Summary
Het meerstaps proces van peritoneale verspreiding van ovariumcarcinoom verduidelijken de huidige studie beschrijft een murine experimenteel model van originele tumorontwikkeling en metastase via orthotope peritoneale inoculatie met deze tumorcellen.
Abstract
Epitheliaal ovariumcarcinoom (EOC) is geassocieerd met een slechte prognose omdat het peritoneale verspreiding toont. De prognose te verbeteren, is het belangrijk om peritoneale verspreiding beheersen. Het is echter nog onduidelijk hoe tumorcellen losmaken van primaire letsels en hechten aan de mesothelium. De oprichting van een geschikt diermodel is nodig om een goed begrip van het mechanisme van peritoneale verspreiding in vivo te krijgen. In de huidige studie introduceren we de werkwijze van de lokale injectie van EOC cellen in de muizen ovariële oppervlak om de ontwikkeling van metastasen, waaronder het peritoneum en gelegen organen. Vrouwelijk naakt muizen (BALB / c nu / nu) en 8 weken oud werden gebruikt. Onder een microscopisch gezichtsveld, EOC cellen (1 x 10 5 cellen / gl medium extracellulaire matrix (ECM) -gebaseerde hydrogel / eenzijdige ovarium / muis) werden in muizen eierstokken geïnjecteerd door een retroperitoneale benadering van de dorsale flank. De voorgestelde methode is een less invasieve procedure voor de muis en minimaliseert beschadiging van de eierstok. Hier beschrijven we de methodologische stappen in de ontwikkeling van het origineel en metastatische tumorvorming van EOC.
Introduction
Epitheliale ovariumcarcinoom (EOC) is goed voor het hoogste tarief van kanker-gerelateerde sterfte onder gynaecologische maligniteiten 1. EOC is geassocieerd met een slechte prognose, voornamelijk vanwege de late symptomen en wordt vaak geassocieerd met meerdere intraperitoneale verspreidingen en metastasen 2-4. Peritoneale verspreiding is een multi-step proces. Allereerst tumorcellen losmaken van de primaire letsels en migreren naar de buikholte. Wanneer de tumorcellen hechten aan de peritoneale mesothelium, beginnen ze weefsel binnen te dringen door de mesothelium 5,6. Om beter te begrijpen van de tumor biologie (bv, de progressie van kanker en therapeutische respons), muis modellen bieden een schat aan informatie. Een xenograft met menselijke kankercellen wordt veel gebruikt voor muismodellen waarin menselijke kankercellen subcutaan geïnoculeerd, intraperitoneaal, intraveneus en orthotopically. Een dier model met een orthotopically grafted tumor kan efficiënter en nauwkeuriger resultaten op ten de tumoromgeving bij mensen geven ten opzichte van een diermodel met een geïmplanteerde tumor heterotoop. Daarom is voor vele menselijke tumoren, orthotope transplantatie modellen zijn vastgesteld 7-11.
Hier beschrijven we de orthotope enting van humane cellen EOC door een retroperitoneale benadering van de dorsale flank, die beperkte invasiviteit opzichte ventrale inoculatie. Deze techniek kan een verscheidenheid aan bruikbare informatie over EOC, vooral het mechanisme van intraperitoneale verspreiding verschaffen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Het behandelprotocol volgt de richtlijnen voor dierproeven bij Nagoya University aangenomen.
1. Bereiding van celsuspensies
- Humaan ovarium clear cell carcinoma cellijn.
- Handhaaf ES-2-cellen in 12 RPMI-1640 medium met 10% foetaal runderserum (FBS) en penicilline / streptomycine (penicilline: 100 eenheden / ml, streptomycine: 0,1 mg / ml). Kweekcellen bij 37 ° C in een 5% CO2 bevochtigde incubator.
- Verzamel cellen in de logaritmische groeifase in 0,05% trypsine / 0,02% EDTA-oplossing (trypsine / EDTA).
- Verwijder eerst de oude media uit de celkweek vat, dan was de cellen eenmaal met PBS (PBS zonder Ca 2+ / Mg 2+, 3-4 ml per 25 2 cm).
