Summary
لتوضيح عملية متعددة الخطوات لنشر البريتوني من سرطان المبيض، تقدم الدراسة الحالية نموذج تجريبي الفئران من نمو الورم الأصلي والانبثاث البريتوني عن طريق التلقيح مثلي مع هذه الخلايا السرطانية.
Abstract
ويرتبط سرطان المبيض الظهاري (EOC) مع بسوء التشخيص لأنه يظهر نشر البريتوني. لتحسين أحوال الطقس، فمن المهم للسيطرة على نشر البريتوني. ومع ذلك، فإنه لا يزال من غير الواضح كيف تنفصل الخلايا السرطانية من الآفات الأولية ونعلق على ميسوثيليوم. هناك حاجة إلى إنشاء نموذج حيواني المناسب لفهم آلية نشر البريتوني في الجسم الحي. في الدراسة الحالية، ونحن نقدم العملية من حقن المحلية من خلايا EOC إلى سطح المبيض الفئران لنمو الانبثاث، بما في ذلك الصفاق وأعضاء بعيدة. واستخدمت الفئران عارية الإناث (BALB / ج نو / نو) في 8 أسابيع من العمر. تحت حقل المجهري للعرض، خلايا EOC (1 × 10 5 خلية / ميكرولتر من المصفوفة المتوسطة خارج الخلية (ECM) القائم على هيدروجيل / المبيض من طرف واحد / الماوس) تم حقنه في الفئران المبايض من خلال نهج خلف الصفاق من الجهة الظهرية. هذه الطريقة المقترحة هو جنيهSS إجراء الغازية للماوس، ويقلل من الأضرار التي لحقت المبيض. هنا، نحن تصف الخطوات المنهجية في تطوير تشكيل الورم الأصلي والمنتشر من مركز عمليات الطوارئ.
Introduction
طلائي سرطان المبيض (EOC) يمثل أعلى نسبة من الوفيات الناجمة عن السرطان بين الأورام الخبيثة أمراض النساء 1. ويرتبط مركز عمليات الطوارئ مع تكهن الفقراء، ويرجع ذلك أساسا إلى أواخر الأعراض لها، وكثيرا ما يرتبط مع disseminations داخل الصفاق متعددة وبعيدة الانبثاث 2-4. نشر البريتوني هو عملية متعددة الخطوات. أولا، الخلايا السرطانية فصل من الآفات الأولية، وتهاجر إلى تجويف البطن. عندما نعلق على الخلايا السرطانية في ميسوثيليوم البريتوني، أنها بداية لغزو الأنسجة من خلال ميسوثيليوم 5،6. من أجل فهم أفضل للورم البيولوجيا (على سبيل المثال، تقدم السرطان والاستجابة العلاجية)، وتقدم نماذج الماوس على ثروة من المعلومات. ويستخدم على نطاق واسع وطعم أجنبي مع خلايا سرطانية بشرية لنماذج الماوس التي يتم فيها تلقيح خلايا سرطانية بشرية تحت الجلد، داخل الصفاق، عن طريق الوريد، وorthotopically. نموذج حيواني مع ز orthotopicallyورم رافتيد يمكن أن تولد أكثر كفاءة ودقة النتائج التي تعكس البيئة ورم في البشر بالمقارنة مع نموذج حيواني مع ورم المطعمة heterotopically. لذلك، بالنسبة لكثير من الأورام البشرية، تم إنشاء نماذج زرع مثلي 7-11.
هنا، نحن تصف التلقيح مثلي الخلايا EOC الإنسان من خلال نهج خلف الصفاق من الجهة الظهرية، الذي الغازية محدودة مقارنة التلقيح بطني. هذه التقنية يمكن أن توفر مجموعة متنوعة من المعلومات المفيدة عن مركز عمليات الطوارئ، وخاصة آلية نشر داخل الصفاق.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
يتبع بروتوكول العلاج المبادئ التوجيهية لإجراء التجارب على الحيوانات من جامعة ناغويا المعتمدة.
1. إعداد تعليق خلية
- واضح خط سرطان الخلايا المبيض البشري الخلية.
- الحفاظ ES-2 خلايا 12 في المتوسط RPMI-1640 مع 10٪ مصل بقري جنيني (FBS) والبنسلين / الستربتومايسين (البنسلين: 100 وحدة / مل، الستربتومايسين: 0.1 ملغ / مل). ثقافة الخلايا عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO 2 حاضنة مرطب.
- جمع الخلايا في مرحلة النمو لوغاريتمي في التربسين 0.05٪ / 0.02٪ EDTA الحل (التربسين / EDTA).
