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Neuroscience

As diferenças sexuais no mouse do hipocampo astrócitos após Published: October 25, 2016 doi: 10.3791/53695
Automatic Translation
1, 2, 1, 1, 1,3, 1,3
1Waisman Center, University of Wisconsin, 2Department of Neurological Surgery, University of Wisconsin, 3Department of Pediatrics, University of Wisconsin

Summary

Os astrócitos são um dos principais intervenientes mais importantes no sistema nervoso central (SNC). Aqui, nós estamos relatando um método prático de protocolo de cultura de astrócitos do hipocampo sexuado, a fim de estudar os mecanismos subjacentes a função de astrócitos em filhotes recém-nascidos do sexo masculino e feminino após isquemia in-vitro.

Abstract

Astrogliosis seguinte hipóxia / isquemia (HI) lesão cerebral -relacionados desempenha um papel no aumento da morbidade e mortalidade em recém-nascidos. Estudos clínicos recentes indicam que a gravidade da lesão cerebral parece ser dependente do sexo, e que os machos recém-nascidos são mais susceptíveis aos efeitos de lesões cerebrais relacionadas-HI, resultando nos resultados neurológicos mais graves, em comparação com mulheres com lesões cerebrais comparáveis. O desenvolvimento de métodos confiáveis ​​para isolar e manter populações altamente enriquecido de astrócitos do hipocampo sexuado é essencial para compreender a base celular das diferenças sexuais nas consequências patológicas de HI neonatal. Neste estudo, descrevemos um método para a criação de culturas de astrócitos do sexo específicos do hipocampo que são submetidos a um modelo de isquemia in vitro, a privação de oxigénio-glicose, seguida por reoxigenação. astrogliosis reactiva subsequente foi examinado por immunostaiNing para a proteína glial fibrilar ácida (GFAP) e a S100B. Este método fornece uma ferramenta útil para estudar o papel do sexo masculino e astrócitos do hipocampo do sexo feminino seguinte HI neonatal, separadamente.

Introduction

Os astrócitos são um dos principais intervenientes mais importantes no sistema nervoso central (SNC). Crescente corpo de evidências indica que os papéis de astrócitos são mais do que apoio neuronal. Na verdade, o papel dos astrócitos em condições fisiológicas pode ser muito complexo, tais como guiar a migração de axónios em desenvolvimento 1, regulando SNC fluxo de sangue 2, a manutenção da homeostase do sináptica fluido intersticial 3 pH, e participam na barreira hemato-encefálica 4 e 5 da transmissão sináptica. Em condições patológicas, astrócitos responder a uma lesão com um processo chamado astrogliose reactivo em que a morfologia, número, localização, topografia (em relação à distância do insulto) e a função dos astrocitos podem mudar de uma forma heterogénea 6,7. Astrogliosis visto seguinte encefalopatia hipóxico-isquémica neonatal talvez contribuindo para a morbidade e mortalidade de recém-nascidos

estudos clínicos e experimentais recentes indicam que a gravidade da lesão cerebral parece ser dependente do sexo e que os machos recém-nascidos são mais susceptíveis aos efeitos de hipoxia / isquemia (HI) lesão cerebral -relacionados, resultando nos resultados neurológicos mais graves, em comparação com mulheres com lesões cerebrais comparáveis 9-11. Embora a localização da lesão depende da idade gestacional e a duração e a gravidade da lesão, hipocampo é uma das regiões mais vulgarmente efectuada no SNC após HI neonatal prazo, e aumentou astrogliose hipocampo foi confirmada por super-regulação de a proteína glial fibrilar ácida (GFAP) 3 d após a HI neonatal 7,10,12,13. Diferenças sexuais em função de astrócitos foram mostrados em ambos os recém-nascidos e roedores adultos após isquemia cerebral 14,15. Além disso, a susceptibilidade de astrócitos do sexo masculino de isquemia in vitro foi demonstrado por um aumento da CELl morte em comparação com astrócitos corticais do sexo feminino na cultura 16.

Diferenças sexuais começar no útero e continuam até a morte 17. Durante a última década, a importância de incluir os sexos em condições experimentais em cultura celular e in vivo estudos têm sido a ênfase do Instituto de Medicina e NIH para buscar conhecimentos fundamentais nas diferenças de sexo visto em condições fisiológicas e patológicas 17,18 . Desenvolvimento de métodos confiáveis ​​para isolar e manter populações de astrócitos do hipocampo sexuado é essencial para compreender a base celular das diferenças sexuais nas consequências patológicas de HI neonatal. O presente estudo foi desenhado para proporcionar as técnicas para preparar culturas de astrócitos do hipocampo específicas do sexo enriquecidos de ratos recém-nascidos, a fim de avaliar os papéis de astrócitos GFAP-imunoreativos seguintes Oxygen / Glucose Privação (OGD) e reoxigenação (Reox), induzindoHl em meio de cultura de células. Esta técnica pode ser usado para testar qualquer hipótese referente a astrócitos do hipocampo em machos e fêmeas neonatais sob condições de normóxia e isquémicas.

