Summary
Afin de clarifier le processus en plusieurs étapes de la dissémination peritoneale d'un carcinome de l'ovaire, l'étude actuelle présente un modèle expérimental murin du développement de la tumeur d'origine et métastases péritonéales par inoculation orthotopique avec ces cellules tumorales.
Abstract
carcinome ovarien épithélial (COE) est associée à un mauvais pronostic, car il montre la diffusion péritonéale. Pour améliorer le pronostic, il est important de contrôler la dissémination peritoneale. Cependant, on ignore encore comment les cellules tumorales se détachent des lésions primaires et attachent à la mésothélium. La mise en place d'un modèle animal approprié est nécessaire pour mieux comprendre le mécanisme de diffusion péritonéale in vivo. Dans l'étude actuelle, nous introduisons le processus de l'injection locale de cellules EOC dans la surface de l'ovaire murin au développement de métastases, y compris le péritoine et des organes éloignés. Femme souris nude (BALB / c nu / nu) à 8 semaines d'âge ont été utilisés. Sous un champ de vision microscopique, les cellules EOC (1 x 10 5 cellules / pl de la matrice extracellulaire moyen (ECM) à base d' hydrogel / ovaire unilatéral / souris) ont été injectés dans les ovaires de souris grâce à une approche rétropéritonéale du flanc dorsal. Cette méthode proposée est un chierss procédure invasive pour la souris et minimise les dommages causés à l'ovaire. Ici, nous décrivons les étapes méthodologiques dans le développement de la formation de la tumeur d'origine et métastatique du COU.
Introduction
Carcinome ovarien épithélial (COE) représente le plus haut taux de mortalité liée au cancer chez les tumeurs malignes gynécologiques 1. EOC est associée à un mauvais pronostic, principalement en raison de son retard symptomatologie, et est souvent associée à de multiples disséminations intrapéritonéale et métastases à distance 2-4. diffusion péritonéale est un processus en plusieurs étapes. Tout d'abord, les cellules tumorales se détachent des lésions primaires et migrent dans la cavité abdominale. Lorsque les cellules tumorales se fixent au mésothélium péritonéal, ils commencent à envahir les tissus à travers le mésothélium 5,6. Afin de mieux comprendre la biologie de la tumeur (par exemple, la progression du cancer et la réponse thérapeutique), des modèles de souris fournissent une mine d'informations. Une xénogreffe de cellules cancéreuses humaines est largement utilisé pour les modèles de souris dans lequel les cellules cancéreuses humaines sont inoculées par voie sous- cutanée, intraperitoneale, intraveineuse, et de manière orthotopique. Un modèle animal orthotopique avec un gempilée tumeur peut produire plus efficacement et avec précision des résultats qui reflètent l'environnement de la tumeur chez l'être humain par rapport à un modèle animal avec une tumeur greffée hétérotopique. Par conséquent, pour de nombreuses tumeurs humaines, des modèles de transplantation orthotopique ont été établis 7-11.
Ici, nous décrivons l'inoculation orthotopique de cellules EOC humaines grâce à une approche rétropéritonéale du flanc dorsal, ce qui a limité l'invasivité par rapport à l'inoculation ventral. Cette technique peut fournir une variété d'informations utiles sur EOC, en particulier le mécanisme de diffusion intrapéritonéale.
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Protocol
Le protocole de traitement suit les lignes directrices pour l'expérimentation animale adoptée par l'Université de Nagoya.
1. Préparation de suspensions de cellules
- ligne Human ovarien clair carcinome cellulaire.
- Maintenir ES-2 , les cellules 12 dans du milieu RPMI-1640 avec 10% de sérum de fœtus bovin (FBS) et de la pénicilline / streptomycine (pénicilline: 100 unités / ml, streptomycine 0,1 mg / ml). Les cellules de culture à 37 ° C dans un incubateur à CO2 humidifié à 5%.
- Recueillir les cellules dans la phase logarithmique de croissance à 0,05% de solution d'EDTA / 0,02% de trypsine (trypsine / EDTA).
