Summary
Para aclarar el proceso de múltiples etapas de diseminación peritoneal de carcinoma de ovario, el estudio actual presenta un modelo experimental murino de desarrollo del tumor original y la metástasis peritoneal a través de la inoculación ortotópico con estas células tumorales.
Abstract
El carcinoma de ovario epitelial (EOC) se asocia con un mal pronóstico, ya que muestra la diseminación peritoneal. Para mejorar el pronóstico, es importante para controlar la diseminación peritoneal. Sin embargo, todavía no está claro cómo las células tumorales se desprenden de las lesiones primarias y se unen a la mesotelio. Se necesita el establecimiento de un modelo animal apropiado para obtener una comprensión del mecanismo de la difusión peritoneal in vivo. En el estudio actual, se introduce el proceso de la inyección local de células EOC en la superficie del ovario murino para el desarrollo de metástasis, incluyendo el peritoneo y órganos distantes. Se utilizaron ratones desnudos hembra (BALB / c nu / nu) a las 8 semanas de edad. Bajo un campo microscópico de vista, las células EOC (1 x 10 5 células / l de matriz-medio extracelular (ECM) a base de hidrogel / ovario unilateral / ratón) se inyectaron en ovarios murinos a través de un enfoque retroperitoneal desde el flanco dorsal. Este método propuesto es un ficheross procedimiento invasivo para el ratón y minimiza el daño al ovario. A continuación, describimos los pasos metodológicos en el desarrollo de la formación del tumor original y metastásico del COE.
Introduction
El carcinoma de ovario epitelial (EOC) representa la mayor tasa de mortalidad por cáncer en las neoplasias ginecológicas 1. COE se asocia con un mal pronóstico, debido principalmente al retraso de su sintomatología, y con frecuencia se asocia con múltiples diseminaciones intraperitoneal y metástasis a distancia 2-4. diseminación peritoneal es un proceso de múltiples pasos. En primer lugar, las células tumorales se desprenden de las lesiones primarias, y migran hacia la cavidad abdominal. Cuando las células tumorales se unen a la mesotelio peritoneal, empiezan a invadir los tejidos a través del mesotelio 5,6. Con el fin de entender mejor la biología del tumor (por ejemplo, la progresión del cáncer y la respuesta terapéutica), modelos de ratón proporcionan una gran cantidad de información. Un xenoinjerto con células de cáncer humano es ampliamente utilizado para modelos de ratones en los que se inoculan células de cáncer humano por vía subcutánea, por vía intraperitoneal, por vía intravenosa, y ortotópicamente. Un modelo animal con una forma ortotópica gtumor techo elevado puede generar de manera más eficiente y con precisión los resultados que reflejan el entorno de tumor en seres humanos en comparación con un modelo animal con un tumor heterotópicamente injertado. Por lo tanto, para muchos tumores humanos, los modelos de trasplante ortotópico se han establecido 7-11.
A continuación, describimos la inoculación ortotópico de células EOC humanos mediante un enfoque retroperitoneal desde el flanco dorsal, que ha de invasión limitada en comparación con la inoculación ventral. Esta técnica puede proporcionar una variedad de información útil sobre EOC, especialmente el mecanismo de difusión intraperitoneal.
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Protocol
El protocolo de tratamiento se ajusta a las directrices para la experimentación con animales adoptada por la Universidad de Nagoya.
1. Preparación de las suspensiones celulares
- clara línea de ovario humano carcinoma de células.
- Mantener ES-2 células 12 en medio RPMI-1640 con 10% de suero bovino fetal (FBS) y penicilina / estreptomicina (penicilina: 100 unidades / ml, estreptomicina: 0,1 mg / ml). Células de cultivo a 37 ° C en un 5% de CO2 humidificada.
- Recoger células en la fase de crecimiento logarítmico en 0,05% / 0,02% de solución de EDTA tripsina (tripsina / EDTA).
- En primer lugar, eliminar los viejos medios desde el recipiente de cultivo de células, a continuación, lavar las células una vez con PBS (PBS sin Ca2 + / Mg2 +, 3 - 4 ml por cada 25 cm 2).
- A continuación, añadir 1 ml por cada 25 cm 2 de tripsina / EDTA. Girar el recipiente de cultivo celular para cubrir la monocapa de células con tripsina / EDTA. Después de retirar y desechar tripsina / EDTA, devolver la célularecipiente de cultivo a la incubadora durante 3-5 min o hasta que las células se separan.
- Se examinan las células con un microscopio para asegurar que las células se separan de la superficie del recipiente de cultivo celular y flotante.
- Añadir suero fresco que contiene medio de crecimiento para inactivar la tripsina (5 ml por 25 cm 2), y volver a suspender las células. Transferencia de las células resuspendidas a un tubo cónico de 15 ml.