- Voeg vervolgens 1 ml per 25 cm 2 van trypsine / EDTA. Draai de celkweek vaartuig naar de cel monolaag met trypsine / EDTA dekken. Na het verwijderen en weggooien van trypsine / EDTA, de terugkeer van de celcultuur vaartuig naar de incubator voor 3-5 min of tot cellen worden losgemaakt.
- Onderzoek de cellen onder een microscoop te waarborgen de cellen losgemaakt van het oppervlak van het celkweekvat en zwevende.
- Voeg vers serum dat groeimedium aan de trypsine (5 ml per 25 cm 2) te inactiveren, en resuspendeer de cellen. Transfer-geresuspendeerde cellen om een 15 ml conische buis.
- Centrifugeer bij 300 xg gedurende 5 minuten. Voer centrifugeren hetzij bij 4 ° C of kamertemperatuur. Verwijder voorzichtig supernatant en resuspendeer cellen met groeimedium (5 ml per 25 cm 2).
- Aantal cellen (bijvoorbeeld door trypan-blauw exclusie) dan resuspendeer in groeimedium bij een dichtheid van 2 x 10 8 cellen / ml. Zet de gesuspendeerde cellen op ijs.
- Ontdooi bevroren extracellulaire matrix (ECM) -gebaseerde hydrogel hoeveelheden in een ijsbad.
- Voeg de celsuspensie ECM-based hydrogel fracties bij een verhouding van 1: 1 (c eindcelconcentratieoncentration: 1 x 10 5 cellen / ul van medium-ECM-gebaseerde hydrogel) en meng. Plaats de voorbereide celsuspensies in een ijsbad tot gebruik.
2. Orthotope Inenting met celsuspensies
LET OP: Chirurgie is niet een dedicated suite nodig. Operatie kan worden uitgevoerd op laboratoriumschaal benchtop in een gebied van de ruimte die is gescheiden en heeft minimale activiteit. Een laminaire afzuigkap kan ook worden gebruikt. Steriele chirurgische instrumenten worden gebruikt en schaar mag niet worden gebruikt om de huid insnijdingen.
- Gebruik vrouwelijk naakt muizen (BALB / c nu / nu) op leeftijd van 8 weken voor deze orthotope inenting model.
- Eerst verdoven de muis met behulp van inhalatie met isofluraan (2-4%). Controleer narcose diepte door te controleren of het ontbreken van terugtrekking na stevige teen knijpen. Nadat de muis verdoofd, breng dan een neutrale steriele oogzalf om de ogen te voorkomen indien nodig drogen.
- Plaats de verdoofde muis op een operating stadium buik naar beneden. Ontsmet de chirurgische gebied meerdere malen met zowel alcohol en een jodium-gebaseerde of chloorhexidine-gebaseerde scrub.
- Maak een ~ 2 cm incisie verticaal in de buurt van de wervelkolom tussen de rechter ribbenboog en dijbeen. Een steriele chirurgische doek rond de incisie. Bevestig de ingesneden huid oppervlakken met klemmen om de opening te handhaven.
Opmerking: oprolmechanismen worden gebruikt in plaats klemmen. - Maak vervolgens een tweede incisie (ongeveer 1 cm) en de pariëtale peritoneum in de eerste incisie de buikholte geopend. Klem de ingesneden abdominale oppervlakken. Klem het vetweefsel dat de ipsilaterale eierstokken en eileiders omgeeft met een klem aan de eierstok uit de buikholte verwijderen. Plaats de eierstok en eileider op gaas zorgvuldig. Plaats vervolgens de muis buik naar beneden onder de microscoop ontleden.
- Plaats de cel suspensie in een insulinespuit (1/2 cc, 29 G) net voor injectie. injecteren zorgvuldig bereide celsuspensie (1- 2 gl) in de eierstok. Sinds enkele sec, behoudt de naald in de eierstok te geleren van de ECM-gebaseerde hydrogel te garanderen. Na gelering, de geïnjecteerde tumorcellen blijven in de eierstok.