- D' abord, enlever les vieux médias de la cuve de culture cellulaire, puis laver les cellules une fois avec du PBS (PBS sans Ca 2+ / Mg 2+, 3 - 4 ml par 25 2 cm).
- Ensuite, ajoutez 1 ml par 25 cm 2 de trypsine / EDTA. Faire tourner la cuve de culture cellulaire pour couvrir la monocouche cellulaire avec de la trypsine / EDTA. Après le retrait et le rejet de trypsine / EDTA, retourner la cellulerécipient de culture dans l'incubateur pendant 3 - 5 min ou jusqu'à ce que les cellules sont détachées.
- Examiner les cellules sous un microscope pour assurer que les cellules se détachent de la surface du récipient de culture cellulaire et flottante.
- Ajouter sérum frais contenant un milieu de croissance pour inactiver la trypsine (5 ml par 25 cm 2), et remettre en suspension les cellules. Transférer les cellules remises en suspension dans un tube de 15 ml conique.
- Centrifuger à 300 xg pendant 5 min. Effectuer centrifugation, soit à 4 ° C ou à température ambiante. Retirez délicatement le surnageant et les cellules avec un milieu de croissance re-suspension (5 ml par 25 cm 2).
- Nombre de cellules (par exemple, par l' exclusion trypan bleu) , puis remettre en suspension dans un milieu de croissance à une densité de 2 x 10 8 cellules / ml. Mettre les cellules en suspension sur de la glace.
- Thaw matrice extracellulaire congelée (ECM) à base d'hydrogel aliquotes dans un bain de glace.
- Ajouter la suspension de cellules à des aliquotes d'hydrogel à base d'ECM dans un rapport de 1: 1 (dernière cellule concentration: 1 x 10 5 cellules / ul d'hydrogel à base moyen ECM) et bien mélanger. Placer les suspensions cellulaires préparées dans un bain de glace jusqu'à utilisation.
2. Orthotopique Inoculation avec Suspensions cellulaires
NOTE: La chirurgie ne nécessite pas une suite dédiée. La chirurgie peut être réalisée sur une paillasse de laboratoire dans une zone de la chambre qui est séparée et a une activité minimale. Une hotte laminaire peut également être utilisé. instruments chirurgicaux stériles doivent être utilisés et les ciseaux ne doivent pas être utilisés pour faire des incisions de la peau.
- Utilisez la souris nude femelle (BALB / c nu / nu) à 8 semaines d'âge pour ce modèle d'inoculation orthotopique.
- Tout d'abord, anesthésier la souris à l'aide d'inhalation avec de l'isoflurane (2-4%). Vérifiez profondeur de l'anesthésie en vérifiant l'absence de retrait sur l'entreprise pincement de l'orteil. Après la souris est anesthésiée, appliquer une pommade ophtalmique stérile fade aux yeux pour éviter le séchage, si nécessaire.
- Placer la souris anesthésiée sur une opérating ventre côté de la scène vers le bas. Désinfecter la zone chirurgicale plusieurs fois avec l'alcool et un gommage à base de chlorhexidine à base d'iode ou.
- Faire un ~ 2 cm incision verticale près de la colonne vertébrale entre l'arc costal droit et le fémur. Utilisez un champ opératoire stérile autour du site d'incision. Fixer les surfaces incisées de la peau avec des pinces pour maintenir l'ouverture.
Note: Retractors peuvent être utilisés à la place des pinces. - Ensuite, faire une seconde incision (environ 1 cm) au péritoine pariétal sous la première incision pour ouvrir la cavité abdominale. Fixer les surfaces abdominales incisées. Fixez le tissu adipeux qui entoure le tube de l'ovaire et de Fallope ipsilatéral avec une pince pour enlever l'ovaire de la cavité abdominale. Placez délicatement l'ovaire et trompe de Fallope sur de la gaze. Ensuite, placez le ventre du côté de la souris vers le bas sous le microscope de dissection.
- Placer la suspension cellulaire dans une seringue à insuline (1/2 cc, 29 G) juste avant l'injection. injecter soigneusement la suspension cellulaire préparée (1- 2 pi) dans l'ovaire. Pour plusieurs sec, conserver l'aiguille à l'intérieur de l'ovaire pour assurer la gélification de l'hydrogel à base ECM. Après la gélification, les cellules tumorales injectées restent à l'intérieur de l'ovaire.
