Summary
At afklare flertrinsproces af peritoneal udbredelse af ovariecarcinom, den aktuelle undersøgelse præsenterer en murin eksperimentel model for oprindelige tumor udvikling og peritoneal metastase via ortotopisk inokulering med disse tumorceller.
Abstract
Epiteliale ovariecarcinom (EOC) er forbundet med en dårlig prognose, fordi det viser peritoneal formidling. At forbedre prognosen, er det vigtigt at styre peritoneal formidling. Det er dog stadig uklart, hvordan tumorceller løsnes fra primære læsioner og tillægger mesothelium. Etableringen af en passende dyremodel er nødvendig for at få en forståelse af den mekanisme for peritoneal udbredelse in vivo. I den aktuelle undersøgelse, introducerer vi processen fra den lokale injektion af EOC celler i murine æggestokkene overflade til udviklingen af metastaser, herunder peritoneum og fjerntliggende organer. Nøgne hunmus (BALB / c nu / nu) efter 8 uger gamle, blev anvendt. Under en mikroskopisk synsfelt, EOC-celler (1 x 10 5 celler / pl medium-ekstracellulær matrix (ECM) -baseret hydrogel / ensidig ovarie / mus) blev injiceret i murine æggestokkene gennem en retroperitoneal fremgangsmåde fra den dorsale flanke. Denne foreslåede metode er en less invasiv procedure til musen og minimerer skade på ovariet. Her beskriver vi de metodiske skridt i udviklingen af den oprindelige og metastatisk tumor dannelse af EOC.
Introduction
Epiteliale ovariecarcinom (EOC) tegner sig for den højeste sats for kræft-relateret dødelighed blandt gynækologiske maligniteter 1. EOC er associeret med en dårlig prognose, primært på grund af den sene symptomatologi, og er ofte forbundet med flere intraperitoneale dataudsendelser og fjerne metastaser 2-4. Peritoneal formidling er en multi-trins proces. For det første tumorceller løsnes fra de primære læsioner, og migrere ind i bughulen. Når tumorcellerne tillægger peritoneal mesothelium, de begynder at invadere væv gennem mesothelium 5,6. For bedre at forstå tumorbiologi (f.eks cancer progression og terapeutisk respons), musemodeller give et væld af information. En xenograft med humane cancerceller er meget brugt til musemodeller, hvor humane cancerceller inokuleres subkutant, intraperitonealt, intravenøst, og orthotopisk. En dyremodel med en orthotopisk grafted tumor kan mere effektivt og præcist skabe resultater, der afspejler tumoren miljø i mennesker sammenlignet med en dyremodel med en heterotopisk transplanteret tumor. Derfor, for mange humane tumorer, ortotopisk transplantation modeller er blevet etableret 7-11.
Her beskriver vi den ortotopisk inokulering af humane EOC celler gennem en retroperitoneal fremgangsmåde fra den dorsale flanke, som har begrænset invasionsevne sammenlignet med ventrale inokulering. Denne teknik kan give en række nyttige oplysninger om EOC, især mekanismen for intraperitoneal formidling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Behandlingen protokol følger retningslinjerne for dyreforsøg vedtaget af Nagoya University.
1. Fremstilling af cellesuspensioner
- Humanovarie clear cell carcinoma-cellelinie.
- Opretholde ES-2 celler 12 i RPMI-1640-medium med 10% føtalt bovint serum (FBS) og penicillin / streptomycin (penicillin: 100 enheder / ml, streptomycin: 0,1 mg / ml). Dyrke celler ved 37 ° C i en 5% CO2 befugtet inkubator.
- Indsamle celler i den logaritmiske vækstfase i 0,05% trypsin / 0,02% EDTA-opløsning (trypsin / EDTA).
- Først fjerne de gamle medier fra cellekulturen fartøj, vask derefter cellerne én gang med PBS (PBS uden Ca2 + / Mg2 +, 3 - 4 ml pr 25 cm 2).
- Dernæst tilsættes 1 ml pr 25 cm 2 af trypsin / EDTA. Rotere celledyrkningsbeholderen at dække cellemonolaget med trypsin / EDTA. Når du har fjernet og kassere trypsin / EDTA, returnere cellendyrkningsbeholderen til inkubatoren i 3 - 5 min eller indtil celler er fritliggende.
- Undersøg cellerne under mikroskop for at sikre cellerne frigøres fra overfladen af celledyrkningsbeholderen og flydende.
- Tilføj frisk serum, der indeholder vækstmedium at inaktivere trypsin (5 ml pr 25 cm 2), og re-suspendere cellerne. Overfør resuspenderede celler til et 15 ml konisk rør.
- Centrifuger ved 300 x g i 5 min. Udføre centrifugering enten ved 4 ° C eller stuetemperatur. Fjern forsigtigt supernatanten og re-suspendere celler med vækstmedium (5 ml pr 25 cm 2).