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Protocol

NOTA: Este estudo foi realizado de acordo com a recomendação do Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório do Instituto Nacional de Saúde. O protocolo animal foi aprovado pela Universidade de Wisconsin-Madison, Institutional Animal Care e do Comitê Use. Protocolo de Cultura Astrocyte primário que é apresentado aqui é adotada a partir dos protocolos apresentados por Zhang Y 19 et al. E Cengiz P 20 et al., Com algumas modificações.

1. hipocampo Dissecção e Cultura Astrocyte

  1. Prepare todos os reagentes e materiais necessários, incluindo tesouras cirúrgicas, fórceps finos lisos, uma pinça ponta plana, toalhas de papel, saco de lixo, 70% de etanol e 2 pratos de dissecação (3,5 cm de diâmetro) no gelo cheias de 2 Solução Salina Equilibrada de mL Hank (HBSS) cada . Certifique-se do equipamento cirúrgico são estéreis (autoclave) antes do procedimento e utilizar todos os outros materiais (Astrocyte chapeamento meio: soro DMEM + 5% + cavalo1% de penicilina-estreptomicina, soro de cavalo, de HBSS, 0,25% de tripsina, lamelas de vidro, placas de Petri, 15/50 mL tubos, frascos T25, etc.) como pré-esterilizado.
  2. Pressione cuidadosamente e pulverizar a cabeça e pescoço do cachorro rato com 70% de etanol e decapitar usando uma tesoura esterilizada afiadas [Figura 1 (1)].
  3. Realizar uma incisão mediana de posterior para anterior crânio com uma tesoura pequena ao longo do couro cabeludo para expor o cérebro [Figura 1 (2-3)].
  4. Cortar o crânio com cuidado desde o pescoço até o nariz com uma tesoura pequena. Em seguida, corte crânio anterior para os bulbos olfatórios e inferior ao cerebelo para desconectar o crânio da base do crânio.
  5. Fazer uma pequena incisão na base do crânio e cortar ao longo da linha média. Use uma pinça de ponta chata estéreis para descascar o crânio. Remover o tronco cerebral com a ajuda de uma pinça curvos. Remover o cérebro do crânio e colocar para o primeiro prato de dissecação [Figura 1 (4-9)] 21.
  6. Usando uma pinça curva, virar o cérebro de modo que a superfície ventral do cérebro é voltado para cima e, em seguida, separar os dois hemisférios com uma lâmina cirúrgica estéril afiada [Figura 1 (10,11)]
  7. Retire os hemisférios cerebrais e remova cuidadosamente o tecido mesencéfalo e tálamo abaulamento com um estéreis pinças curvas planas para revelar o hipocampo, uma estrutura pequena, cavalo marinho em forma no lobo temporal medial [Figura 1 (12-14)].
  8. Remova ambos os lóbulos do hipocampo [Figura 1 (15,16)] e dissecar cuidadosamente as meninges de lobos puxando com a pinça fina. Este passo evita a contaminação da cultura final do astrócito por células meníngeas e fibroblastos.
  9. Transferir os lóbulos do hipocampo preparados para o segundo prato cheio com HBSS e devolvê-lo em gelo [Figura 1 (17,18)]. Piscina ambos hipocampo lóbulos de um único rato (P0 - P2) para preparação de hipopótamoculturas Campal astrócitos. Isto dá a densidade apropriada dos astrócitos. Picar lobos do hipocampo, utilizando uma lâmina cirúrgica estéril afiada (aproximadamente 4 vezes).
  10. Aspirar HBSS de prato usando uma ponta estéril ligada a uma pipeta de 1 mL e adicionar 3 ml de 0,25% de tripsina, misturar e transferir para um tubo cónico de 15 ml estéril e a incubação do tecido a 37 ° C durante 20 min com agitação suave.
  11. tubo de centrifugação a 300 xg durante 5 min. Aspirar o sobrenadante cuidadosamente, utilizando uma pipeta de vidro estéril ligada a uma linha de vácuo. Adicionar 10 ml de astrócitos chapeamento médio e triturado (20 - 30 vezes) usando um fogo polido pipeta de vidro até pedaços de tecido homogeneizar.
  12. tubo de centrifugação a 300 xg durante 5 min. Aspirar o sobrenadante e adicionar 2 mL de meio de astrócitos chapeamento pré-aquecido fresco. Passar as células através de um filtro de malha de 70 um (filtro de células) para um novo tubo cónico de 50 mL.
