglia 22.

2. OGD / Tratamiento Reox

  1. Aspirar los medios de cultivo que contienen cubreobjetos astrocito adherente (DIV 12 - 14) y enjuagar 3 veceshaciendo girar suavemente la placa de cultivo de 24 pocillos que sostiene el cubreobjetos un par de veces con 1 ml de solución isotónica de OGD (pH 7,4) que contiene (en mM): 0 glucosa, 21 NaHCO 3, 120 NaCl, 5,36 KCl, 0,33 Na 2 HPO 4, 0,44 KH 2 PO 4, CaCl2 1,27 y 0,81 MgSO4.
  2. Añadir 0,2 ml de solución OGD para así cubrir el cubreobjetos y se incuba durante 2 h en un incubador hipóxico que contiene 94% N 2, 1% O 2, y 5% de CO 2. Mezclar suavemente con un agitador orbital (50 rpm) para la primera 30 min de hipoxia para facilitar el intercambio de gases.
  3. Se incuban las células de control de normoxia durante 2 h en 5% de CO2 y aire atmosférico en un tampón idéntico a la solución OGD a excepción de la adición de glucosa 5,5 mM.
  4. Para Reox, solución OGD aspirado y añadir 2 ml de medio de baño de astrocitos. Incubar en 5% de CO2 y aire atmosférico a 37 ° C durante 5 h.

3. La tinción inmunocitoquímica </ P>

  1. Aspirar los medios de cultivo usando una pipeta de vidrio estéril unida a una línea de vacío y enjuague rápidamente cubreobjetos una vez mediante la adición de 1 ml de 0,1 M Tris Buffered Saline (TBS) (NaCl 154 mM, 16 mM Trizma Base, 84 mM Tris-HCl, pH 7,4) al pozo. Aspirar y añadir 2 ml de paraformaldehído al 4% (PFA) en 1x Tampón fosfato salino (PBS). Incubar durante 15 min a TA.
  2. Aspirar y agregar 1 ml de TBS 0,1 M, a continuación, colocar en un agitador oscilante durante 2 min. Repetir 3 veces. Añadir 1 ml de solución (10% de suero de cabra, 10 mg / ml de BSA, 0,025% de Triton X-100 en 0,1 M TBS) de bloqueo y se incuba durante 30 min a 37 ° C en un agitador de balanceo.
  3. Aspirar solución de bloqueo y añadir anticuerpo-GFAP contra monoclonal primario de ratón (0,2 ml de una dilución 1: 500 en solución de bloqueo) y policlonal de conejo anti-S100B (1: 500) o policlonal de conejo anti-HIF1α (1: 200) durante 60 min a 37 ° C en un agitador de balanceo.
  4. Alternativamente, algunos astrocitos se incubaron con anticuerpo policlonal de conejo anti-Iba1 (1: 200) y ratón lunoclonal anti-MAP2 para acceder a la pureza del cultivo.
  5. Aspirar anticuerpo primario y enjuague cubreobjetos mediante la adición de 1 ml de 0,1 M TBS y colocar en un agitador de balanceo durante 2 min y luego aspirar. Repetir dos veces.
  6. Añadir 0,2 ml de una dilución 1: 200 de los anticuerpos anti-conejo conjugados 568 488-conjugados y anti-ratón de cabra secundario en solución de bloqueo durante 60 min a 37 ° C en un agitador de balanceo.
  7. Aspirar el anticuerpo secundario y enjuague cubreobjetos mediante la adición de 1 ml de 0,1 M TBS y se deposita en un agitador oscilante durante 2 min y luego aspirado. Repetir dos veces.
  8. Retire el cubreobjetos de bien y seca mediante la colocación en un portaobjetos situado sobre un portaobjetos de pelo. CUBREOBJETOS en una nueva diapositiva mediante la inversión en una sola gota de medio de montaje Vectashield Hardset con DAPI (1,5 ng / l).
  9. cubreobjetos de imagen en un microscopio confocal utilizando 20X petróleo objetivo seco o 60X. Adquirir imágenes (512 x 512) para DAPI (405 nm ex / em 450 nm) y 488 fluorocromo etiquetados anticuerpo GFAP (488 nm ex / 515 nmem). Mantener constantes los parámetros de adquisición dentro de la 20X y 60X grupos.

