Visualisering av Twitching rörlighet och karakterisering av roll<em> PilG</em> i<em> Xylella fastidiosa</em
Summary
I denna studie var en nano-mikroflödessystem flödeskammare används för att visualisera och funktionellt karakterisera ryckningar motilitet Xylella fastidiosa, en bakterie som orsakar Pierce sjukdom i vinrankor.
Abstract
Xylella fastidiosa är en Gram-negativ icke-flagellated bakterie som orsakar ett antal ekonomiskt viktiga sjukdomar i växter. Ryckningar motilitet erbjuder X. fastidiosa ett medel för långväga inom växt rörelse och kolonisering, bidrar mot patogenicitet i X. fastidiosa. Den ryckningar motilitet X. fastidiosa drivs av typ IV pili. Typ IV pili av Xylella fastidiosa regleras av pilG, en kemotaxi regulator i Pil-CHP operon som kodar för proteiner som är involverade med signaltransduktionsvägar. Att belysa de roller pilG i ryckningar motilitet X. fastidiosa, en pilG med brist mutant Xf ΔpilG och dess komplementära stammen XfΔpilG- C innehållande nativt pilG utvecklades. En mikroflödeskammare integreras med en time-lapse bildregistreringssystemet användes för att observera ryckningar motilitet i XfΔpILG, XfΔpilG- C och dess vilda stammen. Med hjälp av detta registreringssystem, tillåter det långsiktiga rumsliga och tidsmässiga observationer av aggregering, migration av enskilda celler och populationer av bakterier via ryckningar motilitet. X. fastidiosa vild typ och kompletterande XfΔpilG- C-stammen visade typiska ryckningar motilitet egenskaper direkt observerats i mikroflödessystem flödeskammare, medan mutant XfΔpliG uppvisade ryckningar bristfällig fenotypen. Denna studie visar att pilG bidrar till ryckningar motiliteten hos X. fastidiosa. Den mikroflödessystem flödeskammare används som ett medel för att observera ryckningar motilitet.
Introduction
Xylella fastidiosa är en Gram-negativa icke-flagellated, patogen bakterie som orsakar en rad ekonomiskt viktiga grödor sjukdomar, inklusive Pierce sjukdom i vinranka (Vitis vinifera L.) 1,2, 3. Är begränsad till vattenledande xylem Denna bakterie kärl. Infektion av vinrankor orsakar blockering av xylem fartyg och resulterar i vattenstress och näringsbrist 3. Framgångsrik kolonisering beror på förmågan av bakterien för att flytta från det initiala infektionsstället till resten av anläggningen 3. Ryckningar motilitet är ett sätt att flagellar oberoende bakterie rörelse genom förlängning, kvarstad, och indragning av den polära typ IV pili 4 som har präglats i X. fastidiosa 5,6,7.
Ryckningar motilitet har observerats med laser pincett och atomkraftsmikroskopi (AFM) 8,9,10. Med användning av dessa tekniker, twitching motilities genereras av typ IV pilus av N. gonorrhoeae och P. aeruginosa kännetecknades av fl uorescently märkning pili och fånga deras rörelser mikroskopiskt. Även om båda metoderna har detaljerade vidhäftningskraften av enskilda bakterier, förfarandena är komplicerade och tidskrävande 9,10. Mikro fl uidic kamrar användes för att observera långväga migration av enskilda celler såväl som små aggregat av bakteriella celler 5,6. Dessa kammare var utformade som en mikro-nano-kanalen i en platta integrerad med en time-lapse bildregistreringssystem 11,12,13,14. Micro fl uidic kammar enheter erbjuder flera fördelar för att studera rörelse beteende och cell-cell interaktioner av bakterier (i) det ger en integrerad plattform med flera kanaler funktioner; (Ii) det kan undersöka rörelserna och sammansättningar av enstaka celler i nanoskala funktioner av bakterier; (Iii) den möjliggör direkt microscopic bildinspelning av bakterieceller och tidsförlopp analys, (iv) det ger långsiktiga rumsliga och tidsmässiga observationer av individuella och / eller populationer av bakterier i en mikro-miljö; (V) flödeshastigheten för odlingsmedium i en kanal kan styras exakt och (vi) endast en mycket liten volym (1 ml) av odlingsmedium krävs för varje experiment.