  13. suspensão de células em placa inteira num frasco de cultura T25 estéril poli-D-lisina / laminina, contendo 3 mL revestido demeios de astrócitos plaqueamento, depois incubar o balão a 37 ° C numa incubadora de CO2 a 5%.
  14. Toda Aspirar mídia na dia- i n-vitro (DIV) 1, DIV 3 e DIV 7, e substituir com 2 mL de meio de astrócitos chapeamento frescos. Observe a progressão e confluência astrocitária sob microscópio de luz cada vez que ao substituir a mídia astrócitos chapeamento.
    NOTA: A DIV 1, todos os astrócitos viáveis ​​são ligadas à superfície do frasco de cultura e as células mortas ou a morrer que incluem neurónios estão a flutuar no sobrenadante. No DIV 3, as células ligadas começar a dividir para formar a camada de células de astrócitos. Na ausência de condições favoráveis, a cultura é quase desprovida de qualquer crescimento neuronal. No DIV 7, astrócitos camada é de cerca de 80 - 90% confluentes e alguns microglia, bem como células precursoras de oligodendrócitos estão presentes no topo da camada de astrócitos.
  15. Aspirar o meio chapeamento do frasco, adicionar 2 mL de meio de astrócitos chapeamento pré-aquecido fresco, lavar and remover novamente no DIV 11, quando os astrócitos são confluentes e pronto para a sub cultura.
  16. Adicionar 2 mL de tripsina a 0,25%, rode suavemente o frasco algumas vezes e aspirado de tripsina usando uma pipeta de vidro esterilizado.
  17. Adicionar 2 mL de tripsina a 0,25% e deixar que o balão se sentar na capa de cultura de tecidos para 4-5 min a RT.
  18. Remover a tripsina e manter o balão a 37 ° C numa incubadora de CO2 a 5% durante 10 min. Adicionar 5 mL pré-aquecido astrócitos chapeamento médio e retirar a camada de astrócitos tocando o frasco contra a palma da sua mão (3 - 4 vezes) seguido por trituração suave para conseguir separação completa e recolher os astrócitos em um tubo cônico de 15 mL.
  19. tubo de centrifugação a 300 xg durante 5 min, aspirar o sobrenadante e adicionar 1 mL de meio fresco astrócitos chapeamento.
  20. Adicionam-se 10 uL da suspensão de células para um hemocitómetro e contar as células na grande superfície reticulada central (1 mm2), utilizando um microscópio de contraste de fase invertida (objectiva 10X). Multiply por 10 4 para estimar o número de células por mL. Um balão T25 produzirá ~ 1 x 10 6 células totais dissociado. Semente ~ 1 x 10 5 células em 2 ml de astrócitos do plaqueamento em meio de um diâmetro de Poli-D-Lisina lamela de vidro pré-revestidas com 12 mm de o poço de uma placa de cultura de 24 poços.
  21. Incubar a 37 ° C numa incubadora de CO2 a 5%. Execute OGD / Reox na DIV 12-14 (seção 2).
  22. Tratar as culturas de astrócitos na DIV 3 com cloridrato de 5 mM L-leucina éster metílico (LME) até DIV 11 se culturas de hipocampo desprovidas de microglia são desejados. Após LME incubação, as culturas sujeitas a agitação (300 rpm durante 1 h) para remover contaminantes microglia.
    NOTA: LME é um agente citotóxico da microglia que tem sido amplamente utilizado como um método para eliminar a proliferação microglia 22.

2. OGD / Reox Tratamento

  1. media aspirado de lamela contendo cultura de astrócitos aderente (DIV 12-14) e lavar 3 vezespor rotação suave a 24 poços de cultura prato que prende a lamela algumas vezes com 1 mL de solução isotónica OGD (pH 7,4) contendo (em mM): 0 de glucose, 21 de NaHCO3, 120 NaCl, 5.36 KCl, 0,33 Na 2 HPO 4, 0,44 KH 2 PO 4, 1,27 de CaCl2, e 0,81 MgSO 4.
  2. Adicionar 0,2 mL de solução a OGD bem para cobrir a lamela e incubar durante 2 h numa incubadora hipóxico contendo 94% de N 2, 1% de O2, e 5% de CO 2. Misturar suavemente com um agitador orbital (50 rpm) durante os primeiros 30 minutos de hipoxia para facilitar o intercâmbio de gás.
  3. Incubar as células de controlo normóxicas durante 2 h em 5% de CO 2 e o ar atmosférico em um tampão idêntica à solução OGD, excepto a adição de 5,5 mM de glucose.
  4. Para Reox, aspirado solução OGD e adicionar 2 mL de astrócitos chapeamento médio. Incubar em 5% de CO 2 e o ar atmosférico, a 37 ° C durante 5 h.

