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Neuroscience

Différences entre les sexes dans la souris hippocampiques astrocytes après Published: October 25, 2016 doi: 10.3791/53695
Automatic Translation
1, 2, 1, 1, 1,3, 1,3
1Waisman Center, University of Wisconsin, 2Department of Neurological Surgery, University of Wisconsin, 3Department of Pediatrics, University of Wisconsin

Summary

Les astrocytes sont l'un des principaux acteurs les plus importants dans le système nerveux central (SNC). Ici, nous rapportons une méthode pratique de sexué hippocampique protocole de culture d'astrocytes afin d'étudier les mécanismes sous - jacents de la fonction des astrocytes dans les chiots mâles et femelles néonataux après une ischémie in vitro.

Abstract

Astrogliosis suivante hypoxie / ischémie (HI) lésion cérébrale la PI joue un rôle dans l'augmentation de la morbidité et de mortalité chez les nouveau-nés. Des études cliniques récentes indiquent que la gravité des blessures du cerveau semblent être le sexe à charge, et que les nouveau - nés de sexe masculin sont plus sensibles aux effets de la lésion cérébrale HI liée, ce qui entraîne des résultats neurologiques plus graves que chez les femmes ayant des lésions cérébrales comparables. Le développement de méthodes fiables pour isoler et maintenir les populations hautement enrichies de astrocytes hippocampique sexué est essentiel de comprendre la base cellulaire des différences entre les sexes dans les conséquences pathologiques de HI néonatale. Dans cette étude, nous décrivons une méthode pour créer des cultures hippocampiques spécifiques du sexe astrocytes qui sont soumises à un modèle d'ischémie in vitro, la privation d'oxygène-glucose, suivie par une réoxygénation. astrogliosis réactif subséquent a été examiné par immunostaining pour la protéine gliale fibrillaire acide (GFAP) et S100B. Cette méthode fournit un outil utile pour étudier le rôle des hommes et des astrocytes hippocampiques femelles après néonatale HI, séparément.

Introduction

Les astrocytes sont l'un des principaux acteurs les plus importants dans le système nerveux central (SNC). nombre croissant de preuves indique que les rôles des astrocytes sont plus de fournir un soutien neuronal. En fait, le rôle des astrocytes dans des conditions physiologiques peuvent être très complexes, telles que le guidage de la migration des axones en développement 1, la régulation du système nerveux central flux sanguin 2, le maintien de l'homéostasie du pH du liquide interstitiel synaptique 3, et en participant à la barrière hémato - encéphalique 4 et 5 la transmission synaptique. Dans des conditions pathologiques, les astrocytes réagissent à des blessures avec un processus appelé astrogliosis réactif dans lequel la morphologie, le nombre, l' emplacement, la topographie (par rapport à la distance de l' insulte) et la fonction des astrocytes peuvent changer d'une manière hétérogène 6,7. Astrogliosis observée après néonatale encéphalopathie hypoxique ischémique peut-être contribuer à la morbidité et la mortalité des nouveau-nés

Des études cliniques et expérimentales récentes montrent que la sévérité des lésions cérébrales semble être dépendant du sexe et que les nouveau-nés mâles sont plus sensibles aux effets de l'hypoxie / ischémie (HI), les lésions cérébrales concernant la PI, ce qui entraîne des résultats neurologiques les plus graves par rapport à les femmes ayant des lésions cérébrales comparables 9-11. Bien que la localisation de la blessure dépend de l'âge gestationnel et la durée et la gravité de l'insulte, l'hippocampe est l'une des régions les plus couramment effectuées dans le SNC après terme néonatale HI, et augmenté astrogliosis hippocampique a été confirmée par la régulation des la protéine fibrillaire gliale acide (GFAP) 3 jours après l'HI néonatale 7,10,12,13. Les différences de sexe en fonction des astrocytes ont été présentés dans les deux nouveau - nés et les rongeurs adultes après une ischémie cérébrale 14,15. En outre, la sensibilité astrocytaire mâle à une ischémie in vitro a été démontré par une augmentation de cell la mort par rapport à astrocytes corticales femmes dans la culture 16.

Les différences sexuelles commencent in utero et se poursuivent jusqu'à la mort 17. Au cours de la dernière décennie, l'importance d'inclure les sexes dans des conditions expérimentales en culture cellulaire et in vivo des études ont été l'accent de l'Institut de médecine et de NIH à rechercher des connaissances fondamentales dans les différences entre les sexes observées dans des conditions physiologiques et pathologiques 17,18 . Développement de méthodes fiables pour isoler et maintenir les populations de astrocytes hippocampique sexué est essentiel de comprendre la base cellulaire des différences entre les sexes dans les conséquences pathologiques de HI néonatale. La présente étude a été conçue pour fournir les techniques pour préparer enrichies cultures de souris nouveau-nés astrocytes hippocampique par sexe afin d'évaluer le rôle des astrocytes GFAP-immunoréactives suivants Oxygen / Glucose Privation (OGD) et réoxygénation (REOX), induisantHI dans le milieu de culture cellulaire. Cette technique peut être utilisée pour tester toute hypothèse concernant les astrocytes hippocampiques chez les mâles et les femelles néonataux dans des conditions normoxiques et ischémiques.