- أولا، إزالة وسائل الإعلام القديمة من سفينة الثقافة الخلية، ثم يغسل خلايا مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني (PBS دون الكالسيوم 2+ / المغنيسيوم 2+، 3-4 مل لكل 25 سم 2).
- التالي، إضافة 1 مل لكل 25 سم 2 من التربسين / EDTA. تدوير سفينة الثقافة خلية لتغطية أحادي الطبقة الخلية مع التربسين / EDTA. بعد إزالة والتخلص التربسين / EDTA، والعودة الخليةوفصل 5 دقائق أو حتى خلايا - سفينة الثقافة إلى الحاضنة لمدة 3.
- فحص الخلايا تحت المجهر للتأكد من فصل الخلايا من سطح السفينة زراعة الخلايا والعائمة.
- إضافة مصل الطازجة التي تحتوي على متوسط النمو لإبطال نشاط التربسين (5 مل لكل 25 سم 2)، وإعادة تعليق الخلايا. نقل إعادة علقت الخلايا إلى 15 مل أنبوب مخروطي الشكل.
- أجهزة الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 5 دقائق. أداء الطرد المركزي إما في 4 درجات مئوية أو درجة حرارة الغرفة. إزالة بعناية طاف وإعادة تعليق الخلايا مع متوسط نمو (5 مل لكل 25 سم 2).
- عدد الخلايا (على سبيل المثال، من خلال استبعاد التريبان الأزرق) ثم إعادة تعليق في متوسط النمو في مناطق ذات كثافة من 2 × 10 8 خلية / مل. وضع خلايا علقت على الجليد.
- ذوبان المصفوفة خارج الخلية المجمدة (ECM) المستندة قسامات هيدروجيل في حمام الثلج.
- إضافة تعليق الخلية إلى قسامات هيدروجيل أساس ECM-في نسبة 1: 1 (النهائية الخلية جoncentration: 1 × 10 5 خلية / ميكرولتر من هيدروجيل مقرها المتوسطة ECM) وتخلط جيدا. ضع تعليق خلية مستعدة في حمام الثلج حتى الاستخدام.
2. مثلي التلقيح مع تعليق خلية
ملاحظة: جراحة لا يحتاج الى جناح مخصص. الجراحة يمكن أن يؤديها على الفوق المختبر في منطقة من الغرفة غير منفصل ولديه الحد الأدنى من النشاط. كما يمكن استخدام غطاء محرك السيارة الصفحي. يجب استخدام الأدوات الجراحية المعقمة ومقص لا ينبغي أن تستخدم لجعل شقوق الجلد.
- استخدام الفئران عارية الإناث (BALB / ج نو / نو) في 8 أسابيع من العمر لهذا النموذج التلقيح مثلي.
- أولا، تخدير الماوس باستخدام استنشاق مع isoflurane (2-4٪). تحقق عمق التخدير عن طريق التأكد من عدم وجود سحب على قرصة اصبع القدم الراسخة. بعد تخدير الماوس، وتطبيق مرهم معقم لطيف للعيون لمنع جفاف عند الضرورة.
- ضع الماوس تخدير على أبرتجي مرحلة جنب البطن إلى أسفل. تطهير المنطقة الجراحية عدة مرات مع كل من الكحول وفرك المستندة إلى بالكلورهيكسيدين القائم على اليود أو.
- جعل شق ~ 2 سم عموديا بالقرب من العمود الفقري بين قوس الضلع الأيمن والفخذ. استخدام ثنى الجراحية المعقمة حول موقع شق. إصلاح أسطح الجلد قطعي مع المشابك للحفاظ على الافتتاح.
ملاحظة: الكامشات يمكن استخدامها بدلا من المشابك. - بعد ذلك، وجعل شق الثاني (حوالي 1 سم) في الصفاق الجداري تحت شق الأول لفتح تجويف البطن. المشبك السطوح البطن قطعي. مقطع الأنسجة الدهنية التي تحيط أنبوب المبيض وقناة فالوب المماثل مع المشبك لإزالة المبيض من تجويف البطن. وضع بعناية المبيض وقناة فالوب على الشاش. ثم، ضع الماوس على جانب البطن إلى أسفل تحت المجهر تشريح.
- ضع تعليق خلية في حقنة الأنسولين (1/2 سم مكعب، 29 G) قبل الحقن. حقن بعناية تعليق خلية استعداد (1- 2 ميكرولتر) في المبيض. لعدة ثوان، الإبقاء على إبرة داخل المبيض لضمان دبق من هيدروجيل القائم على ECM. بعد دبق، تبقى الخلايا السرطانية حقن داخل المبيض.