- retourner soigneusement l'ovaire dans le corps. Suture la seconde incision avec de la soie médical stérile, puis sceller la peau avec des pinces de plaies.
- Après la chirurgie, les souris seront administrés une analgésie (par exemple, le méloxicam, intramusculaire (im) ou sous - cutanée (sc), 0,2 mg / kg) pour la période de 24 heures initiale.
3. Traitement post-opératoire
- Placez chaque souris dans une cage séparée sur du papier propre avec un pack chaud pour conserver la chaleur de la souris jusqu'à ce qu'il ait repris connaissance suffisante pour maintenir décubitus sternale. Ensuite, retourner les animaux à leurs cages d'élevage et de surveillance. Surveiller les souris par jour pendant 3 - 7 jours après le traitement chirurgical.
- Le suivi post-opératoire des souris
- En cas de signes de douleur, administrer analgesics quotidienne (par exemple, le méloxicam, im ou sc, 0,2 mg / kg).
- Si les souris présentent des signes d'infection (par exemple, une rougeur, enflure, écoulement), d' administrer une injection quotidienne avec un réactif anti-infectieux (par exemple, la pénicilline, im, 100 000 UI / kg).
- Retirez les matériaux de fermeture de la peau 10 - 14 jours après le traitement post-chirurgical.
4. Analyse des tumeurs et des métastases
NOTE: La tumeur sera formé à l'injection d'ovaire 2 - 3 semaines après l'inoculation.
- Sacrifiez les souris par le dioxyde de carbone, et collecter les échantillons (par exemple, les tumeurs, les métastases, organes) 13-15 pour une analyse ultérieure 14,16-20.
REMARQUE: si un système d'imagerie in vivo est disponible, les cellules portant des enzymes qui produisent une bioluminescence (par exemple, la luciférase) ou d'une protéine fluorescente (par exemple, GFP) peuvent être utilisées dans ce protocole. Ce protocole modifié fournira des informations utiles pourla dynamique de la propagation des cellules cancéreuses de la tumeur primaire.
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Representative Results
Six souris nues avaient leurs ovaires inoculés avec la claire lignée humaine de cellules de carcinome de cellules ES-2, tel que décrit dans ce protocole. Comme le montre la figure 1A, après 2 semaines, 5 des 6 souris avaient une tumeur de l'ovaire inoculés avec ES-2 cellules, mais il n'y avait pas de tumeur dans l'ovaire controlatéral sans inoculation (utilisé comme témoin). En outre, 2 des 5 souris ont montré plusieurs disséminations péritonéales avec ascite. Les cellules métastasent dans le foie (figure 1B). Les ovaires, à la fois avec la masse de la tumeur au niveau du site d'inoculation et sur le côté de commande, on a disséqué, sectionnés, colorés avec de l' hématoxyline-éosine (HE) et analysées au microscope (Figure 2). Un grand nombre de cellules de cancer de l'ovaire ont été observées dans l'ovaire inoculé, mais pas sur le côté controlatéral. La morphologie des cellules est la même que celle de la tumeur parentale.