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Protocol

NOTE: Cette étude a été réalisée conformément à la recommandation du Guide pour le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire de l'Institut national de la santé. Le protocole de l'animal a été approuvé par l'Université du Wisconsin-Madison, Institutional Animal Care et utilisation Comité. Astrocyte primaire protocole de culture qui est présenté ici est adopté des protocoles présentés par Zhang Y 19 et al. Et Cengiz P 20 et al. , Avec quelques modifications.

1. hippocampique Dissection et Astrocyte Culture

  1. Préparer tous les réactifs et matériaux nécessaires, y compris des ciseaux chirurgicaux, pinces fines lisses, une pince à bout plat, serviettes en papier, sac de déchets, 70% d'éthanol et 2 plats de dissection (3,5 cm de diamètre) sur la glace rempli de 2 solution saline équilibrée de Hank mL (HBSS) chaque . Assurez-vous de l'équipement chirurgical sont stériles (autoclave) avant la procédure et utiliser tous les autres matériaux (Astrocyte placage moyen: sérum DMEM + 5% de cheval +1% de pénicilline-streptomycine, du sérum de cheval, HBSS, 0,25% de trypsine, des lamelles de verre, des boîtes de Pétri, tubes 15/50 ml, flacons T25, etc.) comme pré-stérile.
  2. Tenir délicatement et pulvériser la tête et du cou du chiot de souris avec 70% d' éthanol et décapitent en utilisant des ciseaux tranchants stériles [Figure 1 (1)].
  3. Effectuer une incision médiane d'arrière en avant le crâne avec de petits ciseaux le long du cuir chevelu pour exposer le cerveau [Figure 1 (2-3)].
  4. Couper le crâne soigneusement à partir du cou au nez avec de petits ciseaux. Ensuite, couper le crâne antérieur aux bulbes olfactifs et inférieur au cervelet pour déconnecter le crâne de la base du crâne.
  5. Faire une petite incision à la base du crâne et couper le long de la ligne médiane. Utilisez des pinces stériles à pointe plate pour décoller le crâne. Retirer le tronc cérébral à l'aide d'une pince courbe. Retirer le cerveau du crâne et la placer dans le premier plat de dissection [Figure 1 (4-9)] 21.
  6. En utilisant une pince courbe, retournez le cerveau de telle sorte que la surface ventrale du cerveau est orientée vers le haut, puis séparer les deux hémisphères avec une lame chirurgicale stérile forte [Figure 1 (10,11)]
  7. Peler les hémisphères cérébraux et retirez soigneusement le tissu mésencéphale et thalamique renflement avec stériles forceps courbes plates pour révéler l'hippocampe, une petite structure en forme d' hippocampe dans le lobe temporal médian [Figure 1 (12-14)].
  8. Retirer les deux lobes hippocampiques [Figure 1 (15,16)] et de disséquer soigneusement les méninges des lobes en tirant avec les pince fine. Cette étape évite la contamination de la culture d'astrocytes finale par les cellules et les fibroblastes méningées.
  9. Transférer les lobes hippocampiques préparés dans le deuxième plat rempli de HBSS et le retourner sur de la glace [Figure 1 (17,18)]. Piscine à la fois hippocampiques lobes d'une seule souris (P0 - P2) pour la préparation des hippopotamescultures campal astrocytes. Cela donne à l'astrocyte bonne densité. Émincer lobes hippocampiques en utilisant une lame chirurgicale stérile forte (environ 4 fois).
  10. Aspirer HBSS de plat en utilisant une pointe stérile attachée à une pipette mL 1 et ajouter 3 ml de trypsine à 0,25%, mélanger, transférer dans un tube conique stérile de 15 ml et incuber le tissu à 37 ° C pendant 20 min en agitant doucement.
  11. Tube à centrifuger à 300 g pendant 5 min. Aspirer le surnageant soigneusement à l'aide d'une pipette en verre stérile fixée à une ligne de vide. Ajouter 10 ml astrocyte placage moyen et trituré (20 - 30 fois) à l'aide d'un feu poli pipette en verre jusqu'à ce que les morceaux de tissu homogénéisent.
  12. Tube à centrifuger à 300 g pendant 5 min. Aspirer le surnageant et ajouter 2 mL de milieu frais astrocyte de placage préchauffée. Passer les cellules à travers un filtre à mailles de 70 pm (tamis cellulaire) dans un nouveau tube de 50 ml conique.