- بعناية العودة المبيض في الجسم. خياطة الشق الثاني مع الحرير الطبي المعقم، ثم ختم الجلد مع مقاطع الجرح.
- بعد الجراحة، وسوف تدار الفئران لتسكين الألم (على سبيل المثال، ميلوكسيكام، العضل (ايم) أو تحت الجلد (SC)، 0.2 ملغ / كلغ) لالأولية فترة 24 ساعة.
العلاج 3. مرحلة ما بعد العمليات الجراحية
- وضع كل الماوس في قفص منفصل على ورقة نظيفة مع حزمة الساخنة للحفاظ على الحارة الماوس حتى استعاد وعيه كافية للحفاظ على الاستلقاء القصية. ثم، وعودة الحيوانات إلى أقفاصها للتربية والرصد. مراقبة الفئران يوميا لمدة 3-7 أيام بعد العلاج الجراحي.
- رصد الفئران بعد العملية الجراحية
- في حالة علامات الألم وإدارة analgeSICS يوميا (على سبيل المثال، ميلوكسيكام، والتراسل الفوري أو الشوري، 0.2 ملغ / كلغ).
- إذا توجد لدى الفئران علامات للعدوى (على سبيل المثال، احمرار، تورم والتفريغ)، إدارة الحقن اليومي مع كاشف المضادة للعدوى (على سبيل المثال، البنسلين، والتراسل الفوري، 100000 وحدة دولية / كغ).
- إزالة المواد إغلاق الجلد 10-14 أيام بعد تلقي العلاج بعد الجراحة.
4. تحليل الأورام والانبثاث
ملاحظة: سيتم تشكيل ورم في المبيض 2 حقن - 3 أسابيع بعد التلقيح.
- التضحية الفئران عن طريق غاز ثاني أكسيد الكربون، ومن ثم جمع عينات (على سبيل المثال، والأورام، الانبثاث، أجهزة) 13-15 لمزيد من التحليل 14،16-20.
ملاحظة: إذا كان في الجسم الحي نظام التصوير متاح، والخلايا التي تحمل الإنزيمات التي تنتج تلألؤ بيولوجي (على سبيل المثال، وسيفيراز) أو بروتين فلوري (على سبيل المثال، GFP) يمكن استخدامها في هذا البروتوكول. وهذا البروتوكول المعدل يوفر معلومات مفيدة للديناميات انتشار الخلايا السرطانية من الورم الرئيسي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
وكان ستة الفئران عارية المبيضين تلقيح مع واضحة خط خلية سرطان الخلايا البشرية ES-2، كما هو موضح في هذا البروتوكول. كما هو مبين في الشكل 1A، 2 بعد أسابيع، وكان 5 من 6 الفئران ورم في المبيض تلقيح مع خلايا ES-2، ولكن لم يكن هناك ورم في المبيض المقابل دون تلقيح (كما تستخدم عنصر تحكم). وعلاوة على ذلك، 2 من 5 الفئران أظهرت متعددة disseminations البريتوني مع استسقاء. خلايا metastasize إلى الكبد (الشكل 1B). المبايض، مع كل من كتلة الورم في موقع الحقن وعلى الجانب السيطرة، تم تشريح، مقطوع، ملطخة الهيماتوكسيلين يوزين (سعادة)، وتحليلها تحت المجهر (الشكل 2). لوحظ أن عددا كبيرا من خلايا سرطان المبيض في المبيض تلقيح، ولكن ليس على الجانب المقابل. كان شكل الخلية نفسها التي للورم الوالدين.
