Summary
डिम्बग्रंथि कार्सिनोमा के पेरिटोनियल प्रसार के multistep प्रक्रिया को स्पष्ट करने के लिए, वर्तमान अध्ययन इन ट्यूमर कोशिकाओं के साथ ओर्थोटोपिक टीका के माध्यम से मूल ट्यूमर के विकास और पेरिटोनियल मेटास्टेसिस के एक murine प्रयोगात्मक मॉडल प्रस्तुत करता है।
Abstract
उपकला डिम्बग्रंथि कार्सिनोमा (ईओसी) एक गरीब रोग का निदान के साथ जुड़े क्योंकि यह पेरिटोनियल प्रसार से पता चलता है। रोग का निदान में सुधार करने के लिए, यह पेरिटोनियल प्रसार को नियंत्रित करने के लिए महत्वपूर्ण है। हालांकि, यह कैसे ट्यूमर कोशिकाओं प्राथमिक घावों से अलग और mesothelium को देते हैं अभी स्पष्ट नहीं है। एक उपयुक्त पशु मॉडल की स्थापना विवो में पेरिटोनियल प्रसार के तंत्र की समझ हासिल करने की जरूरत है। वर्तमान अध्ययन में, हम स्थानीय मेटास्टेसिस के विकास, पेरिटोनियम और दूर के अंगों सहित murine डिम्बग्रंथि सतह में ईओसी कोशिकाओं के इंजेक्शन से प्रक्रिया शुरू। उम्र के 8 सप्ताह में महिला नग्न चूहों (BALB / ग परमाणु / यू) का इस्तेमाल किया गया। देखने का एक सूक्ष्म क्षेत्र के तहत, ईओसी कोशिकाओं (1 x 10 5 कोशिकाओं / मध्यम बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम) की μl आधारित हाइड्रोजेल / एकतरफा अंडाशय / माउस) पृष्ठीय ओर से एक retroperitoneal दृष्टिकोण के माध्यम से murine अंडाशय में इंजेक्ट किया गया। इस प्रस्तावित विधि एक Le हैमाउस के लिए एसएस इनवेसिव प्रक्रिया और अंडाशय को होने वाले नुकसान को कम करता है। यहाँ, हम ईओसी की मूल और metastatic ट्यूमर गठन के विकास में methodological कदम का वर्णन है।
Introduction
उपकला डिम्बग्रंथि कार्सिनोमा (ईओसी) स्त्री रोग कैंसर 1 के बीच कैंसर से संबंधित मृत्यु दर की उच्चतम दर के लिए खातों। ईओसी मुख्य रूप से अपने देर से लक्षणों की वजह से, एक गरीब रोग का निदान के साथ जुड़ा हुआ है, और अक्सर कई intraperitoneal disseminations और दूर मेटास्टेसिस 2-4 के साथ जुड़ा हुआ है। पेरिटोनियल प्रचार-प्रसार के लिए एक बहु कदम प्रक्रिया है। सबसे पहले, ट्यूमर कोशिकाओं प्राथमिक घावों से अलग, और उदर गुहा में पलायन। ट्यूमर कोशिकाओं पेरिटोनियल mesothelium के लिए देते हैं, वे mesothelium 5,6 के माध्यम से ऊतकों पर आक्रमण करने के लिए शुरू करते हैं। ताकि बेहतर ट्यूमर जीव विज्ञान (जैसे, कैंसर की प्रगति और चिकित्सीय प्रतिक्रिया) को समझने के लिए, माउस मॉडल में जानकारी का खजाना प्रदान करते हैं। मानव कैंसर कोशिकाओं के साथ एक जेनोग्राफ्ट व्यापक रूप से माउस मॉडल, जिसमें मानव कैंसर कोशिकाओं subcutaneously inoculated हैं, intraperitoneally, नसों, और orthotopically के लिए प्रयोग किया जाता है। एक orthotopically जी के साथ एक पशु मॉडलrafted ट्यूमर और अधिक कुशलता से और सही परिणाम है कि एक heterotopically grafted ट्यूमर के साथ एक पशु मॉडल के साथ तुलना में मानव में ट्यूमर के माहौल को प्रतिबिंबित उत्पन्न कर सकते हैं। इसलिए, कई मानव ट्यूमर के लिए, ओर्थोटोपिक प्रत्यारोपण मॉडल 7-11 स्थापित किया गया है।
यहाँ, हम पृष्ठीय पार्श्व, जो invasiveness सीमित है उदर टीका की तुलना में से एक retroperitoneal दृष्टिकोण के माध्यम से मानव ईओसी कोशिकाओं के ओर्थोटोपिक टीका का वर्णन है। इस तकनीक को ईओसी पर उपयोगी जानकारी, विशेष रूप से intraperitoneal प्रचार-प्रसार की व्यवस्था की एक किस्म प्रदान कर सकते हैं।