  13. toute la plaque de suspension cellulaire dans un flacon de culture T25 stérile revêtue de poly-D-lysine / laminine contenant 3 ml d'médias astrocytes placage, puis incuber le ballon à 37 ° C dans un incubateur à CO 2 de 5%.
  14. Ensemble Aspirer médias à jour- i n-vitro (DIV) 1, DIV 3 et DIV 7, et le remplacer par 2 ml de milieu d'astrocytes placage frais. Observer la progression et la confluence astrocytaire au microscope optique à chaque fois, tout en remplaçant les médias astrocyte de placage.
    NOTE: A DIV 1, tous les astrocytes viables sont fixés à la surface du flacon de culture et les cellules mortes ou mourantes qui incluent les neurones flottent dans le surnageant. A DIV 3, les cellules attachées commencent à se diviser pour former la couche de cellules astrocytes. En l'absence des conditions favorables, la culture est presque dépourvue de toute croissance neuronale. À DIV 7, la couche d'astrocytes est d'environ 80 - 90% de confluence et quelques microglie ainsi que des cellules précurseurs d'oligodendrocytes sont présents au-dessus de la couche astrocytaire.
  15. Aspirer le milieu de placage du flacon, ajouter 2 mL de milieu de astrocyte placage préchauffée frais, rincer unend retirer de nouveau à DIV 11, lorsque les astrocytes sont confluentes et prêt pour les sous-culture.
  16. Ajouter 2 ml de trypsine à 0,25%, tourner doucement le flacon à quelques reprises et aspirez trypsine en utilisant une pipette en verre stérile.
  17. Ajouter 2 mL de 0,25% de trypsine et de laisser le flacon reposer dans le tissu culture capot pendant 4 - 5 min à température ambiante.
  18. Retirer la trypsine et de maintenir le ballon à 37 ° C dans un incubateur à CO2 à 5% pendant 10 min. Ajouter 5 ml préchauffée astrocyte placage moyen et détacher la couche astrocytaire en tapant le ballon contre la paume de votre main (3 - 4 fois) suivie d'une trituration douce pour atteindre le détachement complet et de recueillir les astrocytes dans un tube de 15 ml conique.
  19. Tube à centrifuger à 300 xg pendant 5 min, aspirer le surnageant et ajouter 1 ml de milieu astrocyte de placage frais.
  20. Ajouter 10 ul de la suspension cellulaire à un hémocytomètre et compter les cellules dans la grande surface quadrillée centrale (1 mm 2) à l' aide d' un microscope à contraste de phase inversé (objectif 10X). Multiply de 10 4 pour estimer le nombre de cellules par ml. Un flacon T25 donnera ~ 1 x 10 6 cellules totales dissociées. Semences ~ 1 x 10 5 cellules dans 2 ml de milieu astrocytes placage sur un diamètre de 12 mm Poly-D-Lysine lamelle de verre pré - enduit dans le puits d'une boîte de culture de 24 puits.
  21. Incuber à 37 ° C dans un incubateur à CO2 à 5%. Effectuer OGD / REOX à DIV 12-14 (section 2).
  22. Traiter les cultures d'astrocytes au DIV 3 avec 5 mM de L-leucine Ester méthylique (LME) chlorhydrate jusqu'à DIV 11 si les cultures hippocampiques dépourvues de microglies sont souhaitées. Après LME incubation, les cultures soumises à agitation (300 rpm pendant 1 h) pour éliminer la contamination microglie.
    REMARQUE: la LME est un agent cytotoxique microglie qui a été largement utilisé comme procédé pour éliminer la prolifération des 22 cellules microgliales.

2. OGD / Traitement REOX

  1. Aspirer le milieu de culture contenant de la lamelle astrocyte adhérente (DIV 12-14) et rincer 3 foisen faisant tourner doucement la boîte de culture 24 puits tenant la lamelle une ou deux fois avec 1 ml de solution isotonique OGD (pH 7,4) contenant (en mM): 0 glucose, 21 NaHCO 3, 120 NaCl, 5,36 KCl, 0,33 Na 2 HPO 4, 0,44 KH 2 PO 4, 1,27 CaCl 2, et 0,81 MgSO 4.
  2. Ajouter 0,2 mL solution OGD bien pour couvrir la lamelle et incuber pendant 2 h dans un incubateur hypoxique contenant 94% de N 2, 1% O 2, et 5% de CO 2. Mélanger délicatement avec un agitateur orbital (50 rpm) pendant les 30 premières minutes de l'hypoxie pour faciliter l'échange de gaz.
  3. Incuber les cellules de contrôle normoxiques pendant 2 h à 5% de CO 2 et de l' air atmosphérique dans un tampon identique à la solution OGD sauf pour l'ajout de 5,5 mM de glucose.
  4. Pour REOX, solution OGD Aspirer et ajouter 2 ml de astrocyte placage moyen. Incuber à 5% de CO 2 et de l' air atmosphérique à 37 ° C pendant 5 h.