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Figure 1: Tumeur Formation par Orthotopique Inoculation avec Human Effacer Cell Carcinoma Cellules ES-2. A et B, le / c nu / nu ont subi une inoculation de souris BALB orthotopique avec des cellules ES-2. Après 2 semaines, la souris a été sacrifié pour nécropsie. B, les cellules métastaser au niveau du foie (comme indiqué par des flèches). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2: hématoxyline-éosine de Ovaire avec Orthotopique Inoculation avec Human Effacer Cell Carcinoma Cellules ES-2. A et B, de l' ovaire par inoculation de cellules ES-2, colorées à l' hématoxyline-éosine (HE). coloration similaire a été observée par rapport à celle du carcinome à cellules clairesdans l'ovaire humain. C et D, coloration HE de l'ovaire sans inoculation en tant que témoin. Les barres d'échelle, 100 um (A, C), 20 um (B, D). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
Les modèles animaux sont essentiels pour analyser les mécanismes de développement de la tumeur, la progression, la métastase, et l'efficacité des médicaments contre les cellules cancéreuses. Les souris porteuses de cellules cancéreuses d'ovaire humain ont également été utilisés en tant que modèle animal. Ici, nous décrivons une procédure moins invasive pour l'administration des cellules tumorales ovariennes sur un site orthotopique. En utilisant cette procédure, l'inoculation dans l'ovaire par une approche rétropéritonéale du flanc dorsal offre des avantages significatifs par rapport aux autres techniques couramment utilisées. Tout d' abord, l' inoculation orthotopique peut fournir des résultats plus efficaces et précises qui reflètent l'environnement de la tumeur chez les humains 13,21. Deuxièmement, cette approche rétropéritonéale du flanc dorsal seulement besoin d'une petite dissection (<1 - 2 cm) de sorte qu'il est une procédure rapide par rapport à l'approche péritonéale. Par conséquent, cette approche rétropéritonéale est moins invasive pour les souris. En troisième lieu, l'ovaire de souris est très faible, et donc incapable d'accepter une grande quantité de reagents. Dans ce mode opératoire présenté, on utilise des suspensions cellulaires hautement concentrées (1 x 10 5 cellules / ul) et un volume d'inoculation faible (1 - 2 pl / injection) en une seule prise de vue; Par conséquent, il minimise les dommages à l'ovaire. Elle évite aussi les fuites de cellules inoculées à partir de l'ovaire. Bien que des recherches supplémentaires est essentiel, l'inoculation orthotopique murin décrit peut être une approche utile pour aider à développer de nouvelles thérapies pour le traitement de l'EOC à l'avenir.
Il y a deux points critiques dans ce protocole. Tout d'abord, les cellules sont utilisées dans la phase de croissance logarithmique. Deuxièmement, les cellules en suspension avec hydrogel à base ECM-sont placés sur la glace jusqu'à utilisation. Quand l'hydrogel à base ECM commence à se réchauffer, le processus de gélification commence. Pour éviter la gélification de l'hydrogel à base ECM, les cellules remises en suspension avec l'hydrogel et les instruments (par exemple, des tubes, des seringues et aiguilles) sur la base ECM-sont conservés sur la glace jusqu'à utilisation. Il y a une limitation de cette technique.Le volume d'injection de la suspension de cellules est inférieure à 3 ul, car l'ovaire de souris ne peut pas accepter un grand volume d'inoculum.
Ce protocole peut être modifié en quelques points. Si un système d'imagerie in vivo est disponible, les cellules portant des enzymes qui produisent une bioluminescence (par exemple, la luciférase) ou d'une protéine fluorescente (par exemple, GFP) peut être utilisé dans ce protocole. Ce protocole modifié fournira des informations utiles pour la dynamique de la propagation des cellules cancéreuses de la tumeur primaire. En outre, ce protocole utilise ES-2 cellules pour l'inoculation avec ovaire de souris. ES-2 cellules sont dérivées de carcinome à cellules claires, et cette lignée cellulaire présente une croissance agressive chez la souris nude. D' autres lignées cellulaires (par exemple, le carcinome séreux) peut également être utilisé à la place de ce protocole d'ES-2 cellules.
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Disclosures
Les auteurs n'ont rien à dévoiler.
Acknowledgments
Les auteurs remercient les membres du Département d'obstétrique et de gynécologie et biologie du cancer pour leurs discussions utiles et une assistance technique. Cette étude a été soutenue par une Société japonaise pour la promotion de la science (JSPS) Grant-in-Aid pour la recherche scientifique (15K15604; H. Kajiyama).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Matrigel matrix | BD | 354234 | ECM-based hydrogel |
| Insulin syringe | TERUMO | SS-05M2913 | 1/2 cc, 29 G x 1/2" |
| Suturing needle with suture | 11 mm, 3/8, Nylon6-0 | ||
| Reflex 7 mm Wound Clip Applier | CellPoint Scientific | 204-1000 | |
| Reflex 7 mm wound clips | CellPoint Scientific | 203-1000 |
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