3. imunocitoquímica Coloração </ P>

  1. Aspirar o meio de cultura usando uma pipeta de vidro estéril ligada a uma linha de vácuo e rapidamente enxaguar lamela uma vez por adição de 1 mL de 0,1 M de Tris salino tamponado (TBS) (NaCl 154 mM, 16 mM, de Trizma base, Tris-HCl a 84, pH 7,4) para o poço. Aspirar e juntar 2 ml de paraformaldeído a 4% (PFA) em 1x tampão fosfato salino (PBS). Incubar durante 15 minutos à TA.
  2. Aspirar e adicionar 1 mL de 0,1 M TBS, em seguida, coloque em um agitador de balanço por 2 min. Repita 3 vezes. Adicionar 1 ml de solução (soro de cabra a 10%, 10 mg / mL de BSA, 0,025% de Triton X-100 a 0,1 M em TBS) de bloqueio e incubar durante 30 min a 37 ° C num agitador de balanço.
  3. Aspirar solução de bloqueio e adicionar anticorpo-GFAP monoclonal anti-primário do rato (0,2 mL de uma diluição de 1: 500 em solução de bloqueio) e soro policlonal de coelho anti-S100B (1: 500) ou anticorpo policlonal de coelho anti-HIF1α (1: 200) durante 60 min a 37 ° C num agitador de balanço.
  4. Alternativamente, alguns astrócitos são incubadas com anticorpo policlonal de coelho anti-IBA1 (1: 200) e seg ratooclonal anti-MAP2 para acessar a pureza da cultura.
  5. Aspirar anticorpo primário e enxaguar lamela pela adição de 1 mL de 0,1 M TBS e colocação num agitador de balanço por 2 min e depois aspirar. Repita duas vezes.
  6. Adicionar 0,2 ml de uma diluição 1: 200 dos anticorpos anti-coelho conjugados 568-488-conjugados e anti-ratinho de cabra secundário em solução de bloqueio durante 60 minutos a 37 ° C num agitador de balanço.
  7. Aspirar anticorpo secundário e enxaguar lamela pela adição de 1 mL de 0,1 M TBS e coloque num agitador de balanço por 2 min e depois aspirar. Repita duas vezes.
  8. Remover lamela de bem e seco, colocando em um slide posicionado sobre uma lâmina de cabelo. Mount lamela em um novo slide, invertendo em uma única gota de Vectashield hardset meio de montagem com DAPI (1,5 ng / mL).
  9. lamelas de imagem em um microscópio confocal usando 20X objetivo óleo seco ou 60X. Aquisição de imagens (512 x 512) para DAPI (405 nm ex / 450 nm em) e fluorocromo 488 etiquetado anticorpo GFAP (488 nm ex / 515 nmem). Manter parâmetros de aquisição constantes dentro do 20X e 60X grupos.

4. A determinação do sexo Usando PCR

  1. Calor pup dedo do pé ou dedo para recortes de 95 ° C durante 45 min em NaOH 50 mM e neutraliza-se com igual volume de Tris 1 M, pH 6,8.
  2. Adicionar 1 mL da solução de ADN extraído a 19 uL da mistura seguinte: 5 pmol de iniciadores para os genes Myog e Sry, 1x tampão de reacção, 0,2 mM de cada desoxinucleótido e 8 U de Taq polimerase.
  3. Use sequências de primers; Sry 5'TCATGAGACTGCCAACCACAG3 ', 5'CATGACCACCACCACCACCAA3' e Myog 5'TTACGTCCATCGTGGACAGC3 ', 5'TGGGCTGGGTGTTAGTCTTA3' 23.
  4. Executar o seguinte protocolo de PCR: 95 ° C durante 3 min, depois 30 ciclos de desnaturação a 95 ° C durante 15 s, emparelhamento a 58 ° C durante 15 s, e alongamento a 72 ° C durante 1 min. Seguindo esta 30 ciclos, a reacção termina com um final de 72 ° C alongamento durante 1 min.
  5. PC separadoProdutos R electroforeticamente num gel de brometo de etidio contendo 2% de agarose e visualização sob luz UV. (Figura 2A). CUIDADO! O brometo de etídio é um potencial cancerígeno e deve ser manuseado com cuidado e descartados de forma apropriada de acordo com os regulamentos da instituição.