3. immunocytochimique Coloration </ P>

  1. Aspirer le milieu de culture à l'aide d'une pipette en verre stérile attachée à une ligne de vide et rincer rapidement lamelle une fois en ajoutant 1 ml de 0,1 M Tris Buffered Saline (TBS) (NaCl 154, 16 mM Trizma Base, 84 mM Tris-HCl, pH 7,4) au puits. Aspirer et ajouter 2 mL de paraformaldéhyde 4% (PFA) dans 1x tampon phosphate salin (PBS). Incuber pendant 15 min à température ambiante.
  2. Aspirer et ajouter 1 mL de 0,1 M TBS, puis placer ensuite sur un agitateur oscillant pendant 2 min. Répétez 3 fois. Ajouter 1 ml de solution de blocage (sérum de chèvre à 10%, 10 mg / ml de SAB, 0,025% de Triton X-100 à 0,1 M TBS) et on incube pendant 30 min à 37 ° C sur un agitateur basculant.
  3. Aspirer la solution de blocage et ajouter monoclonal de souris primaire anticorps GFAP anti- (0,2 ml d'une dilution 1: 500 dans une solution de blocage) et polyclonal de lapin anti-S100B (1: 500) ou de lapin polyclonal anti-HIF1α (1: 200) pendant 60 min à 37 ° C sur un agitateur basculant.
  4. Alternativement, certains astrocytes sont incubés avec le lapin polyclonaux anti-IBA1 (1: 200) et mon sourisanti-MAP2 oclonal pour accéder à la pureté de la culture.
  5. anticorps primaire Aspirer et rincer la lamelle en ajoutant 1 mL de 0,1 M TBS et placement sur un agitateur oscillant pendant 2 min puis aspirée. Répéter deux fois.
  6. Ajouter 0,2 ml d'une dilution 1: 200 de l'anti-anticorps de lapin conjugués à 568 488 conjuguées et anti-souris de chèvre secondaire dans la solution de blocage pendant 60 min à 37 ° C sur un agitateur basculant.
  7. Aspirer anticorps secondaire et rincer la lamelle en ajoutant 1 mL de 0,1 M TBS et placer sur un agitateur oscillant pendant 2 min puis aspirée. Répéter deux fois.
  8. Retirer la lamelle du puits sec et en plaçant sur une lame placée sur une lame-cheveux. Mont lamelle sur une nouvelle diapositive en inversant sur une seule goutte de Vectashield hardset milieu de montage avec DAPI (1,5 ng / ul).
  9. lamelles d'image sur un microscope confocal en utilisant soit 20X objectif d'huile sèche ou 60X. Acquérir les images (512 x 512) pour DAPI (405 nm ex / em 450 nm) et fluorochrome 488 tagged anticorps GFAP (488 nm ex / 515 nmem). Gardez les paramètres d'acquisition constants au sein du 20X et 60X groupes.

4. Sex Détermination Utilisation PCR

  1. Chiot chaleur orteil ou de doigt rognures à 95 ° C pendant 45 minutes dans du NaOH 50 mM et neutralisent avec un volume égal de 1 M de Tris, pH 6,8.
  2. Ajouter 1 pi de la solution d'ADN extrait de 19 ul du mélange suivant: 5 pmoles d'amorces pour les gènes et Myog Sry, un tampon de réaction 1 x, 0,2 mM de chaque désoxynucléotide et 8 U de Taq polymérase.
  3. Utiliser des amorces de séquences; Sry 5'TCATGAGACTGCCAACCACAG3 ', 5'CATGACCACCACCACCACCAA3' et Myog 5'TTACGTCCATCGTGGACAGC3 '5'TGGGCTGGGTGTTAGTCTTA3' 23.
  4. Exécuter le protocole PCR suivant: 95 ° C pendant 3 min, puis 30 cycles de dénaturation à 95 ° C pendant 15 s, annelage à 58 ° C pendant 15 s et allongement à 72 ° C pendant 1 min. À la suite de ces 30 cycles, la réaction se termine par une finale d'allongement à 72 ° C pendant 1 min.
  5. PC séparéR produits par électrophorèse sur un gel contenant du bromure d'éthidium agarose à 2% et visualisent sous illumination UV. (Figure 2A). ATTENTION! Le bromure d' éthidium est un cancérigène potentiel et doit être manipulé avec soin et éliminés de façon appropriée selon les règlements de l' institution.