- Tæl celler (fx ved trypan-blå-udelukkelse) derefter genopslæmmes i vækstmedium med en tæthed på 2 x 10 8 celler / ml. Sætte de suspenderede celler på is.
- Optø frosne ekstracellulære matrix (ECM) -baseret hydrogel alikvoter i et isbad.
- Tilføj cellesuspensionen til ECM-baserede hydrogel alikvoter ved et forhold på 1: 1 (endelig Cell Concentration: 1 x 10 5 celler / ul medium-ECM-baserede hydrogel) og bland grundigt. Placer de fremstillede cellesuspensioner i et isbad indtil brug.
2. ortotopisk Podning med cellesuspensioner
BEMÆRK: Kirurgi kræver ikke en dedikeret suite. Kirurgi kan udføres på et laboratorium benchtop i et område af rummet, der er adskilt og har minimal aktivitet. Laminar hood, kan også anvendes. Sterile kirurgiske instrumenter skal anvendes og saks bør ikke anvendes til at gøre hudincisioner.
- Brug nøgne hunmus (BALB / c nu / nu) ved 8 ugers alderen for denne ortotopisk podning model.
- Først bedøver musen med inhalation med isofluran (2 - 4%). Check bedøvelse dybde ved at verificere manglende tilbagetrækning på fast tå knivspids. Når musen er bedøvet, anvende en kedelig steril oftalmologiske salve til øjnene for at forhindre udtørring som nødvendigt.
- Placer bedøvet musen på en operating etape mave nedad. Desinficer den kirurgiske område flere gange med både alkohol og en jod-baserede eller klorhexidin-baserede krat.
- Lav en ~ 2 cm snit lodret nær rygsøjlen mellem højre ribben bue og lårben. Anvend en steril kirurgisk afdækningsstykke omkring incisionssted. Fastgør indridset hudoverflader med klemmer til at opretholde åbningen.
Bemærk: retraktorer kan anvendes i stedet for klemmer. - Dernæst foretages et nyt snit (ca. 1 cm) på parietale peritoneum under første indsnit for at åbne bughulen. Spænd de indridset abdominal overflader. Clip fedtvævet, der omgiver den ipsilaterale æggestok og æggeleder med en klemme for at fjerne æggestok fra bughulen. Placer forsigtigt æggestok og æggeleder på gaze. Derefter placere musen mave nedad under dissektionsmikroskop.
- Placer cellesuspensionen i en insulinsprøjte (1/2 cc, 29 G) lige før injektion. injicere omhyggeligt den fremstillede cellesuspension (1- 2 pi) i ovariet. For flere sek, bevarer nålen i æggestokken at sikre gelering af ECM-baserede hydrogel. Efter gelering, de injicerede tumorceller forblive inde i ovariet.
- returnere omhyggeligt æggestokken ind i kroppen. Sy den anden snit med sterilt medicinsk silke, og derefter forsegle huden med sår klip.
- Efter operationen vil musene blive indgivet en analgesi (f.eks meloxicam, intramuskulær (im) eller subkutan (sc), 0,2 mg / kg) til indledende periode på 24 hr.
3. Post-kirurgisk behandling
- Placer hver mus i et separat bur på rent papir med et varmt pack at holde musen varme, indtil det har genvundet tilstrækkelig bevidsthed til at opretholde brystleje. Vend derefter tilbage dyrene til deres bure til opdræt og overvågning. Overvåg musene dagligt i 3 - 7 dage efter kirurgisk behandling.
- Overvågning af postoperativ mus
- I tilfælde af tegn på smerte, administrere analgeSICS dagligt (f.eks meloxicam, im eller sc, 0,2 mg / kg).
- Hvis mus har tegn på infektion (f.eks, rødme, hævelse, udflåd), administrere daglig injektion med en anti-infektiøs reagens (f.eks penicillin, im, 100.000 IU / kg).
- Fjern hudlukning materialer 10 - 14 dage efter, post-kirurgisk behandling.
4. Analyse af tumorer og metastaser
BEMÆRK: Tumor vil blive dannet på de injicerede ovarie 2 - 3 uger efter inokulering.
- Sacrifice musene ved kuldioxid, og derefter indsamle prøverne (f.eks tumorer, metastaser, organer) 13-15 til yderligere analyse 14,16-20.