4. Determinación del Sexo El uso de PCR

  1. dedo del pie perrito calor o recortes de los dedos a 95 ° C durante 45 minutos en NaOH 50 mM y se neutralizan con un volumen igual de Tris 1 M, pH 6,8.
  2. Añadir 1 l de la solución de ADN se extrajo a 19 l de la siguiente mezcla: 5 pmoles de cebadores para los genes MYOG y SRY, tampón de reacción 1x, 0,2 mM de cada uno de desoxinucleótido y 8 U Taq polimerasa.
  3. Utilizar secuencias de cebadores; Sry 5'TCATGAGACTGCCAACCACAG3 ', 5'CATGACCACCACCACCACCAA3' y MYOG 5'TTACGTCCATCGTGGACAGC3 ', 5'TGGGCTGGGTGTTAGTCTTA3' 23.
  4. Realizar el siguiente protocolo de PCR: 95 ° C durante 3 min, a continuación 30 ciclos de desnaturalización a 95 ° C durante 15 s, hibridación a 58 ° C durante 15 s, y elongación a 72 ° C durante 1 min. Después de estos 30 ciclos, la reacción concluye con una final de elongación a 72ºC durante 1 min.
  5. PC separadaProductos R electroforéticamente en un gel de agarosa con bromuro de etidio que contiene 2% y visualizar bajo iluminación UV. PRECAUCIÓN (Figura 2A.)! El bromuro de etidio es un carcinógeno potencial y debe ser manejado con cuidado y eliminarse adecuadamente según las regulaciones de la institución.

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Representative Results

La comprensión de las funciones de las funciones de astrocitos sexado bajo condiciones fisiológicas o fisiopatológicas se han dilucidado inmensamente mediante el cultivo de estas células en condiciones in vitro. El aspecto importante de la realización de cultivo sexuado es determinar el sexo de la cría de ratón antes de su uso. Se determinó el sexo del ratón genéticamente por PCR y por la evaluación visual (Figura 2) 16. La metodología de determinación del sexo mediante PCR fue aprobado con modificaciones de McClive y Sinclair, es rápido, simple y altamente reproducible método 23. Figura 2A muestra los resultados representativos de la determinación del sexo usando PCR. Los productos de PCR se generaron con el ADN extraído de dos tijeras P1 masculinas y femeninas representativas de la cola. La reacción incluye pares de cebadores multiplexados para genes Sry y MYOG que generan bandas específicas masculinas de 441 pb y espe femeninabandas IC de 245 pb, respectivamente. Determinación visual de neonatal (P 1 - 3) el sexo del ratón con el ojo desnudo se estableció mediante la búsqueda de la presencia de la pequeña mancha oscurecida entre las aberturas anogenitales sólo en los machos (Figura 2 B) 16,24.

Aunque, el cultivo de los astrocitos es conveniente y relativamente fácil de establecer condiciones de laboratorio establecido, esta ventaja puede ser obstaculizada por su contaminación principalmente con microglia o neuronas en menor medida. La contaminación de los astrocitos se puede determinar fácilmente por inmunomarcaje de las células cultivadas con marcadores específicos de células, ya sea para microglia (Iba1) o neuronas (MAP2). En el presente estudio, se observó que los astrocitos del hipocampo que crecen en cultivos monocapa primarios tener ~ 6% de la microglia contaminantes en DIV 14, según lo sugerido por algunas células que expresaban Iba1 (Figura 3). Por el contrario, se encontró que ninguna de las células para expresar MAP2 sugiriendola cultura era totalmente carente de cualquier tipo de contaminación neuronal (Figura 3). La contaminación microglial menor observada en nuestros cultivos está de acuerdo con otros informes, en el que los autores informaron una contaminación microglial 5% en sus cultivos de astrocitos corticales primarios derivados 1-3 días de edad, crías de ratón 25. Los astrocitos poseen una arquitectura celular específica que les permita responder a los cambios en su microambiente incluyendo la hipoxia. Con el fin de determinar cualquier respuesta específica de los astrocitos sexo a la isquemia-vitro en, sometimos astrocitos del hipocampo sexado a OGD / Reox. Inducción exitosa de OGD / Reox se determinó mediante el aumento de la expresión nuclear de factor inducible por hipoxia 1 alfa (HIF1α observó en astrocitos GFAP + sometidos a 2 h OGD seguido de 5 h Reox en comparación con las expresiones HIF1α en células en condiciones de normoxia (Figura 4 ).