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Representative Results

Comprendre les rôles des fonctions d'astrocytes sexués dans des conditions physiologiques ou physiopathologiques ont été immensément élucidé par la culture de ces cellules dans des conditions in vitro. L'aspect important de réaliser la culture sexué est de déterminer le sexe du chiot de la souris avant son utilisation. On a déterminé le sexe de la souris génétiquement par PCR et par une évaluation visuelle (figure 2) 16. La méthodologie de détermination du sexe par PCR a été adopté avec des modifications de McClive et Sinclair, est rapide, simple et hautement reproductible méthode 23. La figure 2A montre les résultats représentatifs de la détermination du sexe par PCR. Les produits de PCR ont été générés avec l'ADN extrait à partir de deux P1 mâle et femelle queue snips représentatifs. La réaction comprend des paires d'amorces multiplexées pour les gènes Sry et Myog qui génèrent des bandes spécifiques mâles de 441 pb et spécif femellebandes IC 245 pb, respectivement. Détermination visuelle du nouveau - né (P 1-3) le sexe de la souris à l' oeil nu a été créé par la recherche de la présence de la petite tache assombrie entre les ouvertures anogénitales que chez les mâles (Figure 2B) 16,24.

Bien que, la culture des astrocytes est pratique et relativement facile à mettre en place des conditions de laboratoire mis en place, cet avantage peut être entravée par sa contamination principalement avec la microglie ou les neurones dans une moindre mesure. La contamination des astrocytes peut être facilement déterminée par immunomarquage des cellules cultivées avec des marqueurs spécifiques des cellules, soit pour la microglie (IBA1) ou des neurones (MAP2). Dans la présente étude, les astrocytes hippocampiques plus en plus dans des cultures monocouches primaires ont été observé que ~ 6% de la microglie contaminantes à DIV 14, comme suggéré par quelques cellules qui exprimaient IBA1 (Figure 3). Au contraire, aucune des cellules se sont révélées exprimer MAP2 suggérantla culture était totalement dépourvue de toute contamination par des neurones (figure 3). La contamination de la microglie mineure observée dans nos cultures est en accord avec d' autres rapports, dans lequel les auteurs ont signalé une contamination microglial 5% de leurs cultures d'astrocytes corticaux primaires dérivées de 1 - souriceaux 3 jours d'âge 25. Les astrocytes possèdent une cytoarchitecture spécifique qui leur permettent de réagir aux changements dans leur microenvironnement y compris l'hypoxie. Afin de déterminer quelle réponse astrocytaire spécifique du sexe à l' ischémie in vitro, nous avons soumis astrocytes hippocampiques sexués à OGD / REOX. L' induction réussie de l' OGD / REOX a été déterminée par l'expression nucléaire accrue du facteur induit par l'hypoxie 1 alpha (HIF1α observée dans GFAP + astrocytes soumis à 2 h OGD suivie de 5 h REOX par rapport aux expressions HIF1α dans des cellules dans des conditions normoxiques (figure 4 ).

(Figure 5). GFAP et S100B ont été colocalisés dans les corps de cytoplasme et de cellules astrocytes, caractérisant un stade de développement astrocytaire mûri où ces cellules ont tendance à perdre leur cellules souches neurales (NSC) Potentiel 26. La morphologie et la densité des GFAP ou immunoréactivités S100B étaient similaires dans les deux cultures mâles et femelles astrocytes comme observé dans leur normoxique et les groupes de traitement OGD / REOX respective. Dans des conditions normoxiques, astrocytes hippocampiques présenté un polygonale à fusiforme et la morphologie plate [figure 5A, B (normoxie 60X; flèche)], évaluée en utilisant la microscopie confocale. Ces cellules ont été capables de se diviser jusqu'à la confluence pendant environ 2 semaines avant l'induction de l'OGD / REOX. Après 2 h OGD et 5 h REOX, astrocytes exposées reacti classiquesve astrocyte morphologie afficher les processus primaires rétractées, une hypertrophie du soma et des processus, et l' augmentation de l' expression de la GFAP ou S100B [Figure 5A, B (OGD / REOX, 60X; arrowhead)]. Suite à l'OGD / REOX, la coloration GFAP / S100B présentait également un vaste maillage étendant à travers le cytoplasme à la fois mâle et femelle astrocytes hippocampiques. Absence de coloration GFAP observée dans les astrocytes d' hippocampe en culture provenant de souris nulles GFAP a servi de témoin négatif (figure 5B, encart). Les résultats ci-dessus fournissent des preuves directes que la morphologie des astrocytes GFAP / S100B-immunoréactives subit des changements significatifs lorsqu'ils sont soumis à OGD-REOX.