"الشكل 1" SRC = "/ ملفات / ftp_upload / 54353 / 54353fig1.jpg" />
الشكل 1: ورم تشكيل كتبها مثلي التلقيح واضح مع الإنسان سرطان الخلايا خلايا ES-2. ألف وباء، خضع BALB / ج نو / نو الماوس التلقيح مثلي مع خلايا ES-2. بعد 2 أسابيع، تم التضحية الماوس للتشريح. ب، خلايا metastasize إلى الكبد (كما يتضح من الأسهم). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: الهيماتوكسيلين يوزين تلطيخ من المبيض مع مثلي التلقيح واضح مع الإنسان سرطان الخلايا خلايا ES-2. ألف وباء، المبيض مع تلقيح خلايا ES-2، ملطخة الهيماتوكسيلين يوزين (HE). واعتبر تلطيخ مماثل مقارنة بما كان عليه من سرطان الخلايا اضحفي المبيض البشري. C و D، سعادة تلطيخ المبيض بدون تلقيح كمجموعة تحكم. الحانات الحجم، 100 ميكرون (A، C)، و 20 ميكرون (B، D). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
النماذج الحيوانية ضرورية لتحليل آليات التنمية الورم، والتقدم، ورم خبيث، وفعالية الدواء ضد الخلايا السرطانية. كما استخدمت الفئران الحاملة لخلايا سرطان المبيض الإنسان كنموذج للحيوانات. هنا، نحن تصف إجراء أقل الغازية لإدارة الخلايا السرطانية في المبيض في موقع مثلي. باستخدام هذا الإجراء، التلقيح في المبيض من خلال نهج خلف الصفاق من الجهة الظهرية تقدم مزايا هامة على التقنيات الأخرى المستخدمة بشكل شائع. أولا، يمكن تلقيح مثلي توفر نتائج أكثر كفاءة ودقة والتي تعكس البيئة ورم في البشر 13،21. ثانيا، وهذا نهج خلف الصفاق من الجهة الظهرية يحتاج فقط لتشريح صغير (<1-2 سم) لذلك هو الإجراء السريع مقارنة مع نهج البريتوني. وبالتالي، فإن هذا النهج خلف الصفاق هو أقل الغازية للفئران. ثالثا، المبيض الفئران صغيرة جدا، وغير قادر حتى على قبول كمية كبيرة من الجرميةأيها السادة. في هذا الإجراء قدم، ونحن نستخدم تعليق خلية مركزة للغاية (1 × 10 5 خلية / ميكرولتر) وحجم التلقيح منخفضة (1-2 ميكرولتر / الحقن) بمثابة رصاصة واحدة. وبالتالي، فإنه يقلل من الأضرار التي لحقت المبيض. كما أنه يتجنب تسرب الخلايا تلقيح من المبيض. على الرغم من أن المزيد من البحوث أمر ضروري، قد يكون التلقيح مثلي الفئران وصفت نهجا مفيدا للمساعدة في تطوير علاجات جديدة لعلاج مركز عمليات الطوارئ في المستقبل.
هناك نوعان من النقاط الحرجة في هذا البروتوكول. أولا، يتم استخدام الخلايا في مرحلة النمو لوغاريتمي. ثانيا، يتم وضع الخلايا مع وقف التنفيذ مع هيدروجيل القائم على ECM على الجليد حتى الاستخدام. عندما يبدأ هيدروجيل القائم على ECM لتدفئة، وسوف تبدأ عملية دبق. لتجنب دبق من هيدروجيل القائم على ECM، خلايا إعادة معلقة مع هيدروجيل والأدوات (على سبيل المثال، الأنابيب والحقن والإبر و) القائم على ECM وتحفظ على الجليد حتى الاستخدام. هناك واحد الحد من هذه التقنية.حجم حقن لتعليق الخلية أقل من 3 ميكرولتر، لأن المبيض الماوس لا يمكن أن تقبل كمية كبيرة من اللقاح.
هذا البروتوكول يمكن تعديلها في بعض النقاط. إذا كان في الجسم الحي نظام التصوير متاح، والخلايا التي تحمل الإنزيمات التي تنتج تلألؤ بيولوجي (على سبيل المثال، وسيفيراز) أو بروتين فلوري (على سبيل المثال، GFP) يمكن استخدامها في هذا البروتوكول. وهذا البروتوكول المعدل يوفر معلومات مفيدة للديناميات انتشار الخلايا السرطانية من الورم الرئيسي. أيضا، يستخدم هذا البروتوكول ES-2 خلايا للتلقيح مع المبيض الماوس. وتستمد ES-2 الخلايا من الخلايا السرطانية واضح، وهذا خط الخلية المعارض من النمو في الماوس عارية. خطوط الخلايا الأخرى (على سبيل المثال، وسرطان المصلية) كما يمكن استخدام هذا البروتوكول بدلا من خلايا ES-2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لديهم ما يكشف.