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Representative Results

Compreender os papéis de funções de astrócitos sexado em condições fisiológicas ou fisiopatológicas foram imensamente elucidada por cultura destas células sob condições in vitro. O aspecto importante da cultura realizando sexuado é para determinar o sexo do filhote de rato antes da sua utilização. Determinou-se o sexo do ratinho geneticamente por PCR e por avaliação visual (Figura 2) 16. A metodologia de determinação do sexo usando PCR foi aprovado com modificações de McClive e Sinclair, é rápido, simples e altamente reprodutível método 23. A Figura 2A mostra os resultados representativos de determinação do sexo usando PCR. Os produtos de PCR foram gerados com ADN extraído a partir de dois recortes representativos P1 masculinos e femininos cauda. A reação inclui pares de primers multiplexados para genes Sry e Myog que geram bandas específicas do sexo masculino de 441 pb e especi femininabandas ic de 245 pb, respectivamente. Determinação visual da neonatal (P 1 - 3) sexo rato com olho nu foi estabelecida por procurando a presença de uma pequena mancha escurecida entre aberturas anogenitais apenas em machos (Figura 2b) 16,24.

Embora, a cultura de astrócitos é conveniente e relativamente fácil de definir em laboratório montado, esta vantagem pode ser prejudicada pela sua contaminação, principalmente com microglia ou neurônios, em menor medida. A contaminação dos astrócitos podem ser facilmente determinadas por imunomarcação das células cultivadas com marcadores específicos de células, quer para a microglia (IBA1) ou neurónios (MAP2). No presente estudo, foram observados astrócitos do hipocampo que crescem em culturas em monocamada primários ter ~ 6% de contaminantes na microglia DIV 14, tal como sugerido por algumas células que expressavam IBA1 (Figura 3). Pelo contrário, nenhuma das células foram encontrados para expressar MAP2 sugerindoa cultura foi totalmente desprovida de qualquer contaminação neuronal (Figura 3). A contaminação da microglia menores observadas nas nossas culturas está de acordo com outros relatórios, em que os autores relataram uma contaminação da microglia 5% em suas culturas de astrócitos corticais primárias derivadas de 1 - filhotes de rato de 3 dias de idade 25. Astrócitos possuem um citoarquitetura específico que lhes permitem responder às mudanças no seu microambiente incluindo hipóxia. A fim de determinar qualquer resposta astrocitária específica sexo para vitro in-isquemia, que sujeita os astrócitos do hipocampo sexado para OGD / Reox. Indução bem sucedida de POG / Reox foi determinada pela expressão nuclear aumento de hipoxia fator induzível 1 alfa (HIF1α observada em astrócitos GFAP + submetidas a 2 horas OGD seguido por 5 h Reox, em comparação com as expressões HIF1α em células sob condições de normóxia (Figura 4 ).

(Figura 5). GFAP e S100B foram colocalized nos corpos citoplasma e células de astrócitos, caracterizando um estágio de desenvolvimento astrocitário amadureceu, onde estas células tendem a perder seu células estaminais neuronais (NSC) potencial 26. A morfologia ea densidade de GFAP ou imunoreatividades S100B foram semelhantes em ambas as culturas de astrócitos masculinos e femininos como observado em seus respectivos grupos de tratamento OGD / Reox normóxica e. Em condições de normóxia, astrócitos do hipocampo apresentou uma poligonal para fusiforme e morfologia plana [Figura 5A, B (normoxia 60X; seta)], tal como avaliadas através de microscopia confocal. Estas células foram capazes de se dividir até à confluência durante aproximadamente 2 semanas antes da indução de POG / Reox. Após 2 h de OGD e 5 h Reox, astrócitos exibiu Reacti clássicosve morfologia dos astrócitos exibindo processos primários retraídos, hipertrofia da soma e processos e aumento da expressão de GFAP ou S100B [Figura 5A, B (OGD / Reox, 60X; seta)]. Seguindo o POG / Reox, a coloração GFAP / S100B também exibiu uma extensa rede trabecular que se prolonga através do citoplasma em ambos os sexos masculino e feminino astrócitos do hipocampo. A falta de coloração GFAP observada nos astrócitos do hipocampo em cultura a partir de ratinhos nulos para GFAP serviu como um controlo negativo (Figura 5B, inserção). Os resultados acima proporcionam evidência directa de que a morfologia de astrócitos GFAP / S100B-imunorreactivas sofre alterações significativas quando submetido a OGD-Reox.