Figure 1
Figure 1. Illustrations de la Technique de retrait hippocampique de P1 souris. 1. Décapitez chiot pour enlever la tête.2, 3. A l' aide de ciseaux fins, faire une incision médiane de la peau, postérieure à antérieure, et peler la peau à l'aide d'un à pointe plate forceps. 4, 5, 6. Faire une petite incision à la base de la crâne. Couper le crâne le long de la ligne médiane et décoller deux moitiés pour exposer le cerveau. 7, 8. Retirer cervelet avec l'aide d'une pince incurvées. 9. Retirez délicatement le cerveau du crâne et la place dans une boîte de Pétri stérile. 10, 11. Retournez le cerveau de telle sorte que la surface ventrale du cerveau est orientée vers le haut à l' aide d' une pince courbe, puis séparer les deux hémisphères avec une lame chirurgicale stérile pointu. 12, 13, 14. Retirez le tissu mésencéphale et thalamique renflement laissant intacte sous - jacente hémisphère et révélant l'hippocampe. 15, 16. Retirer l'hippocampe (petite structure en forme de C). 17, 18. placer immédiatement les lobes hippocampiques obtenus à la fois du hémisphères dans un boîte de Petri séparée contenant HBSS stérile. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2
Figure 2. Détermination du sexe des souris néonatales. A. Le sexe de la souris a été déterminée génétiquement par PCR avec des amorces spécifiques à l'Myog (chromosome X) et Sry (chromosome Y) des gènes à l' aide de l' ADN extrait des doigts ou des orteils coupures (F 1; M 1). Les bandes de PCR ont été visualisés sur un gel d'agarose à 2% avec le bromure d'éthidium sous une lumière UV. F 2 et M 2 ont servi de témoins positifs pour les femmes et des hommes, respectivement. B. Détermination visuelle des hommes des femmes a été créé par l'identification d'une tache sombre entre les ouvertures anogénitales (flèche).urce.jove.com/files/ftp_upload/53695/53695fig2large.jpg "target =" _ blank "> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3
Figure 3. Pureté de la souris primaire hippocampique Astrocyte Culture. Immunocoloration de la culture des astrocytes avec MAP2 neuronal marqueur (rouge) et le marqueur de la microglie IBA1 (vert). Les noyaux sont colorés avec 4 ', 6'-diamidino-2-phénylindole (DAPI) (bleu). La flèche indique la contamination de la microglie. Barre d' échelle:. 50 pm S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 4
Figure 4 HIF1α Expression était enfroissés dans Cultured hippocampique astrocytes Exposés à OGD / REOX. images d'immunofluorescence représentatifs montrant GFAP (rouge) et HIF1α (vert) l' étiquetage dans les astrocytes soumis à (A) normoxie ou (B) OGD (2 h) / REOX (5 h). Les noyaux sont colorés avec 4 ', 6'-diamidino-2-phénylindole (DAPI) (bleu). Flèche, faible expression de HIF1α; Arrowhead, élevé HIF1α expression nucléaire. Barre d' échelle:. 25 pm S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 5
Figure 5. Up-régulation de S100B ou GFAP Expression dans les cultures Sexed hippocampique astrocyte suivant OGD-REOX. Astrocytes hippocampiques cultivés sexée ont été colorées pour S110b ou l' expression de la GFAP dans des conditions normoxiques ou après 2h OGD suivie par 5 h de REOX (OGD / REOX). Encart: l'image 60X de astrocytes hippocampiques en culture de souris nulles de GFAP. Barre d'échelle: 30 um.

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Discussion

Afin d'étudier les différences entre les sexes dans les propriétés et la fonction des astrocytes dans des conditions physiologiques et pathologiques, la préparation des astrocytes primaires sexués dans la culture cellulaire est un outil important à utiliser. Dans la présente étude , nous rapportons une population homogène hautement enrichi d'astrocytes hippocampiques sexués de nouveau - né (P0-P2) C57BL / 6 (type sauvage) ou K19F (GFAP de null) souriceaux très efficace et une méthode reproductible à la culture in vitro. L' établissement de cette méthode aide les enquêteurs à comprendre les fonctions physiologiques et pathologiques des astrocytes hippocampiques sexués après une ischémie in vitro.