Nyligen har mikro fl uidic fl ödet systemet använts för att undersöka beteenden bakterieceller under olika mikromiljöer 14,15,16. Vidhäftningsförmågan och ytan fastsättning av E. coli 15, X. fastidiosa 16, och Acidovorax citrulli 14 till glasytor bedömdes med hjälp av mikro fl uidic kammare. Aggregering och bio fi lm bildning förmedlas av typ IV pili av Acidovorax citrulli analyserades 14. Vidare rörelsen hos A. citrulli observeras under fl öde cILLKOR visat att typ IV-pili kan spela viktiga roller i kolonisering och spridning av A. citrulli i xylem fartyg enligt SAP fl ow villkor. Ryckningar motilities av Pseudomonas aeruginosa och X. fastidiosa celler framgångsrikt observer mot en vätskeström i en mikroflödeskammare 5,6,17. Typ IV pilus bristfällig pilB och pilQ mutanter av X. fastidiosa befanns grunden ändra hastigheten på ryckningar motilitet under fl öde förhållandena i mikro fl uidic enheter 5,6,18. De studier som utförts på bakteriell vidhäftning och rörlighet i mikro fl uidic enheter visade att mikro fl uidic kammare är särskilt lämpliga för att analysera ryckningar motilitet och migrering av pili-medierad bakterier in vitro. Dessa resultat förklarar ryckningar-medierad migration mekanism som underlättar cell cellvidfästning, aggregering och kolonisering inomvärden, så småningom leda till systemisk infektion.
Pil-CHP operonet av X. fastidiosa innehåller pilG, pili, pilJ, piller, chpB och chpC som kodar signaltransduktionsvägar 20. De trans chemoreceptors binder kemiska stimuli i det periplasmatiska domän och aktivera en signalkaskad i deras cytoplasmiska del att slutligen kontrollera bakteriell ryckningar motilitet. I Pil-CHP operonet X. fastidiosa, är en fosfor-transferprotein PilG en homolog till Chey. I E. coli och P. aeruginosa, är Chey svarsregulator i kemotaxi som samverkar med flagmotorproteiner 19, 21. Även om bidragen från Pil-CHP operonet mot virulens i X. fastidiosa undersöktes nyligen 20, roll pilG i kemotaxi operon som svar på miljösignaler och regleras / motortyp IV pili av X. fastidiosa är unclear. Att belysa insikten av kemotaxi regulator pilG i aktiviteten av ryckningar motilitet X. fastidiosa, är en mikro fl uidic kammaren används för att bedöma ryckningar motilitet av X. fastidiosa. Den pilG X. fastidiosa kännetecknas genom att jämföra fenotyper av en deletionsmutant Xf ΔpliG, kompletterande stam XfΔpliG -C och dess vildtyp in vitro. Resultaten belyser roll pilG i ryckningar motilitet X. fastidiosa.
Protocol
Representative Results
Discussion
I denna studie har vi karaktäriserat rörelsebeteende X. fastidiosa PilG mutant Xf ΔpilG och dess komplementära XfΔpilG- C-stammar i nydesignade flera parallella nano-kanal mikro fl uidic kammare. De nydesignade mikro fl uidic kammare kan ha upp till fyra parallella kammare med 100 um nano-kanalen i bredd jämfört med tidigare konstruktioner med en enda 50 um bred kanal 18. Den förbättrade bredare nano-kanal underlättar införandet av bakterieceller med fl?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denna studie stöddes av United States Department of Agriculture, Agricultural Research Service. firmanamn eller kommersiella produkter i detta dokument är endast nämns för att tillhandahålla specifik information och innebär inte någon rekommendation av Förenta staternas Department of Agriculture. USDA är en lika möjligheter leverantör och arbetsgivare.