- Voorzichtig het ovarium in het lichaam. Hechtdraad de tweede incisie met steriele medische zijde, en dan sluit de huid met wond clips.
- Na de operatie wordt de muizen een analgesie (bijvoorbeeld meloxicam, intramusculaire (im) of subcutaan (sc), 0,2 mg / kg) voor een eerste periode van 24 uur worden toegediend.
3. Post-chirurgische behandeling
- Plaats elke muis in een aparte kooi op schoon papier met een hot pack om de muis te warm te houden totdat het voldoende bewustzijn heeft herwonnen om borstligging handhaven. Dan, de terugkeer van de dieren naar hun kooien voor het opfokken en monitoring. Bewaak de muizen dagelijks gedurende 3-7 dagen na chirurgische behandeling.
- Monitoring van postoperatieve muizen
- In geval van tekenen van pijn, beheren analgeSICS dagelijkse (bijvoorbeeld meloxicam, im of sc, 0,2 mg / kg).
- Als muizen tekenen van infectie (bijvoorbeeld roodheid, zwelling, afscheiding), toedienen dagelijkse injectie met anti-infectieuze reagens (bijvoorbeeld penicilline, im, 100.000 IU / kg).
- Verwijder het vel sluiting materialen 10 - 14 dagen na de post-operatieve behandeling.
4. Analyse van tumoren en metastasen
OPMERKING: De tumor wordt gevormd aan het geïnjecteerde eierstok 2-3 weken na inoculatie.
- Offer de muizen door kooldioxide, en dan het verzamelen van de monsters (bijvoorbeeld tumoren, metastasen, organen) 13-15 voor verdere analyse 14,16-20.
OPMERKING: Indien een in vivo imaging systeem beschikbaar, cellen die enzymen die bioluminescentie (bijv, luciferase) of fluorescent eiwit (bijvoorbeeld GFP) produceren kunnen worden gebruikt in dit protocol. Deze gewijzigde protocol zal nuttige informatie te verstrekkende dynamiek van de verspreiding van kankercellen van de primaire tumor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Zes naakt muizen hadden hun eierstokken ingeënt met het menselijk clear cell carcinoma cellijn ES-2, zoals beschreven in dit protocol. Zoals getoond in figuur 1A, na 2 weken, 5 van de 6 muizen hadden een tumor in de eierstok geïnoculeerd met ES-2-cellen, maar er was geen tumor in de contralaterale ovarium zonder enting (als controle). Bovendien, 2 van de 5 muizen vertoonden meerdere peritoneale uitzaaiingen met ascites. Metastaseren naar de lever (Figuur 1B). De eierstokken, beide met de tumormassa op de plaats van inoculatie en de besturingszijde, werden ontleed, coupes gekleurd met hematoxyline-eosine (HE) en onder een microscoop (figuur 2) geanalyseerd. Een groot aantal eierstokkanker cellen waargenomen in de geïnoculeerde eierstok, maar niet aan de contralaterale zijde. De celmorfologie was dezelfde als die van de ouderlijke tumor.