Il y a deux étapes importantes dans l'établissement de cette méthodologie, y compris le maintien de la stérilité et la digestion adéquate des lobes de l'hippocampe lors trypsinisation suivie d'une trituration du tissu digéré de manière à obtenir la suspension de cellules individuelles. La prévention des astrocytes primaires deobtenir contaminé est l'un des plus grands défis à travers le processus de culture. Bactérienne et / ou fongique sont deux modes communs de contamination qui peuvent rendre les cellules cultivées inutiles si des soins appropriés n'est pas adopté lors de l'exécution de la technique. Par conséquent, afin d'assurer le succès expérimental, il est impératif d'effectuer le processus dans un cadre de travail stérile qui comprend, la désinfection du lieu de travail avant l'utilisation, en utilisant des équipements et des matériaux chirurgicaux stériles, éviter le contact des matériaux stériles avec des surfaces non stériles, en utilisant un une hotte à flux laminaire et éviter de prendre des flacons de culture non coiffés hors de la hotte laminaire. En outre, lors de la dissociation enzymatique, une incubation plus longue du tissu hippocampique avec de la trypsine suivie par une vaste trituration physique peut conduire à sa sur-digestion entraînant une mauvaise viabilité des cellules et de l'attachement inefficace des cellules dissociées à des flacons de culture.

Au contraire, underdigestion du tissu cérébral fournit insuffisantedissociation des cellules gliales entraînant ainsi un faible rendement et l'ensemencement de cellules que de grosses touffes. Par conséquent, afin d'obtenir des cultures d'astrocytes en bonne santé, il est nécessaire d'optimiser la concentration de la trypsine, le temps d'incubation et la trituration pour obtenir une digestion optimale du tissu hippocampique. Dans nos mains, l'incubation des lobes hippocampiques avec la concentration de travail de 0,25% de trypsine pendant 20 min à température ambiante suivie d'une trituration douce pendant 20 - 30 fois abouti à une forte adhérence, en bonne santé et les cultures d'astrocytes hautement reproductibles. En outre, répété congélation et la décongélation de réactifs avant utilisation chaque fois peut réduire leur efficacité. Par conséquent, il est très important de réactifs aliquotes en petites quantités et de gel souhaitables. Par exemple, un magasin trypsine, pénicilline / streptomycine en 5 aliquotes ml et sérum fœtal bovin comme 50 aliquotes ml dans de nombreux tubes coniques stériles à -20 ° C jusqu'à utilisation. Nous conseillons de ne pas utiliser des antibiotiques au-delà de la date d'expiration.

GFAP est awmarqueur des astrocytes fibreux réactifs ell caractérisé. Après OGD / REOX, surexpression d'expression GFAP en réponse à astrogliosis réactive a été rapporté 20. Bien, il a été proposé que GFAP surexpression pourrait être utilisé comme cible spécifique pour les stratégies de réparation neuronale 27 son rôle dans les dommages hippocampique après HI dans neonates est encore incertain. La coloration immunohistochimique des astrocytes avec GFAP nous permet d'identifier et de caractériser ces cellules dans les conditions physiologiques et pathologiques. GFAP coloration comme tout autre marqueur a certaines limites qui doivent être reconnues. Une des limites de la coloration des astrocytes GFAP est que toutes les astrocytes expriment la GFAP dans des conditions physiologiques. En particulier , le taux d'expression des astrocytes immatures de GFAP ne dépasse pas 40% dans des conditions physiologiques 28. Selon l'utilisation par âge et par type d'astrocytes, d'autres marqueurs de choix peuvent être considérés comme les GLAST, ALDH1L1, BLBP, Aquaporin-4 et S100B 29.

En outre, la présence de NNC déguisé en astrocytes dans les cultures primaires ne peuvent pas être exclues. Ces NSCs se sont révélés présenter des caractéristiques phénotypiques et ultrastructurales similaires à mûrir astrocytes, y compris l'expression de la GFAP. Par conséquent, l'identification de marqueurs moléculaires qui sont spécifiques pour les astrocytes complètement différenciées et mûri est un must. Les astrocytes ont été signalés à S100B exprimé à leurs stades de développement plus tard, totalement différenciées. Récemment, il a été rapporté que le nouveau - né cortical GFAP + astrocytes perdent leur progéniteur potentiel des cellules souches avec l'apparition de l' expression S100B qui se produisent autour DIV 15 26. De même, dans nos conditions de culture à une DIV 14, 91% des cellules exprimant GFAP ont été trouvés coexprimer S100B, qui suggèrent que les cultures se composent d'astrocytes hippocampiques échues principalement différenciées.