(Figura 5). GFAP y S100B fueron colocalized en los cuerpos de citoplasma y celular de astrocitos, que caracterizan a una etapa de desarrollo de los astrocitos madurado en estas células tienden a perder su célula madre neural (NSC) potencial 26. La morfología y la densidad de GFAP o inmunorreactividades S100B fueron similares en ambos cultivos de astrocitos masculinos y femeninos como se observa en sus respectivos grupos de tratamiento y de normoxia OGD / Reox. En condiciones de normoxia, astrocitos del hipocampo presentaron una poligonal a fusiforme y la morfología plana [Figura 5A, B (normoxia 60X; flecha)], tal como se evaluó mediante microscopía confocal. Estas células fueron capaces de dividir hasta confluencia durante aproximadamente 2 semanas antes de la inducción de la OGD / Reox. Después de 2 h OGD y 5 h Reox, astrocitos mostraron reacti clásicosve la morfología de astrocitos presentan procesos primarios retraídos, hipertrofia del soma y procesos, y el aumento de la expresión de GFAP o S100B [Figura 5A, B (OGD / Reox, 60X; punta de flecha)]. Después de la OGD / Reox, la tinción GFAP / S100B también exhibió una extensa malla se extiende a través del citoplasma, tanto en el macho y astrocitos del hipocampo femeninos. La falta de tinción GFAP observada en los astrocitos de hipocampo cultivadas a partir de ratones nulos GFAP sirvió como un control negativo (Figura 5B, recuadro). Los resultados anteriores proporcionan evidencia directa de que la morfología de astrocitos GFAP / S100B inmunorreactivas sufre cambios significativos cuando se somete a OGD-Reox.

Figura 1
Figura 1. Ejemplos de la técnica de eliminación de hipocampo de ratones P1. 1. Decapitar a las crías para quitar la cabeza.2, 3. Usando tijeras finas, hacer una incisión en la línea media de la piel, posterior a anterior, y remueva la piel con la ayuda de unas pinzas de punta plana. 4, 5, 6. Haga una pequeña incisión en la base de la cráneo. Cortar el cráneo a lo largo de la línea media y pelar dos mitades para exponer el cerebro. 7, 8. Retire cerebelo con la ayuda de unas pinzas curvas. 9. Retirar con cuidado el cerebro del cráneo y el lugar en una placa de Petri estéril. 10, 11. Da la vuelta al cerebro de manera que la superficie ventral del cerebro esté hacia arriba usando unas pinzas curvas, a continuación, separar los dos hemisferios con una hoja de bisturí estéril agudo. 12, 13, 14. Retire el tejido protuberante mesencéfalo y el tálamo dejando intacto el hemisferio subyacente y revelar el hipocampo. 15, 16. Retire el hipocampo (estructura pequeña en forma de C). 17, 18. Inmediatamente colocar los lóbulos del hipocampo obtenidos a partir de las dos de la hemisferios en una plato aparte de Petri que contiene HBSS estéril. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2
Figura 2. Determinación del Sexo de ratones recién nacidos. Una. Ratón se determinó el sexo genético por PCR con cebadores específicos para los genes Sry (cromosoma Y) usando ADN extraído de dedo o del dedo recortes MYOG (cromosoma X) y (f 1; M 1). Las bandas de PCR se visualizaron en un gel de agarosa al 2% con bromuro de etidio bajo iluminación UV. F 2 y M 2 sirvieron como controles positivos para la hembra y macho, respectivamente. B. determinación visual del hombre de la mujer se estableció mediante la identificación de un punto oscuro entre las aberturas anogenitales (flecha).urce.jove.com/files/ftp_upload/53695/53695fig2large.jpg "target =" _ blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