BEMÆRK: Hvis et in vivo imaging system er til rådighed, celler, der bærer enzymer, der producerer bioluminescens (f.eks luciferase) eller fluorescerende protein (f.eks GFP) kan anvendes i denne protokol. Dette ændrede protokol vil give nyttige oplysninger omdynamikken i spredningen af cancerceller fra den primære tumor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Seks nøgne mus havde deres æggestokke podet med den humane clear cell carcinoma-cellelinie ES-2, som beskrevet i denne protokol. Som vist i figur 1A, efter 2 uger, 5 af de 6 mus havde en tumor i æggestokken inokuleret med ES-2 celler, men der var ingen tumor i den kontralaterale ovarie uden podning (anvendt som kontrol). Desuden 2 af de 5 mus viste flere peritoneale dataudsendelser med ascites. Celler metastaserer til leveren (figur 1B). Æggestokkene, både med tumormassen på inokulationsstedet og om kontrol vedkommende blev dissekeret, snittet, farvet med hematoxylin-eosin (HE), og analyseret under et mikroskop (figur 2). Der blev observeret et stort antal ovariecancerceller i det inokulerede ovarie, men ikke på den kontralaterale side. Cellemorfologien var den samme som den for den parentale tumor.
"Figur 1" src = "/ files / ftp_upload / 54.353 / 54353fig1.jpg" />
Figur 1: Tumor Stiftelse ved ortotopisk Podning med human Clear celle karcinom Cells ES-2. A og B, BALB / c nu / nu mus undergik ortotopisk inokulering med ES-2-celler. Efter 2 uger blev musen ofret for obduktion. B, Celler metastaserer til leveren (som angivet ved pile). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Hæmatoxylin-eosin Farvning af Æggestok med ortotopisk Podning med human Clear celle karcinom Cells ES-2. A og B, ovarie med podning af ES-2-celler, farvet med hematoxylin-eosin (HE). Lignende farvning sås sammenlignet med clear cell carcinomai det humane ovarie. C og D, HE farvning af ovariet uden podning som en kontrol. Scale barer, 100 um (A, C), 20 pm (B, D). Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dyremodeller er afgørende for at analysere de mekanismer tumorudvikling, progression, metastase, og drug effektivitet mod cancerceller. Mus, der bærer humane ovariecancerceller også er blevet anvendt som en dyremodel. Her beskriver vi en mindre invasiv procedure for administrationen af ovarietumorceller ved en orthotopisk site. Under anvendelse af denne procedure, inokulering i ovariet gennem en retroperitoneal fremgangsmåde fra den dorsale flanke giver betydelige fordele i forhold til andre almindeligt anvendte teknikker. For det første kan ortotopisk podning give mere effektive og præcise resultater, der afspejler tumor miljø i mennesker 13,21. Andet er denne retroperitoneal fremgangsmåde fra den dorsale flanke kun behøver en lille dissektion (<1 - 2 cm), så det er en hurtig procedure i forhold til den peritoneale tilgang. Derfor er denne retroperitoneal fremgangsmåde er mindre invasiv for mus. For det tredje, det murine æggestok er meget lille, og så ikke kan acceptere en stor mængde af reaherretoilettet. I denne præsenteres procedure anvender vi stærkt koncentrerede cellesuspensioner (1 x 10 5 celler / ul) og en lav podning volumen (1 - 2 ud pl / injektion) som et enkelt skud; derfor, det minimerer skader på ovariet. Det undgår man også lækage af podede celler fra æggestokkene. Selvom yderligere forskning er afgørende, kan den beskrevne murine ortotopisk podning være en nyttig metode til at hjælpe med at udvikle nye behandlingsformer til behandling af EOC i fremtiden.
Der er to kritiske punkter i denne protokol. For det første anvendes cellerne i den logaritmiske vækstfase. For det andet er celler suspenderet med ECM-baserede hydrogel anbragt på is indtil anvendelse. Når ECM-baserede hydrogel begynder at varme, vil geleringsprocessen begynder. At undgå gelering af ECM-baserede hydrogel, celler resuspenderes med ECM-baserede hydrogel og instrumenter (f.eks, rør, sprøjter og kanyler) holdes på is indtil anvendelse. Der er en begrænsning af denne teknik.Injektionsvolumenet af cellesuspensionen er mindre end 3 pi, fordi muse æggestok ikke kan acceptere et stort volumen inokulum.
Denne protokol kan ændres på nogle punkter. Hvis en in vivo imaging system er til rådighed, celler, der bærer enzymer, der producerer bioluminescens (f.eks luciferase) eller fluorescerende protein (f.eks GFP) kan anvendes i denne protokol. Dette ændrede protokol vil give nyttige oplysninger om dynamikken i spredningen af kræftceller fra den primære tumor. Også denne protokol anvender ES-2-celler til podning med muse æggestok. ES-2 celler er afledt fra clear cell carcinoma, og denne cellelinje udviser aggressiv vækst i nøgne mus. Andre cellelinjer (f.eks serøs karcinom) også kan bruges denne protokol i stedet for ES-2 celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Forfatterne takker medlemmerne af Institut for Obstetrik og Gynækologi og Cancer Biology for deres nyttige diskussioner og teknisk bistand. Denne undersøgelse blev understøttet af en Japan Society for fremme af Science (JSP'er) Grant-in-Støtte til videnskabelig forskning (15K15604, at H. Kajiyama).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Matrigel matrix | BD | 354234 | ECM-based hydrogel |
| Insulin syringe | TERUMO | SS-05M2913 | 1/2 cc, 29 G x 1/2" |
| Suturing needle with suture | 11 mm, 3/8, Nylon6-0 | ||
| Reflex 7 mm Wound Clip Applier | CellPoint Scientific | 204-1000 | |
| Reflex 7 mm wound clips | CellPoint Scientific | 203-1000 |
References
- Jemal, A., et al.