Il est presque impossible d'obtenir des cultures d'astrocytes hippocampique primaires pures totalement dépourvues de contamination des cellules microgliales qui résident au-dessus et en dessous de la monocouche d'astrocytes. Par conséquent, il est important de connaître la proportion de contamination microglie dans les cultures astrocytes et aussi pour garder cette proportion aussi faible que possible. Dans la présente étude nous avons coloré des cultures d'astrocytes avec microglie IBA1 marqueur spécifique ou marqueur neuronal MAP2 afin de déterminer la présence de la microglie ou les neurones que les contaminants potentiels. La proportion de la microglie dans la culture d'astrocytes de rongeur peut varier de 1% à 30% , en fonction de plusieurs facteurs qui comprennent l' âge des animaux, des espèces, la région, le milieu de culture, procédé repiquant et en agitant 30. Dans nos cultures , nous avons observé environ 6% de la contamination de la microglie qui est comparable à d' autres rapports 25. Si l'utilisation prévue de la culture d'astrocytes est d'étudier le rôle des astrocytes hippocampiques de l'inflammation, il est impératifpour traiter les cultures avec mM LME 5 pour 10 d pour éliminer la contamination possible de la microglie dans les cultures d'astrocytes à partir de DIV 3. LME est un agent cytotoxique microglies qui a été largement utilisé comme méthode pour supprimer la prolifération des microglies 20,22. En outre, les cultures LME-traités devraient être soumis à un protocole agitation (300 rpm pendant 1 h).

Un autre défi technique dans l'exécution OGD / REOX est de déterminer si un degré suffisant d'hypoxie a été réalisé pour induire astrogliosis. Les marqueurs de l'hypoxie en astrocytes comprennent la régulation positive de la GFAP et l'induction de HIF-1α. Ainsi, dans cette étude , l' hypoxie a été confirmée par l'augmentation de l' immunoréactivité GFAP (données non représentées) , et la régulation positive de HIF1-α coloration (figure 4).

En résumé, les résultats obtenus à partir de cultures d'astrocytes néonatales hippocampiques sexués ont montré l'attachement des cellules avec succès saine couche astrocyte homogène diévasement morphologie typique sur des lamelles et l'expression des principaux réactifs astrocytes GFAP marqueurs et S100B lors de l' induction de l' ischémie in vitro. Nous croyons que le protocole adopté ici a le potentiel de répondre à des questions mécanistes et traductionnelles importantes concernant le rôle des astrocytes dans le développement de cerveaux masculins et féminins. La procédure de culture entière, par opposition à la majorité des techniques existantes génère astrocytes hippocampiques matures et confluentes sexué dans deux semaines, l'octroi d'un redressement rapide des expériences et de la simplicité de la technique facilitera l'utilisation de la méthode de culture astrocytaire comme un outil pour étudier le sexe rôle spécifique des cellules gliales dans le développement du cerveau permettant ainsi une large diffusion dans la recherche sur le cerveau.

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Disclosures

Aucun des auteurs ont des intérêts concurrents ou contradictoires.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Astrocyte culture media
DMEM, high glucose cellgro 10-013-CV
Horse Serum Gibco 26050-070 Final Concentration: 10%
Penicillin-Streptomycin Cellgro  30-002-CI Final Concentration: 1%
L-Leucine methyl ester hydrochloride Aldrich L1002-25G Final Concentration: 5 mM
Solution for brain tissue digestion
HBSS Life Technologies 14170-088
Trypsin cellgro 25-050-CI Final Concentration: 0.25%
Other
70% (vol/vol) ethanol Roth 9065.2
Poly-D-Lysine (PDL) 12 mm round coverslips  Corning 354087
Water Sigma W3500 Cell-culture grade
PBS cellgro 21-040-CV Cell-culture grade
0.05% Trypsin-EDTA  Life Technologies 25300-062
70 μm Sterile cell strainer  Fisher scientific 22363548
3.5 cm Petri dish BD Falcon 353001
15 mL Falcon tube BD Falcon 352096
50 mL Falcon tube BD Falcon 352070
Forceps, fine  Dumont 2-1032; 2-1033 # 3c; # 5
Forceps, flat tip KLS Martin 12-120-11
13 cm surgical scissors Aesculap BC-140-R
Confocal Microscope Nikon A1RSi 
Centrifuge Eppendorf 5805000.017 5804R
Orbital Shaker Thermo Scientific SHKE 4450-1CE MaxQ 4450 
Anti-IBA1 Wako 019-19741 Rabbit monoclonal
Anti-MAP2 Sigma M2320 Mouse monoclonal
Anti-HIF1alpha abcam ab179483 Rabbit monoclonal
Anti-S100B Sigma HPA015768 Rabbit polyclonal
Anti-GFAP (cocktail) Biolegend 837602
VECTASTAIN Elite ABC Kit (Rabbit IgG) Vector Labs PK-6101 Contains 4 Reagents 
Goat Anti Rabbit Alexa-Fluor 488 Invitrogen A11070
Goat Anti Mouse Alexa-Fluor 568 Invitrogen A11004

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Chanana, V., Tumturk, A., Kintner, D., Udho, E., Ferrazzano, P., Cengiz, P. Sex Differences in Mouse Hippocampal Astrocytes after In-Vitro Ischemia. J. Vis. Exp. (116), e53695, doi:10.3791/53695 (2016).

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