"Figuur 1" src = "/ files / ftp_upload / 54353 / 54353fig1.jpg" />
Figuur 1: tumorvorming door Orthotope Inenting met Human Clear Cell carcinoomcellen ES-2. A en B, de BALB / c-nu / nu muizen ondergingen orthotope inoculatie met ES-2-cellen. Na 2 weken werd de muis gedood voor necropsie. B, metastaseren naar de lever (zoals met pijlen). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Hematoxylin-eosine kleuring van Ovarium met Orthotope Inenting met Human Clear Cell carcinoomcellen ES-2. A en B, eierstok met inoculatie van ES-2-cellen, gekleurd met hematoxyline-eosine (HE). Vertaald kleuring werd waargenomen vergeleken met die van clear cell carcinomain de humane eierstok. C en D, HE kleuring van de eierstok zonder enting als controle. Schaalbalken, 100 um (A, C), 20 urn (B, D). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dierlijke modellen zijn van essentieel belang om de mechanismen van de ontwikkeling van tumoren, progressie, metastase en werkzaamheid van het geneesmiddel te analyseren tegen kankercellen. Muizen die humaan ovarium kankercellen eveneens zijn gebruikt als diermodel. Hier beschrijven we een minder invasieve procedure voor het beheer van de ovariële tumor cellen op een orthotope website. Deze procedure, enting in de eierstokken door een retroperitoneale benadering van de dorsale flank biedt aanzienlijke voordelen boven andere gebruikelijke technieken. Ten eerste kan orthotopische inoculatie efficiënter en nauwkeuriger resultaten die de tumoromgeving mens 13,21 weerspiegelen verschaffen. Ten tweede is dit retroperitoneale benadering van de dorsale flank heeft slechts een kleine dissectie (<1-2 cm) dus het een snelle procedure opzichte van de peritoneale benadering. Daarom is deze retroperitoneale benadering is minder invasief muizen. Ten derde, het murine eierstok is zeer klein, en dus niet in staat om een grote hoeveelheid rea accepterenheren. In deze procedure gepresenteerd, gebruiken we hooggeconcentreerde celsuspensies (1 x 10 5 cellen / gl) en een lage inoculatie volume (1-2 ul / injectie) als een enkel schot; daarom minimaliseert beschadiging van de eierstok. Het voorkomt ook de lekkage van geënte cellen van de eierstok. Hoewel meer intensief onderzoek, kan de beschreven murine orthotope inoculatie een nuttige benadering om nieuwe therapieën te ontwikkelen voor de behandeling van EOC in de toekomst.
Er zijn twee kritieke punten in dit protocol. Eerst worden de cellen die in de logaritmische groeifase. Ten tweede worden de opgehangen met ECM-gebaseerde hydrogel cellen op ijs geplaatst tot gebruik. Wanneer de ECM gebaseerde hydrogel begint op te warmen, zal de gelering te starten. De gelering van de ECM-based hydrogel voorkomen cellen geresuspendeerd met de ECM gebaseerde hydrogel en instrumenten (bijvoorbeeld buizen, injectiespuiten en naalden) worden op ijs bewaard tot toepassing. Er is een beperking van deze techniek.Het injectievolume van de celsuspensie minder dan 3 pl, omdat de muis eierstok een groot volume inoculum niet kan accepteren.
Dit protocol kan in een aantal punten worden gewijzigd. Als een in vivo imaging systeem beschikbaar, cellen die enzymen die bioluminescentie (bijv, luciferase) of fluorescent eiwit (bijvoorbeeld GFP) kan worden gebruikt in dit protocol produceren. Deze gemodificeerde protocol nuttige informatie voor de dynamiek van de verspreiding van kankercellen van de primaire tumor te verschaffen. Ook dit protocol gebruikt ES-2 cellen voor enting met de muis eierstok. ES-2-cellen zijn afgeleid van clear cell carcinoma, en deze cellijn vertoont agressieve groei in naakt muis. Andere cellijnen (bijvoorbeeld, sereus carcinoom) kan ook worden gebruikt dit protocol in plaats van ES-2-cellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
De auteurs danken de leden van de afdeling Obstetrie en Gynaecologie en de biologie van kanker voor hun nuttige discussies en technische bijstand. Deze studie werd ondersteund door een Japan Maatschappij ter Bevordering van de Wetenschap (JSPS) Grant-in-Steun voor Wetenschappelijk Onderzoek (15K15604, om H. Kajiyama).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Matrigel matrix | BD | 354234 | ECM-based hydrogel |
| Insulin syringe | TERUMO | SS-05M2913 | 1/2 cc, 29 G x 1/2" |
| Suturing needle with suture | 11 mm, 3/8, Nylon6-0 | ||
| Reflex 7 mm Wound Clip Applier | CellPoint Scientific | 204-1000 | |
| Reflex 7 mm wound clips | CellPoint Scientific | 203-1000 |
References
- Jemal, A., et al.