Materials
| Biology materials | |||
| X. fastidiosa (Xf) Temecula wild type | Costa, H. S., et al., 2004 22 | ||
| pilG deletion mutant XfΔpliG | Shi, X. Y., et al., 2007 26 | ||
| pilG complementary strain XfΔpliG-C | Davis, M. J., wt al. 1998 23 | ||
| Physical materials and equipment | |||
| Disposable inoculating loops | VWR international, Radnor, PA | #22-363-607 | quantitative procedures such as bacterial collection |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) | Dow Corning Corporation | #0002709226 | Sylgard 184 silicone Elastomeric Kits |
| AmScope MD2000 digital camera | AmScope, Irvine, CA | SE305R-AZ-E | Image, video recording and measurement |
| Tubes line | Edgewood, NY | #T4300 | Connected to the syringe and microfluidic chamber |
| Plastic luer connectors | Edgewood, NY | Connected to the syringe and microfluidic chamber | |
| Syringe pumps | Pico Plus, Harvard Apparatus, MA | #702209 | The flow rate can be adjusted while the pump is running. |
| Syringes | Gastight, Hemilton Company, Reno, NV | #1005 | Provide the flowing broth |
| Inverted Olympus IMT-2 microscope | Olympus | IMT-2 FLuoro PHase | Image observation and recording |
| SPOT-RT digital camera | Diagnostic Instruments, Inc., MI | RT230 | Image, video recording and measurement |
| Microscope Shutter | The UNIBLITZ, US | #LS2T2 | Control camera’s exposure time |
| Microscope Shutter Control system | The UNIBLITZ, US | VCM-D1 | VCM-D1 Single Channel CE/UL/CSA Approved Shutter Driver |
| MetaMorph Image software | Universal Imaging Corp., PA | Real-time super-resolution image processing |
References
- Purcell, A. H., Hopkins, D. L. Fastidious xylem-limited bacterial plant pathogens. Annu. Rev. Phytopathol. 34, 131-151 (1996).
- Purcell, A. H. Xylella fastidiosa, a regional problem or global threat. J. Plant Pathology. 79, 99-105 (1997).
- Hopkins, D. L. Xylella fastidiosa: Xylem-limited bacterial pathogen of plants. Annu. Rev. Phytopathol. 27, 271-290 (1989).
- Mattick, J. S. Type IV pili and twitching motility. Annu. Rev. Microbiol. 56, 289-314 (2002).
- Meng, Y., et al. Upstream migration of Xylella fastidiosa via pilus-driven twitching motility. J. Bacteriol. 187, 5560-5567 (2005).
- Li, Y., et al. Type I and type IV pili of Xylella fastidiosa affect twitching motility, biofilm formation and cell-cell aggregation. Microbiology. 153, 719-726 (2007).
- Simpson, A. J. G., et al. The genome sequence of the plant pathogen Xylella fastidiosa. Nature. 406, 151-157 (2000).
- Maier, B., Potter, L., So, M., Long, C. D., Seifert, H. S., Sheetz, M. P. Single pilus motor forces exceed 100 pN. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 99, 16012-16017 (2002).
- Touhami, A., Jericho, M. H., Boyd, J. M., Beveridge, T. J. Nanoscale characterization and determination of adhesion forces of Pseudomonas aeruginosa pili by using atomic force microscopy. J. Bacteriol. 188, 370-377 (2006).
- Skerker, J. M., Berg, H. C. Direct observation of extension and retraction of type IV pili. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 98, 6901-6904 (2001).
- Brown, D. C., Larson, R. S. Improvements to parallel plate flow chambers to reduce reagent and cellular requirements. BMC Immunol. 2, 9 (2001).