- Kajiyama, H., et al. Long-term clinical outcome of patients with recurrent epithelial ovarian carcinoma: is it the same for each histological type. Int J Gynecol Cancer. 22 (3), 394-399 (2012).
- Kikkawa, F., et al. Advances in treatment of epithelial ovarian cancer. Nagoya J Med Sci. 68 (1-2), 19-26 (2006).
- Yoshikawa, N., et al. Clinicopathologic features of epithelial ovarian carcinoma in younger vs. older patients: analysis in Japanese women. J Gynecol Oncol. 25 (2), 118-123 (2014).
- Kajiyama, H., et al. Involvement of SDF-1alpha/CXCR4 axis in the enhanced peritoneal metastasis of epithelial ovarian carcinoma. Int J Cancer. 122 (1), 91-99 (2008).
- Terauchi, M., et al. Possible involvement of TWIST in enhanced peritoneal metastasis of epithelial ovarian carcinoma. Clin Exp Metastasis. 24 (5), 329-339 (2007).
- Bronstein, L., Zechner, C., Koeppl, H. Bayesian inference of reaction kinetics from single-cell recordings across a heterogeneous cell population. Methods. 85, 22-35 (2015).
- Guo, W., Zhang, S., Liu, S. Establishment of a novel orthotopic model of breast cancer metastasis to the lung. Oncol Rep. 33 (6), 2992-2998 (2015).
- Lewis-Tuffin, L. J., et al. Src family kinases differentially influence glioma growth and motility. Mol Oncol. , (2015).
- Saar, M., et al. Orthotopic tumorgrafts in nude mice: A new method to study human prostate cancer. Prostate. 75 (14), 1526-1537 (2015).
- Zou, Y., et al. miR-29c suppresses pancreatic cancer liver metastasis in an orthotopic implantation model in nude mice and affects survival in pancreatic cancer patients. Carcinogenesis. 36 (6), 676-684 (2015).
- Lau, D. H., Lewis, A. D., Ehsan, M. N., Sikic, B. I. Multifactorial mechanisms associated with broad cross-resistance of ovarian carcinoma cells selected by cyanomorpholino doxorubicin. Cancer Res. 51 (19), 5181-5187 (1991).
- Bao, L., Matsumura, Y., Baban, D., Sun, Y., Tarin, D. Effects of inoculation site and Matrigel on growth and metastasis of human breast cancer cells. Br J Cancer. 70 (2), 228-232 (1994).
- Huang, M. J., et al. Epidemiological investigation on major depressive disorder in the most heavily damaged areas from Wenchuan earthquake in 2008. Zhonghua Liu Xing Bing Xue Za Zhi. 31 (2), 167-170 (2010).
- Ma, L., et al. Mortality of neonatal respiratory failure related to socioeconomic factors in Hebei province of China. Neonatology. 100 (1), 14-22 (2011).
- Lin, Z., et al. Serum levels of FGF-21 are increased in coronary heart disease patients and are independently associated with adverse lipid profile. PLoS One. 5 (12), e15534 (2010).
- Liu, B., et al. Lumbar interspinous non-fusion techniques: comparison between Coflex and Wallis. Nan Fang Yi Ke Da Xue Xue Bao. 30 (11), 2455-2458 (2010).
- Zhang, Y., et al. Wave intensity analysis of carotid artery: a noninvasive technique for assessing hemodynamic changes of hyperthyroid patients. J Huazhong Univ Sci Technolog Med Sci. 30 (5), 672-677 (2010).
- Song, G. S., et al. Comparative transcriptional profiling and preliminary study on heterosis mechanism of super-hybrid rice. Mol Plant. 3 (6), 1012-1025 (2010).
- Wan, L., et al. The analysis of variation of Han female adolescent bone development in Henan and Zhejiang province. Fa Yi Xue Za Zhi. 26 (2), 97-99 (2010).
- Wang, H. B., et al. Excitation-emission fluorescence characterization study of the three phenolic compounds. Guang Pu Xue Yu Guang Pu Fen Xi. 30 (5), 1271-1274 (2010).