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Protocol
उपचार प्रोटोकॉल पशु प्रयोग नागोया विश्वविद्यालय द्वारा अपनाई के लिए दिशा निर्देशों के बाद।
1. सेल निलंबन की तैयारी
- मानव डिम्बग्रंथि स्पष्ट सेल कार्सिनोमा सेल लाइन।
- (: 100 यूनिट / एमएल, स्ट्रेप्टोमाइसिन: 0.1 मिलीग्राम / एमएल पेनिसिलिन) 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) और पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ RPMI 1640 मध्यम में ते-2 कोशिकाओं 12 बनाए रखें। एक 5% सीओ 2 humidified इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर संस्कृति कोशिकाओं।
- trypsin / 0.02% EDTA समाधान (trypsin / EDTA) 0.05% में लघुगणक विकास के चरण में कोशिकाओं को ले लीजिए।
- (- 4 मिलीलीटर 25 सेमी 2 प्रति 3 सीए 2 / एमजी बिना पीबीएस 2 +,) पहले, पुराने मीडिया सेल संस्कृति पोत से हटाने तो पीबीएस के साथ एक बार कोशिकाओं को धो लें।
- इसके बाद, 25 सेमी / trypsin EDTA के 2 प्रति 1 मिलीलीटर जोड़ें। trypsin / EDTA के साथ सेल monolayer को कवर करने के लिए सेल संस्कृति पोत घुमाएँ। हटाने और discarding / trypsin EDTA के बाद, सेल लौटने के3 के लिए इनक्यूबेटर संस्कृति पोत - कोशिकाओं 5 मिनट या जब तक अलग कर रहे हैं।
- एक खुर्दबीन के नीचे कोशिकाओं की जांच सुनिश्चित करने के लिए कोशिकाओं सेल संस्कृति पोत और फ्लोटिंग की सतह से अलग कर रहे हैं।
- ताजा मध्यम विकास युक्त trypsin (प्रति 25 सेमी 2 से 5 एमएल) निष्क्रिय करने के लिए, और कोशिकाओं फिर से निलंबित सीरम जोड़ें। एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब के लिए फिर से निलंबित कोशिकाओं स्थानांतरण।
- 5 मिनट के लिए 300 XG पर अपकेंद्रित्र। 4 डिग्री सेल्सियस या कमरे के तापमान पर centrifugation या तो प्रदर्शन करना। ध्यान से सतह पर तैरनेवाला हटाने और (प्रति 25 सेमी 2 से 5 एमएल) फिर से निलंबित मध्यम विकास के साथ कोशिकाओं।
- कोशिकाओं (जैसे, trypan नीले बहिष्कार से) गणना तो मध्यम विकास में 2 एक्स 10 8 सेल / एमएल के घनत्व पर फिर से निलंबित। बर्फ पर निलंबित कोशिकाओं रखो।
- पिघलना जमे हुए बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम) एक बर्फ स्नान में हाइड्रोजेल aliquots आधारित।
- 1 (अंतिम सेल सी: 1 के अनुपात में ईसीएम आधारित हाइड्रोजेल aliquots करने के लिए सेल निलंबन जोड़ेंoncentration: 1 एक्स 10 5 कोशिकाओं / मध्यम ईसीएम आधारित हाइड्रोजेल की μl) और मिश्रण अच्छी तरह से। उपयोग करें जब तक एक बर्फ स्नान में तैयार सेल निलंबन रखें।
2. सेल निलंबन के साथ Orthotopic टीका
नोट: सर्जरी के एक समर्पित सूट की आवश्यकता नहीं है। सर्जरी कमरे में है कि अलग है और कम से कम गतिविधि है के एक क्षेत्र में एक प्रयोगशाला benchtop पर किया जा सकता है। एक लामिना हुड भी इस्तेमाल किया जा सकता है। बाँझ सर्जिकल उपकरणों का इस्तेमाल किया जाना चाहिए और कैंची त्वचा चीरों बनाने के लिए नहीं किया जाना चाहिए।
- इस ओर्थोटोपिक टीका मॉडल के लिए 8 सप्ताह की आयु में महिला नग्न चूहों (BALB / ग परमाणु / यू) का प्रयोग करें।