figura 1
Figura 1. Ilustrações de a técnica de remoção do hipocampo de ratos P1. 1. Decapitar cachorro para remover a cabeça.2, 3. Utilizando uma tesoura fina, fazer uma incisão na linha média da pele, posterior para anterior, e descascar a pele com a ajuda de uma pinça de ponta plana. 4, 5, 6. Fazer uma pequena incisão na base do crânio. Cortar o crânio ao longo da linha média e descascar duas metades para expor o cérebro. 7, 8. Remover cerebelo com a ajuda de uma pinça curvos. 9. Retire cuidadosamente o cérebro do crânio e colocar em uma placa de Petri estéril. 10, 11. Virar o cérebro de modo que a superfície ventral do cérebro está virada para cima usando um fórceps curvos, em seguida, separar os dois hemisférios com uma lâmina cirúrgica estéril afiada. 12, 13, 14. Remover o tecido do mesencéfalo e tálamo abaulamento deixando intacta subjacente o hemisfério e revelando o hipocampo. 15, 16. Remover o hipocampo (pequena estrutura em forma de C). 17, 18. imediatamente coloque os lóbulos do hipocampo obtidos a partir tanto do hemisférios numa placa de Petri separado contendo estéril HBSS. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2
Figura 2. Determinação do Sexo de Ratinhos Neonatais. Uma. Rato de sexo foi geneticamente determinada por PCR com primers específicos para o Myog (cromossoma X) e os genes Sry (cromossoma Y) utilizando ADN extraído a partir do dedo ou do dedo do pé recortes (F 1; H 1). As bandas de PCR foram visualizados num gel de agarose a 2% com brometo de etídio sob iluminação UV. F 2 e M 2 serviram como controlos positivos para o sexo feminino e masculino, respectivamente. B. determinação visual do macho da fêmea foi estabelecida através da identificação de um local escurecido entre as aberturas anogenitais (seta).urce.jove.com/files/ftp_upload/53695/53695fig2large.jpg "target =" _ blank "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3
Figura 3. A pureza do rato Primária do hipocampo Astrocyte Cultura. Imunocoloração da cultura de astrócitos com MAP2 neuronal marcador (vermelho) e IBA1 microglia marcador (verde). Os núcleos são corados com 4 ', 6'-diamidino-2-phenylindole (DAPI) (azul). A seta indica a contaminação microglia. Barra de escala:. 50 mm Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4
Figura 4. HIF1α Expressão era Emvincadas no hipocampo Cultivadas astrócitos Expostos a OGD / Reox. imagens de imunofluorescência representativas que mostram GFAP (vermelho) e HIF1α (verde) rotulagem em astrócitos sujeitos a (A) normoxia ou (B) OGD (2 h) / Reox (5 h). Os núcleos são corados com 4 ', 6'-diamidino-2-phenylindole (DAPI) (azul). Seta, baixa expressão HIF1α; seta, elevada expressão nuclear HIF1α. Barra de escala:. 25 um favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5
Figura 5. Up-regulação da S100B ou expressão GFAP em Culturas Sexed hipocampo Astrocyte seguinte OGD-Reox. Astrócitos do hipocampo em cultura Sexado foram coradas para S110b ou expressão GFAP em condições de normóxia ou após 2h OGD seguido por 5 h de Reox (OGD / Reox). Detalhe: imagem 60X de astrócitos do hipocampo em cultura de ratinhos nulos GFAP. Barra de escala: 30 ^ m.

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Discussion

Para estudar as diferenças entre os sexos nas propriedades e função de astrócitos em condições fisiológicas e patológicas, preparação de astrócitos primários sexado em cultura celular é uma ferramenta importante para utilizar. No presente estudo relatamos um altamente eficiente e um método reprodutível à cultura uma população homogénea altamente enriquecido de astrócitos do hipocampo sexado de recém-nascidos (P0-P2) C57BL / 6 (tipo selvagem) ou K19F (GFAP null) filhotes de rato in vitro. Estabelecer esta metodologia ajuda os pesquisadores a entender as funções fisiológicas e patológicas de astrócitos do hipocampo sexado após isquemia in-vitro.