Acknowledgments
الكتاب أشكر أعضاء قسم أمراض النساء والتوليد وعلم الأحياء السرطان لمناقشاتهم المفيدة والمساعدة التقنية. وأيد هذه الدراسة من قبل الجمعية اليابانية لتعزيز العلوم (JSPS) غرانت في والمعونة من أجل البحث العلمي (15K15604، إلى H. كاجياما).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Matrigel matrix | BD | 354234 | ECM-based hydrogel |
| Insulin syringe | TERUMO | SS-05M2913 | 1/2 cc, 29 G x 1/2" |
| Suturing needle with suture | 11 mm, 3/8, Nylon6-0 | ||
| Reflex 7 mm Wound Clip Applier | CellPoint Scientific | 204-1000 | |
| Reflex 7 mm wound clips | CellPoint Scientific | 203-1000 |
References
- Jemal, A., et al.
- Kajiyama, H., et al. Long-term clinical outcome of patients with recurrent epithelial ovarian carcinoma: is it the same for each histological type. Int J Gynecol Cancer. 22 (3), 394-399 (2012).
- Kikkawa, F., et al. Advances in treatment of epithelial ovarian cancer. Nagoya J Med Sci. 68 (1-2), 19-26 (2006).
- Yoshikawa, N., et al. Clinicopathologic features of epithelial ovarian carcinoma in younger vs. older patients: analysis in Japanese women. J Gynecol Oncol. 25 (2), 118-123 (2014).
- Kajiyama, H., et al. Involvement of SDF-1alpha/CXCR4 axis in the enhanced peritoneal metastasis of epithelial ovarian carcinoma. Int J Cancer. 122 (1), 91-99 (2008).
- Terauchi, M., et al. Possible involvement of TWIST in enhanced peritoneal metastasis of epithelial ovarian carcinoma. Clin Exp Metastasis. 24 (5), 329-339 (2007).
- Bronstein, L., Zechner, C., Koeppl, H. Bayesian inference of reaction kinetics from single-cell recordings across a heterogeneous cell population. Methods. 85, 22-35 (2015).
- Guo, W., Zhang, S., Liu, S. Establishment of a novel orthotopic model of breast cancer metastasis to the lung. Oncol Rep. 33 (6), 2992-2998 (2015).
- Lewis-Tuffin, L. J., et al. Src family kinases differentially influence glioma growth and motility. Mol Oncol. , (2015).
- Saar, M., et al. Orthotopic tumorgrafts in nude mice: A new method to study human prostate cancer. Prostate. 75 (14), 1526-1537 (2015).
- Zou, Y., et al. miR-29c suppresses pancreatic cancer liver metastasis in an orthotopic implantation model in nude mice and affects survival in pancreatic cancer patients. Carcinogenesis. 36 (6), 676-684 (2015).
- Lau, D. H., Lewis, A. D., Ehsan, M. N., Sikic, B. I. Multifactorial mechanisms associated with broad cross-resistance of ovarian carcinoma cells selected by cyanomorpholino doxorubicin. Cancer Res. 51 (19), 5181-5187 (1991).
- Bao, L., Matsumura, Y., Baban, D., Sun, Y., Tarin, D. Effects of inoculation site and Matrigel on growth and metastasis of human breast cancer cells. Br J Cancer. 70 (2), 228-232 (1994).
- Huang, M. J., et al. Epidemiological investigation on major depressive disorder in the most heavily damaged areas from Wenchuan earthquake in 2008. Zhonghua Liu Xing Bing Xue Za Zhi. 31 (2), 167-170 (2010).
- Ma, L., et al. Mortality of neonatal respiratory failure related to socioeconomic factors in Hebei province of China. Neonatology. 100 (1), 14-22 (2011).
- Lin, Z., et al. Serum levels of FGF-21 are increased in coronary heart disease patients and are independently associated with adverse lipid profile. PLoS One. 5 (12), e15534 (2010).
- Liu, B., et al. Lumbar interspinous non-fusion techniques: comparison between Coflex and Wallis. Nan Fang Yi Ke Da Xue Xue Bao. 30 (11), 2455-2458 (2010).
- Zhang, Y., et al. Wave intensity analysis of carotid artery: a noninvasive technique for assessing hemodynamic changes of hyperthyroid patients. J Huazhong Univ Sci Technolog Med Sci. 30 (5), 672-677 (2010).
- Song, G. S., et al. Comparative transcriptional profiling and preliminary study on heterosis mechanism of super-hybrid rice. Mol Plant. 3 (6), 1012-1025 (2010).
- Wan, L., et al. The analysis of variation of Han female adolescent bone development in Henan and Zhejiang province. Fa Yi Xue Za Zhi. 26 (2), 97-99 (2010).
- Wang, H. B., et al. Excitation-emission fluorescence characterization study of the three phenolic compounds. Guang Pu Xue Yu Guang Pu Fen Xi. 30 (5), 1271-1274 (2010).