figura 3
Figura 3. La pureza del ratón primaria del hipocampo Astrocyte Cultura. La inmunotinción de la cultura de los astrocitos con MAP2 marcador neuronal (rojo) y Iba1 marcador de microglia (verde). Los núcleos se tiñeron con 4 ', 6'-diamino-2-fenilindol (DAPI) (azul). La flecha indica la contaminación microglia. Barra de escala:. 50 micras Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4
Figura 4. HIF1α Expresión estaba enarrugados en astrocitos del hipocampo cultivadas Expuestos a la OGD / Reox. inmunofluorescencia imágenes representativas que muestran GFAP (rojo) y el etiquetado HIF1α (verde) en astrocitos sometidos a normoxia (A) o (B) OGD (2 h) / Reox (5 h). Los núcleos se tiñeron con 4 ', 6'-diamino-2-fenilindol (DAPI) (azul). Flecha, baja expresión HIF1α; punta de flecha, HIF1α elevada expresión nuclear. Barra de escala:. 25 micras Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5
Figura 5. Sobre regulación de S100B o expresión de GFAP en astrocitos del hipocampo Sexed culturas siguiente OGD-Reox. Astrocitos del hipocampo en cultivo sexado se tiñeron para S110B o expresión de GFAP en condiciones de normoxia o después de 2h OGD seguido por 5 h de Reox (OGD / Reox). Recuadro: imagen 60X a partir de astrocitos del hipocampo en cultivo a partir de ratones nulos GFAP. Barra de escala: 30 micras.

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Discussion

Con el fin de estudiar las diferencias de sexo en las propiedades y funciones de los astrocitos en condiciones fisiológicas y patológicas, la preparación de los astrocitos primarios sexado en cultivo celular es una herramienta importante que se utilice. En el presente estudio se presenta un altamente eficiente y un método reproducible a la cultura de una población homogénea altamente enriquecido de los astrocitos del hipocampo sexado de recién nacido (P0-P2) C57Bl / 6 (de tipo salvaje) o K19F (GFAP nulo) crías de ratón in vitro. El establecimiento de esta metodología ayuda a los investigadores a comprender las funciones fisiológicas y patológicas de los astrocitos del hipocampo sexado después de la isquemia in vitro.

Hay dos pasos críticos en el establecimiento de esta metodología, incluyendo el mantenimiento de la esterilidad y la digestión adecuada de los lóbulos del hipocampo durante tripsinización seguido de trituración del tejido digerido con el fin de conseguir la suspensión de células individuales. Prevención de astrocitos primarios a partir deconseguir contaminada es uno de los desafíos más grandes de todo el proceso de cultivo. Bacteriana y / o micótica son dos modos comunes de contaminación que pueden hacer que las células cultivadas inútil si se cuida bien no se adoptó mientras se realiza la técnica. Por lo tanto, con el fin de asegurar el éxito experimental, es imprescindible para llevar a cabo el proceso bajo un entorno de trabajo estéril que incluye, desinfectar el lugar de trabajo antes de su uso, utilizando un equipo quirúrgico estéril y materiales, evitar el contacto de los materiales estériles con superficies no estériles, utilizando una campana de flujo laminar y evitar tomar frascos de cultivo sin tope de la campana laminar. Además, durante la disociación enzimática, la incubación más larga de tejido del hipocampo con tripsina seguido por extensa trituración física puede conducir a su sobre-digestión resultando en una mala viabilidad celular y la unión ineficaz de células disociadas a frascos de cultivo.