Existem dois passos críticos para estabelecer esta metodologia, incluindo a manutenção de esterilidade e uma digestão adequada de lóbulos do hipocampo durante tripsinização seguido por trituração do tecido digerido, a fim de atingir a suspensão de célula única. Prevenção de astrócitos primários a partir deficando contaminada é um dos maiores desafios ao longo do processo de cultura. Bacteriana e / ou fúngica dois modos comuns de contaminação que pode tornar as células de cultura inútil se os cuidados adequados não é adotada durante a realização da técnica. Assim, a fim de garantir o sucesso experimental, é imperativo para realizar o processo sob um ambiente de trabalho estéril que inclui, desinfecção do local de trabalho, antes da utilização, utilizando um equipamento cirúrgico estéril e materiais, evitar o contacto dos materiais estéreis com superfícies não esterilizadas, utilizando um capela de fluxo laminar e evitar tomar frascos de cultura não niveladas para fora da capa laminar. Além disso, durante a dissociação enzimática, mais tempo de incubação de tecido do hipocampo com tripsina seguida por trituração física extensa pode levar à sua sobre-digestão resultante da viabilidade celular pobre e ineficiente ligação de células dissociadas de frascos de cultura.

Pelo contrário, underdigestion do tecido cerebral fornece insuficientedissociação de células da glia, assim, resultando em rendimento pobre e semeadura de células como grandes aglomerações. Por conseguinte, a fim de se obter culturas de astrócitos saudáveis, é necessário optimizar a concentração em tripsina, o tempo de incubação e a trituração para conseguir uma óptima digestão do tecido do hipocampo. Nas nossas mãos, a incubação de lóbulos de hipocampo com a concentração de trabalho de 0,25% de tripsina por 20 min à temperatura ambiente, seguido por trituração suave durante 20 - 30 vezes produziu aderente forte, saudável e culturas de astrócitos altamente reprodutíveis. Além disso, repetiu congelamento e descongelamento de reagentes antes de usar cada vez que pode reduzir a sua eficácia. Portanto, é muito importante para os reagentes da alíquota em pequenas quantidades desejáveis ​​e congelar. Por exemplo, armazenar tripsina, penicilina / estreptomicina como alíquotas de 5 ml e soro fetal de bovino como alíquotas de 50 mL em numerosos tubos cónicos estéreis a -20 ° C até à sua utilização. Aconselhamos a não usar antibióticos para além da data de validade.

GFAP é awmarcador de astrócitos fibrosos reativas ell caracterizado. Seguindo POG / Reox, supra-regulação da expressão de GFAP em resposta a astrogliose reactiva foi avaliado 20. Embora, tem sido proposto que a sobre-expressão de GFAP poderia ser utilizado como alvo específico para as estratégias de reparação neuronal 27 o seu papel no dano do hipocampo depois de HI em recém-nascidos ainda é incerto. a coloração imuno-histoquímica de astrócitos GFAP com permite identificar e caracterizar estas células sob condições fisiológicas e patológicas. coloração GFAP como qualquer outro marcador tem algumas limitações que precisam ser reconhecidos. Uma das limitações da coloração GFAP dos astrócitos é que nem todos os astrócitos expressam GFAP sob condições fisiológicas. Especialmente a taxa de expressão astrócitos imaturos de GFAP não exceda 40% sob condições fisiológicas 28. Dependendo da idade e uso de tipo específico dos astrócitos, outros marcadores de escolha pode ser considerado como GLAST, ALDH1L1, BLBP, Aquaporin-4 e S100B 29.

Além disso, a presença de NSCs disfarçado como astrócitos nas culturas primárias não pode ser descartada. Estes NSC foram mostrados para apresentar características fenotípicas e ultra-estruturais semelhantes a amadurecer astrócitos, incluindo a expressão de GFAP. Portanto, a identificação de marcadores moleculares que são específicos para os astrócitos totalmente diferenciados e maturados é uma obrigação. Astrócitos foram relatados para S100B expressa em seus estágios de desenvolvimento mais tarde totalmente diferenciadas. Recentemente, foi relatado que neonatal cortical GFAP + astrócitos perdem o seu potencial de células-tronco progenitoras com o início da expressão de S100B que acontecer em torno DIV 15 26. Da mesma forma, nas nossas condições de cultura com uma DIV 14, 91% de células que expressam GFAP foram encontrados para co-expressar S100B, o que sugere que as culturas consistem em astrócitos do hipocampo amadureceram principalmente terminalmente diferenciadas.