- Thomas, W. E., Nilsson, L. M., Forero, M., Sokurenko, E. V., Vogel, V. Shear-dependent ‘stick-and-roll’ adhesion of type 1 fimbriated Escherichia coli. Mol. Microbiol. 53, 1545-1557 (2004).
- Thomas, W. E., Trintchina, E., Forero, M., Vogel, V., Sokurenko, E. V. Bacterial adhesion to target cells enhanced by shear force. Cell. 109, 913-923 (2002).
- Bahar, O., Fuente, D. L., Burdman, S. Assessing adhesion, biofilm formation and motility of Acidovorax citrulli using microfluidic flow chambers. FEMS Microbiol. Lett. 312, 33-39 (2010).
- Thomas, W. E. Using a laminar flow system to explain shear-enhanced bacterial adhesion. Proceedings of ICMM2005, Third International Conference on Microchannels and Mini-channels. , 751-759 (2005).
- Fuente, D. L., et al. Assessing adhesion forces of type I and type IV pili of Xylella fastidiosa bacteria by use of a microfluidic flow chamber. Appl. Environ. Microbiol. 73, 2690-2696 (2007).
- DeLange, P. A., Collins, T. L., Pierce, G. E., Robinson, J. B. PilJ localizes to cell poles and is required for type IV pilus extension in Pseudomonas aeruginosa. Curr Microbiol. 55, 389-395 (2007).
- Fuente, D. L., Burr, T. J., Hoch, H. C. Mutations in type I and type IV pilus biosynthetic genes affect twitching motility rates in Xylella fastidiosa. J. Bacteriol. 189, 7507-7510 (2007).
- Ferandez, A., Hawkins, A. C., Summerfield, D. T., Harwood, C. S. Cluster II che genes from Pseudomonas aeruginosa are required for an optimal chemotactic response. J. Bacteriol. 184, 4374-4383 (2002).
- Cursino, L., et al. Identification of an Operon, Pil-Chp, That Controls Twitching Motility and Virulence in Xylella fastidiosa. Mol. Plant Microbe Interact. 10, 1198-1206 (2011).
- Hazelbauer, G. L., Falke, J. J., Parkinson, J. S. Bacterial chemoreceptors: High-performance signaling in networked arrays. Trends Biochem. Sci. 33, 9-19 (2008).
- Costa, H. S., et al. Plant hosts of Xylella fastidiosa in and near southern California vineyards. Plant Dis. 88, 1255-1261 (2004).
- Shi, X. Y., Dumenyo, C. K., Hernandez-Martinez, R., Azad, H., Cooksey, D. A. Characterization of regulatory pathways in Xylella fastidiosa: genes and phenotypes controlled by algU. Appl. Environ. Microbiol. 73, 6748-6756 (2007).
- Matsumoto, A., Young, G. M., Igo, M. M. Chromosome-Based Genetic Complementation System for Xylella fastidiosa. Appl. Environ. Microbiol. 75, 1679-1687 (2009).
- Davis, M. J., Purcell, A. H., Thomson, S. V. Isolation Media for the Pierce’s Disease Bacterium. Phytopathology. 70, 425-429 (1980).
- Xia, Y. N., Whitesides, G. M. Soft lithography. Annu. Rev. Mater. Sci. 28, 153-184 (1998).
- Chaudhury, M. K., Whitesides, G. M. Direct measurement of interfacial interactions between semispherical lenses and flat sheets of poly-(dimethylsiloxane) and their chemical derivatives. Langmuir. 7, 1013-1025 (1991).
- Cruz, L. F., Parker, J. K., Cobine, P. A., De La Fuente, L. Calcium-enhanced twitching motility in Xylella fastidiosa is linked to a single PilY1 homolog. Appl. Environ. Microbiol. 80, 7176-7196 (2014).