- (- 4% 2) सबसे पहले, माउस isoflurane साथ साँस लेना का उपयोग कर anesthetize। फर्म पैर की अंगुली चुटकी पर वापसी की कमी की पुष्टि करने से संवेदनाहारी गहराई की जाँच करें। बाद माउस anesthetized है, के रूप में आवश्यक सुखाने को रोकने के लिए आंखों के लिए एक नरम बाँझ नेत्र मरहम लागू होते हैं।
- एक operat पर anesthetized माउस प्लेसआईएनजी चरण पेट-नीचे की ओर। शल्य चिकित्सा के क्षेत्र में दोनों शराब और एक आयोडीन के आधार पर या chlorhexidine आधारित हाथ धोने के साथ कई बार कीटाणुरहित।
- खड़ी सही तटीय कट्टर और फीमर के बीच रीढ़ की हड्डी के पास एक ~ 2 सेमी चीरा। चीरा साइट के चारों ओर एक बाँझ सर्जिकल कपड़ा का प्रयोग करें। clamps के साथ छिन्न त्वचा सतहों फिक्स उद्घाटन बनाए रखने के लिए।
नोट: Retractors अकड़न के बजाय प्रयोग किया जा सकता है। - अगले, उदर गुहा को खोलने के लिए सबसे पहले चीरा तहत पार्श्विका पेरिटोनियम पर एक दूसरे चीरा (लगभग 1 सेमी) बनाते हैं। दबाना छिन्न पेट की सतहों। वसा ऊतक है कि एक क्लैंप के साथ ipsilateral अंडाशय और फैलोपियन ट्यूब चारों ओर से घेरे उदर गुहा से अंडाशय को दूर करने के लिए क्लिप। ध्यान से अंडाशय और धुंध पर फैलोपियन ट्यूब जगह। फिर, विदारक माइक्रोस्कोप के नीचे जगह माउस पेट की ओर।
- (1/2 सीसी, 29 जी) एक इंसुलिन सिरिंज में सेल निलंबन की जगह सिर्फ इंजेक्शन से पहले। सावधानी से तैयार सेल निलंबन (इंजेक्षन 1- 2 μl) अंडाशय में। कई सेकंड के लिए, ईसीएम आधारित हाइड्रोजेल का जमाना सुनिश्चित करने के लिए अंडाशय के भीतर सुई बरकरार रहती है। जमाना बाद, इंजेक्शन ट्यूमर कोशिकाओं अंडाशय के अंदर रहते हैं।
- ध्यान से शरीर में अंडाशय वापसी। बाँझ चिकित्सा रेशम के साथ दूसरे चीरा सीवन, और फिर घाव क्लिप के साथ त्वचा सील।
- सर्जरी के बाद, चूहों प्रारंभिक 24 घंटा अवधि के लिए एक पीड़ानाश (जैसे, meloxicam, इंट्रामस्क्युलर (आईएम) या चमड़े के नीचे (अनुसूचित जाति), 0.2 मिलीग्राम / किग्रा) दिलाई जाएगी।
3. शल्य चिकित्सा के बाद उपचार
- साफ कागज पर एक अलग पिंजरे में प्रत्येक माउस के एक गर्म पैक के साथ जगह माउस गर्म रखने के लिए जब तक यह पर्याप्त होश आ गया है स्टर्नल लेटना बनाए रखने के लिए। फिर, पालन और निगरानी के लिए अपने पिंजरों में जानवरों वापसी। शल्य चिकित्सा उपचार के बाद 7 दिनों - 3 के लिए दैनिक चूहों की निगरानी।
- पश्चात चूहों की निगरानी
- दर्द के लक्षण के मामले में, analge प्रशासनSICS दैनिक (जैसे, meloxicam, आईएम या अनुसूचित जाति, 0.2 / किलो मिलीग्राम)।
- चूहों संक्रमण (जैसे, लालिमा, सूजन, मुक्ति) के लक्षण है, तो एक विरोधी संक्रामक अभिकर्मक (जैसे, पेनिसिलिन, आईएम, 100,000 आइयू / किग्रा) के साथ दैनिक इंजेक्शन प्रशासन।
- शल्य चिकित्सा के बाद उपचार के बाद 14 दिन - 10 हटाये त्वचा बंद सामग्री।
4. ट्यूमर और मेटास्टेसिस के विश्लेषण
ध्यान दें: ट्यूमर इंजेक्शन अंडाशय 2 पर गठन किया जाएगा - टीका के बाद 3 सप्ताह।
- कार्बन डाइऑक्साइड से चूहों बलिदान, और फिर आगे के विश्लेषण के 14,16-20 के लिए नमूने (जैसे, ट्यूमर, मेटास्टेसिस, अंगों) 13-15 इकट्ठा।