Por el contrario, underdigestion del tejido cerebral proporciona insuficientela disociación de las células de la glia que resulta en bajos rendimientos y la siembra de células en forma de grumos grandes. Por lo tanto, con el fin de obtener cultivos de astrocitos sanos, es necesario para optimizar la concentración de tripsina, tiempo de incubación y la trituración para lograr una óptima digestión del tejido del hipocampo. En nuestras manos, la incubación de los lóbulos del hipocampo con la concentración de trabajo de 0,25% de tripsina durante 20 min a TA seguido por trituración suave durante 20 - 30 veces dio adherente fuerte, saludable y cultivos de astrocitos altamente reproducibles. Además, la congelación y descongelación de los reactivos antes de su uso cada vez que puede reducir su eficacia repetido. Por lo tanto, es muy importante para los reactivos de la alícuota en pequeñas cantidades deseables y congelar. Por ejemplo, almacenar la tripsina, penicilina / estreptomicina como alícuotas de 5 ml y suero bovino fetal como alícuotas de 50 ml en numerosos tubos cónicos estériles a -20 ° C hasta su uso. Aconsejamos no usar antibióticos más allá de la fecha de caducidad.

GFAP es awmarcador de astrocitos fibrosos reactivos ell-caracterizado. Después de la OGD / Reox, la regulación positiva de la expresión de GFAP en respuesta a astrogliosis reactiva ha informado 20. Aunque, se ha propuesto que la sobreexpresión de GFAP se podría utilizar como objetivo específico para estrategias de reparación neuronal 27 su papel en la lesión del hipocampo después de HI en los recién nacidos todavía no está claro. La tinción inmunohistoquímica de los astrocitos con GFAP nos permite identificar y caracterizar estas células en las condiciones fisiológicas y patológicas. GFAP tinción como cualquier otro marcador tiene algunas limitaciones que deben ser reconocidos. Una de las limitaciones de la tinción GFAP de astrocitos es que no todos los astrocitos expresan GFAP en condiciones fisiológicas. Especialmente la proporción de expresión de astrocitos inmaduros de GFAP no exceda de 40% en condiciones fisiológicas 28. Dependiendo del uso edad y el tipo específico de los astrocitos, otros marcadores de elección pueden ser considerados como GLAST, ALDH1L1, BLBP, acuaporina-4 y 29 S100B.

Por otra parte, la presencia de células madre neurales disfrazado de astrocitos en los cultivos primarios no pueden descartarse. Estos NSCs se ha demostrado que presentan características fenotípicas y ultraestructurales similares a madurar astrocitos, incluyendo la expresión de GFAP. Por lo tanto, la identificación de marcadores moleculares que son específicos para los astrocitos completamente diferenciadas y madurado es una necesidad. Los astrocitos fueron reportados a S100B expresado en sus últimas etapas de desarrollo totalmente diferenciadas. Recientemente, se ha informado de que neonatal cortical GFAP + astrocitos pierden su progenitor potencial de células madre con el inicio de la expresión S100B que suceda alrededor DIV 15 26. Del mismo modo, en nuestras condiciones de cultivo en DIV 14, 91% de células que expresan GFAP se encontró que coexpresan S100B, que sugieren que los fermentos consisten en astrocitos del hipocampo madurado principalmente terminales diferenciadas.

Es casi imposible obtener cultivos de astrocitos del hipocampo primario puros totalmente desprovistas de contaminación de las células microgliales que residen encima y por debajo de la monocapa de astrocitos. Por lo tanto, es importante conocer la proporción de contaminación de microglia en cultivos astrogliales y también para mantener esta proporción lo más baja posible. En el presente estudio hemos manchado con cultivos de astrocitos microglia Iba1 marcador específico o MAP2 marcador neuronal con el fin de determinar la presencia de cualquier microglia o neuronas como contaminantes potenciales. La proporción de microglia en cultivo de astrocitos roedor puede variar de 1% a 30% dependiendo de varios factores que incluyen la edad del animal, especie, región, medio de cultivo, el método de subcultivo y agitando 30. En nuestras culturas se observó aproximadamente un 6% de la contaminación de la microglia, que es comparable con otros informes 25. Si el uso pretendido de la cultura de los astrocitos es estudiar el papel de los astrocitos del hipocampo en la inflamación es imperativopara el tratamiento de los cultivos con LME 5 mM durante 10 d para eliminar la posible contaminación microglial en los cultivos de astrocitos a partir de DIV 3. LME es un agente citotóxico microglial que se ha utilizado ampliamente como un método para eliminar la proliferación de microglia 20,22. Además, los cultivos tratados con LME deben ser sometidos a un protocolo de agitación (300 rpm durante 1 h).