É quase impossível obter puras culturas de astrócitos primários do hipocampo totalmente desprovidas de contaminante células microgliais que residem acima e abaixo da monocamada de astrócitos. Portanto, é importante saber a proporção de contaminante em culturas astrogliais microglia e também para manter esta proporção tão baixa quanto possível. No presente estudo, manchado cultura de astrócitos com microglia IBA1 marcador específico ou MAP2 marcador neuronal, a fim de determinar a presença de quaisquer microglia ou neurônios como potenciais contaminantes. A proporção da microglia em cultura de astrócitos roedor podem variar de 1% a 30% dependendo de vários factores que incluem a idade do animal, espécie, região, meio de cultura, o método de subcultura e agitando 30. Nas nossas culturas observou-se aproximadamente 6% de contaminação da microglia que é comparável com outros relatórios 25. Se o uso pretendido da cultura de astrócitos é estudar o papel de astrócitos do hipocampo na inflamação é imperativopara o tratamento das culturas com LME 5 mM, durante 10 d para eliminar a possibilidade de contaminação da microglia nas culturas de astrócitos a partir de DIV 3. LME é um agente citotóxico da microglia que tem sido amplamente utilizado como um método para remover a proliferar microglia 20,22. Além disso, as culturas tratadas com LME deve ser submetido a um protocolo de agitação (300 rpm durante 1 h).

Um outro desafio técnico na realização de POG / Reox é para determinar se um grau suficiente de hipoxia foi conseguido para induzir astrogliose. Os marcadores para hipoxia em astrócitos incluem a sobre-regulação de GFAP e a indução de HIF-1α. Assim, no presente estudo hipoxia foi confirmada pelo aumento da imuno-reactividade GFAP (dados não apresentados) e a regulação positiva de coloração HIF1-α (Figura 4).

Em resumo, os resultados obtidos a partir de culturas de astrócitos do hipocampo neonatais sexado mostrou fixação celular bem sucedida com saudável astrócitos homogénea di camadasplaying morfologia típica em lamelas e a manifestação do maior reactivo marcadores GFAP astrocíticos e S100B após indução de isquemia in vitro. Acreditamos que o protocolo adoptada aqui tem o potencial para responder a perguntas mecanicistas e traducionais importantes relativos ao papel de astrócitos no desenvolvimento de cérebros masculinos e femininos. O procedimento de cultura inteiro, em oposição à maioria das técnicas existentes gera astrócitos do hipocampo maduros e confluentes sexuado em duas semanas, concedendo um retorno rápido dos experimentos e a simplicidade da técnica irá facilitar a utilização do método de cultura de astrócitos como uma ferramenta para estudar o sexo papel específico das células da glia no desenvolvimento do cérebro, assim, permitindo a sua ampla divulgação na pesquisa do cérebro.

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Disclosures

Nenhum dos autores têm interesses concorrentes ou conflitantes.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Astrocyte culture media
DMEM, high glucose cellgro 10-013-CV
Horse Serum Gibco 26050-070 Final Concentration: 10%
Penicillin-Streptomycin Cellgro  30-002-CI Final Concentration: 1%
L-Leucine methyl ester hydrochloride Aldrich L1002-25G Final Concentration: 5 mM
Solution for brain tissue digestion
HBSS Life Technologies 14170-088
Trypsin cellgro 25-050-CI Final Concentration: 0.25%
Other
70% (vol/vol) ethanol Roth 9065.2
Poly-D-Lysine (PDL) 12 mm round coverslips  Corning 354087
Water Sigma W3500 Cell-culture grade
PBS cellgro 21-040-CV Cell-culture grade
0.05% Trypsin-EDTA  Life Technologies 25300-062
70 μm Sterile cell strainer  Fisher scientific 22363548
3.5 cm Petri dish BD Falcon 353001
15 mL Falcon tube BD Falcon 352096
50 mL Falcon tube BD Falcon 352070
Forceps, fine  Dumont 2-1032; 2-1033 # 3c; # 5
Forceps, flat tip KLS Martin 12-120-11
13 cm surgical scissors Aesculap BC-140-R
Confocal Microscope Nikon A1RSi 
Centrifuge Eppendorf 5805000.017 5804R
Orbital Shaker Thermo Scientific SHKE 4450-1CE MaxQ 4450 
Anti-IBA1 Wako 019-19741 Rabbit monoclonal
Anti-MAP2 Sigma M2320 Mouse monoclonal
Anti-HIF1alpha abcam ab179483 Rabbit monoclonal
Anti-S100B Sigma HPA015768 Rabbit polyclonal
Anti-GFAP (cocktail) Biolegend 837602
VECTASTAIN Elite ABC Kit (Rabbit IgG) Vector Labs PK-6101 Contains 4 Reagents 
Goat Anti Rabbit Alexa-Fluor 488 Invitrogen A11070
Goat Anti Mouse Alexa-Fluor 568 Invitrogen A11004

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Chanana, V., Tumturk, A., Kintner, D., Udho, E., Ferrazzano, P., Cengiz, P. Sex Differences in Mouse Hippocampal Astrocytes after In-Vitro Ischemia. J. Vis. Exp. (116), e53695, doi:10.3791/53695 (2016).

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