नोट: यदि एक vivo इमेजिंग प्रणाली उपलब्ध है, असर एंजाइमों कि bioluminescence (जैसे, luciferase) या फ्लोरोसेंट प्रोटीन (जैसे, GFP) का उत्पादन कोशिकाओं को इस प्रोटोकॉल में इस्तेमाल किया जा सकता है। इस संशोधित प्रोटोकॉल के लिए उपयोगी जानकारी प्रदान करेगाप्राथमिक ट्यूमर से कैंसर कोशिकाओं के प्रसार की गतिशीलता।
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Representative Results
छह नग्न चूहों इस प्रोटोकॉल में वर्णित के रूप में अपने अंडाशय, मानव स्पष्ट सेल कार्सिनोमा सेल लाइन ते-2 के साथ टीका था। जैसा कि चित्र में दिखाया गया है 1 ए, 2 सप्ताह के बाद, 6 चूहों के 5 अंडाशय ते -2 कोशिकाओं के साथ टीका में एक ट्यूमर था, लेकिन टीका बिना contralateral अंडाशय में कोई ट्यूमर (एक नियंत्रण के रूप में प्रयोग किया जाता है) नहीं था। इसके अलावा, 5 चूहों के 2 जलोदर के साथ कई पेरिटोनियल disseminations दिखाया। प्रकोष्ठों जिगर (चित्रा 1 बी) के लिए metastasize। अंडाशय, टीका स्थल पर और नियंत्रण तरफ ट्यूमर जन के साथ दोनों, विच्छेदित कर रहे थे sectioned, hematoxylin-eosin (एचई) के साथ दाग, और एक माइक्रोस्कोप (चित्रा 2) के तहत विश्लेषण किया। डिम्बग्रंथि के कैंसर की कोशिकाओं की एक बड़ी संख्या टीका अंडाशय में मनाया गया, लेकिन contralateral पक्ष में नहीं। सेल आकृति विज्ञान माता पिता का ट्यूमर के रूप में ही किया गया था।
"चित्रा 1" src = "/ files / ftp_upload / 54353 / 54353fig1.jpg" />
चित्रा 1: मानव स्पष्ट सेल कार्सिनोमा कोशिकाओं ते-2 के साथ Orthotopic टीका द्वारा ट्यूमर गठन। ए और बी, BALB / ग परमाणु / परमाणु माउस ते -2 कोशिकाओं के साथ ओर्थोटोपिक टीका कराना पड़ा। 2 सप्ताह के बाद, माउस शव-परीक्षा के लिए बलिदान किया था। बी, प्रकोष्ठों जिगर के लिए metastasize (के रूप में तीर द्वारा संकेत)। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 2: Orthotopic टीका के साथ मानव स्पष्ट सेल कार्सिनोमा कोशिकाओं ते-2 के साथ Hematoxylin-eosin अंडाशय के धुंधला हो जाना। ए और बी, ते -2 कोशिकाओं की टीका के साथ अंडाशय, hematoxylin-eosin (एचई) के साथ दाग। इसी धुंधला स्पष्ट सेल कार्सिनोमा की तुलना में देखा गया थामानव अंडाशय में। सी और डी, वह एक नियंत्रण के रूप में टीका के बिना अंडाशय का धुंधला। स्केल सलाखों, 100 माइक्रोन (ए, सी), 20 माइक्रोन (बी, डी)। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
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Discussion
पशु मॉडलों कैंसर कोशिकाओं के खिलाफ ट्यूमर के विकास, प्रगति, मेटास्टेसिस, और दवा प्रभावकारिता के तंत्र का विश्लेषण करने के लिए आवश्यक हैं। असर मानव डिम्बग्रंथि के कैंसर की कोशिकाओं को चूहे भी एक पशु मॉडल के रूप में इस्तेमाल किया गया है। यहाँ, हम एक orthotopic स्थल पर डिम्बग्रंथि ट्यूमर कोशिकाओं के प्रशासन के लिए एक कम आक्रामक प्रक्रिया का वर्णन। पृष्ठीय ओर से एक retroperitoneal दृष्टिकोण के माध्यम से इस प्रक्रिया, अंडाशय में टीका का उपयोग अन्य आमतौर पर इस्तेमाल की तकनीक से अधिक महत्वपूर्ण लाभ प्रदान करता है। सबसे पहले, ओर्थोटोपिक टीका और अधिक कुशल और सटीक परिणाम है कि मनुष्य 13,21 में ट्यूमर के माहौल को प्रतिबिंबित प्रदान कर सकते हैं। दूसरे, पृष्ठीय ओर से इस retroperitoneal दृष्टिकोण केवल एक छोटा सा विच्छेदन की जरूरत है (<1 - 2 सेमी) तो यह