- Kajiyama, H., et al. Long-term clinical outcome of patients with recurrent epithelial ovarian carcinoma: is it the same for each histological type. Int J Gynecol Cancer. 22 (3), 394-399 (2012).
- Kikkawa, F., et al. Advances in treatment of epithelial ovarian cancer. Nagoya J Med Sci. 68 (1-2), 19-26 (2006).
- Yoshikawa, N., et al. Clinicopathologic features of epithelial ovarian carcinoma in younger vs. older patients: analysis in Japanese women. J Gynecol Oncol. 25 (2), 118-123 (2014).
- Kajiyama, H., et al. Involvement of SDF-1alpha/CXCR4 axis in the enhanced peritoneal metastasis of epithelial ovarian carcinoma. Int J Cancer. 122 (1), 91-99 (2008).
- Terauchi, M., et al. Possible involvement of TWIST in enhanced peritoneal metastasis of epithelial ovarian carcinoma. Clin Exp Metastasis. 24 (5), 329-339 (2007).
- Bronstein, L., Zechner, C., Koeppl, H. Bayesian inference of reaction kinetics from single-cell recordings across a heterogeneous cell population. Methods. 85, 22-35 (2015).
- Guo, W., Zhang, S., Liu, S. Establishment of a novel orthotopic model of breast cancer metastasis to the lung. Oncol Rep. 33 (6), 2992-2998 (2015).
- Lewis-Tuffin, L. J., et al. Src family kinases differentially influence glioma growth and motility. Mol Oncol. , (2015).
- Saar, M., et al. Orthotopic tumorgrafts in nude mice: A new method to study human prostate cancer. Prostate. 75 (14), 1526-1537 (2015).
- Zou, Y., et al. miR-29c suppresses pancreatic cancer liver metastasis in an orthotopic implantation model in nude mice and affects survival in pancreatic cancer patients. Carcinogenesis. 36 (6), 676-684 (2015).
- Lau, D. H., Lewis, A. D., Ehsan, M. N., Sikic, B. I. Multifactorial mechanisms associated with broad cross-resistance of ovarian carcinoma cells selected by cyanomorpholino doxorubicin. Cancer Res. 51 (19), 5181-5187 (1991).
- Bao, L., Matsumura, Y., Baban, D., Sun, Y., Tarin, D. Effects of inoculation site and Matrigel on growth and metastasis of human breast cancer cells. Br J Cancer. 70 (2), 228-232 (1994).
- Huang, M. J., et al. Epidemiological investigation on major depressive disorder in the most heavily damaged areas from Wenchuan earthquake in 2008. Zhonghua Liu Xing Bing Xue Za Zhi. 31 (2), 167-170 (2010).
- Ma, L., et al. Mortality of neonatal respiratory failure related to socioeconomic factors in Hebei province of China. Neonatology. 100 (1), 14-22 (2011).
- Lin, Z., et al. Serum levels of FGF-21 are increased in coronary heart disease patients and are independently associated with adverse lipid profile. PLoS One. 5 (12), e15534 (2010).
- Liu, B., et al. Lumbar interspinous non-fusion techniques: comparison between Coflex and Wallis. Nan Fang Yi Ke Da Xue Xue Bao. 30 (11), 2455-2458 (2010).
- Zhang, Y., et al. Wave intensity analysis of carotid artery: a noninvasive technique for assessing hemodynamic changes of hyperthyroid patients. J Huazhong Univ Sci Technolog Med Sci. 30 (5), 672-677 (2010).
- Song, G. S., et al. Comparative transcriptional profiling and preliminary study on heterosis mechanism of super-hybrid rice. Mol Plant. 3 (6), 1012-1025 (2010).
- Wan, L., et al. The analysis of variation of Han female adolescent bone development in Henan and Zhejiang province. Fa Yi Xue Za Zhi. 26 (2), 97-99 (2010).
- Wang, H. B., et al. Excitation-emission fluorescence characterization study of the three phenolic compounds. Guang Pu Xue Yu Guang Pu Fen Xi. 30 (5), 1271-1274 (2010).