Otro desafío técnico en la realización de OGD / Reox es determinar si un grado suficiente de hipoxia se ha logrado para inducir astrogliosis. Marcadores de hipoxia en los astrocitos incluyen la regulación de GFAP y la inducción de HIF-1α. Por lo tanto, en este estudio la hipoxia fue confirmado por el aumento de la inmunorreactividad de GFAP (datos no mostrados) y la regulación al alza de la tinción de HIF1-α (Figura 4).

En resumen, los resultados obtenidos a partir de cultivos de astrocitos de hipocampo neonatales sexado mostraron unión de las células con éxito saludable capa de astrocitos homogénea diextendiendo morfología típica en cubreobjetos y la expresión de la principal marcadores GFAP astrocitos reactivos y S100B a la inducción de isquemia in vitro. Creemos que el protocolo adoptado aquí tiene el potencial para responder a importantes preguntas mecanicistas y de la traducción relacionados con el papel de los astrocitos en el desarrollo de los cerebros de hombres y mujeres. Todo el procedimiento de cultivo en contraposición a la mayoría de las técnicas existentes genera astrocitos del hipocampo maduros y confluentes sexuado en dos semanas, la concesión de un rápido cambio de experimentos y de la simplicidad de la técnica facilitará el uso de método de cultivo astrocytic como una herramienta para estudiar el sexo papel específico de las células gliales en el cerebro en desarrollo, lo que permitirá una amplia difusión de la investigación del cerebro.

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Disclosures

Ninguno de los autores han intereses en competencia o en conflicto.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Astrocyte culture media
DMEM, high glucose cellgro 10-013-CV
Horse Serum Gibco 26050-070 Final Concentration: 10%
Penicillin-Streptomycin Cellgro  30-002-CI Final Concentration: 1%
L-Leucine methyl ester hydrochloride Aldrich L1002-25G Final Concentration: 5 mM
Solution for brain tissue digestion
HBSS Life Technologies 14170-088
Trypsin cellgro 25-050-CI Final Concentration: 0.25%
Other
70% (vol/vol) ethanol Roth 9065.2
Poly-D-Lysine (PDL) 12 mm round coverslips  Corning 354087
Water Sigma W3500 Cell-culture grade
PBS cellgro 21-040-CV Cell-culture grade
0.05% Trypsin-EDTA  Life Technologies 25300-062
70 μm Sterile cell strainer  Fisher scientific 22363548
3.5 cm Petri dish BD Falcon 353001
15 mL Falcon tube BD Falcon 352096
50 mL Falcon tube BD Falcon 352070
Forceps, fine  Dumont 2-1032; 2-1033 # 3c; # 5
Forceps, flat tip KLS Martin 12-120-11
13 cm surgical scissors Aesculap BC-140-R
Confocal Microscope Nikon A1RSi 
Centrifuge Eppendorf 5805000.017 5804R
Orbital Shaker Thermo Scientific SHKE 4450-1CE MaxQ 4450 
Anti-IBA1 Wako 019-19741 Rabbit monoclonal
Anti-MAP2 Sigma M2320 Mouse monoclonal
Anti-HIF1alpha abcam ab179483 Rabbit monoclonal
Anti-S100B Sigma HPA015768 Rabbit polyclonal
Anti-GFAP (cocktail) Biolegend 837602
VECTASTAIN Elite ABC Kit (Rabbit IgG) Vector Labs PK-6101 Contains 4 Reagents 
Goat Anti Rabbit Alexa-Fluor 488 Invitrogen A11070
Goat Anti Mouse Alexa-Fluor 568 Invitrogen A11004

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Chanana, V., Tumturk, A., Kintner, D., Udho, E., Ferrazzano, P., Cengiz, P. Sex Differences in Mouse Hippocampal Astrocytes after In-Vitro Ischemia. J. Vis. Exp. (116), e53695, doi:10.3791/53695 (2016).

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