पेरिटोनियल दृष्टिकोण की तुलना में एक तेजी से प्रक्रिया है। इसलिए, इस retroperitoneal दृष्टिकोण चूहों के लिए कम आक्रामक है। तीसरा, murine अंडाशय वजह की एक बड़ी राशि स्वीकार करने के लिए बहुत छोटे हैं, और इतने में असमर्थ हैमर्द। इस प्रस्तुत की प्रक्रिया में, हम अत्यधिक ध्यान केंद्रित सेल निलंबन (1 x 10 5 कोशिकाओं / μl) और एक कम मात्रा का उपयोग टीका (1 - 2 μl / इंजेक्शन) एक ही शॉट के रूप में; इसलिए, यह अंडाशय को होने वाले नुकसान को कम करता है। यह भी अंडाशय से टीका कोशिकाओं के रिसाव से बचा जाता है। हालांकि आगे अनुसंधान के लिए आवश्यक है, वर्णित murine ओर्थोटोपिक टीका मदद करने के लिए भविष्य में ईओसी के इलाज के लिए नए उपचारों का विकास एक उपयोगी दृष्टिकोण हो सकता है।
इस प्रोटोकॉल में दो महत्वपूर्ण बातें हैं। सबसे पहले, कोशिकाओं लघुगणक विकास के चरण में उपयोग किया जाता है। दूसरे, ईसीएम आधारित हाइड्रोजेल के साथ निलंबित कर दिया कोशिकाओं का उपयोग करें जब तक बर्फ पर रखा जाता है। ईसीएम आधारित हाइड्रोजेल गर्म करने के लिए शुरू होता है, जमाना प्रक्रिया शुरू होगी। ईसीएम आधारित हाइड्रोजेल का जमाना बचने के लिए, कोशिकाओं ईसीएम आधारित हाइड्रोजेल और उपकरणों (जैसे, ट्यूब, सीरिंज, और सुइयों) के साथ फिर से निलंबित उपयोग करें जब तक बर्फ पर रखा जाता है। इस तकनीक से एक सीमा है।माउस अंडाशय inoculum की एक बड़ी मात्रा में स्वीकार नहीं कर सकते क्योंकि सेल निलंबन के इंजेक्शन की मात्रा, कम से कम 3 μl है।
इस प्रोटोकॉल के कुछ बिंदुओं में संशोधित किया जा सकता है। यदि एक vivo इमेजिंग प्रणाली उपलब्ध है, कोशिकाओं एंजाइमों कि bioluminescence (जैसे, luciferase) या फ्लोरोसेंट प्रोटीन (जैसे, GFP) इस प्रोटोकॉल में इस्तेमाल किया जा सकता है उत्पादन असर। इस संशोधित प्रोटोकॉल प्राथमिक ट्यूमर से कैंसर कोशिकाओं के प्रसार की गतिशीलता के लिए उपयोगी जानकारी प्रदान करेगा। इसके अलावा, इस प्रोटोकॉल माउस अंडाशय के साथ टीका के लिए ते -2 कोशिकाओं का उपयोग करता है। ते-2 कोशिकाओं स्पष्ट सेल कार्सिनोमा से निकाली गई है, और इस सेल लाइन नग्न माउस में आक्रामक विकास को दर्शाती है। अन्य सेल लाइनों (जैसे, तरल कार्सिनोमा) भी ते -2 कोशिकाओं की इस प्रोटोकॉल का इस्तेमाल किया जा सकता बजाय।
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Disclosures
लेखकों के पास खुलासे के लिए कुछ भी नहीं है।
Acknowledgments
लेखक अपने उपयोगी विचार विमर्श और तकनीकी सहायता के लिए प्रसूति एवं स्त्री रोग विभाग के सदस्यों और कैंसर जीवविज्ञान धन्यवाद। इस अध्ययन में विज्ञान के संवर्धन (JSPS) के लिए एक जापान सोसायटी द्वारा समर्थित किया गया ग्रांट-इन-एड वैज्ञानिक अनुसंधान के लिए (; एच Kajiyama को 15K15604)।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Matrigel matrix | BD | 354234 | ECM-based hydrogel |
| Insulin syringe | TERUMO | SS-05M2913 | 1/2 cc, 29 G x 1/2" |
| Suturing needle with suture | 11 mm, 3/8, Nylon6-0 | ||
| Reflex 7 mm Wound Clip Applier | CellPoint Scientific | 204-1000 | |
| Reflex 7 mm wound clips | CellPoint Scientific | 203-1000 |
References
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