- Centrifugar a 300 xg durante 5 min. Realizar centrifugación ya sea a 4 ° C o temperatura ambiente. Retirar con cuidado el sobrenadante y las células con medio de cultivo una nueva suspensión (5 ml por cada 25 cm2).
- Recuento de células (por ejemplo, por exclusión con azul de tripano) y luego volver a suspender en medio de crecimiento a una densidad de 2 x 10 8 células / ml. Poner las células suspendidas en el hielo.
- Descongelar la matriz extracelular congelada (ECM) a base de hidrogel alícuotas en un baño de hielo.
- Añadir la suspensión celular a alícuotas de hidrogel a base de ECM en una proporción de 1: 1 (final de la celda concentración: 1 x 10 5 células / l de hidrogel a base de medio-ECM) y mezclar bien. Colocar las suspensiones de células preparadas en un baño de hielo hasta su uso.
2. ortotópico La inoculación con suspensiones celulares
NOTA: cirugía no requiere un conjunto dedicado. La cirugía se puede realizar en una mesa de trabajo de laboratorio en un área de la habitación que está separado y tiene una actividad mínima. Una campana laminar también se puede utilizar. instrumentos quirúrgicos estériles se deben utilizar tijeras y no deben ser utilizados para hacer incisiones en la piel.
- Utilizar ratones desnudos hembra (BALB / c nu / nu) a las 8 semanas de edad para este modelo ortotópico de la inoculación.
- En primer lugar, anestesiar el ratón de usar la inhalación con isoflurano (2-4%). Comprobar la profundidad anestésica mediante la comprobación de falta de abstinencia cuando se pizca dedo del pie firme. Después se anestesia el ratón, aplicar una pomada oftálmica estéril sosa para los ojos para evitar el secado según sea necesario.
- Coloque el ratón anestesiado en una operacing etapa del vientre hacia abajo. Desinfectar el área quirúrgica varias veces con alcohol y un exfoliante a base de clorhexidina a base de yodo o.
- Se practica una incisión de 2 cm ~ verticalmente cerca de la columna vertebral entre el arco costal derecho y el fémur. Utilice un paño quirúrgico estéril alrededor de la incisión. Fijar las superficies de la piel incisas con abrazaderas para mantener la abertura.
Nota: Los retractores pueden utilizarse en lugar de abrazaderas. - A continuación, hacer una segunda incisión (aproximadamente 1 cm) en el peritoneo parietal en virtud de la primera incisión para abrir la cavidad abdominal. Sujetar las superficies abdominales incisas. Clip el tejido graso que rodea el tubo de Falopio y ovario ipsilateral con una abrazadera para eliminar el ovario de la cavidad abdominal. Con cuidado, coloque el ovario y la trompa de Falopio en gasa. A continuación, colocar el vientre del lado del ratón bajo el microscopio de disección.
- Coloque la suspensión de células en una jeringa de insulina (1/2 cc, 29 G) justo antes de la inyección. inyectar cuidadosamente la suspensión celular preparada (1- 2 l) en el ovario. Para varios sec, retener la aguja dentro del ovario para asegurar la gelificación del hidrogel a base de ECM. Después de la gelificación, las células tumorales inyectadas permanecen en el interior del ovario.
- Con cuidado, devolver el ovario en el cuerpo. Suturar la segunda incisión con la seda médica estéril, y luego sellar la piel con grapas para heridas.
- Después de la cirugía, los ratones se administrarán una analgesia (por ejemplo, el meloxicam, intramuscular (im) o subcutánea (sc), 0,2 mg / kg) para el período de 24 hr inicial.
3. El tratamiento post-quirúrgico
- Coloque cada ratón en una jaula separada sobre papel limpio con una compresa caliente para mantener caliente el ratón hasta que se haya recuperado el conocimiento suficiente para mantener decúbito esternal. A continuación, volver a los animales a sus jaulas para la cría y el seguimiento. Monitorear los ratones diariamente durante 3 - 7 días después del tratamiento quirúrgico.
- El seguimiento de los ratones postoperatorio
- En caso de signos de dolor, administrar analgesics diaria (por ejemplo, el meloxicam, im o sc, 0,2 mg / kg).
- Si los ratones tienen signos de infección (por ejemplo, enrojecimiento, hinchazón, secreción), administrar una inyección diaria con un reactivo anti-infeccioso (por ejemplo, la penicilina, im, 100.000 UI / kg).
- Retire los materiales de cierre cutáneo 10 - 14 días después del tratamiento post-quirúrgico.
4. Análisis de tumores y metástasis
NOTA: El tumor se formó en los inyectados ovario de 2 - 3 semanas después de la inoculación.
- Sacrificar los ratones mediante dióxido de carbono, y luego recoger las muestras (por ejemplo, tumores, metástasis, órganos) 13-15 para su posterior análisis 14,16-20.
NOTA: Si un sistema de imágenes in vivo está disponible, las células que llevan enzimas que producen bioluminiscencia (por ejemplo, luciferasa) o la proteína fluorescente (por ejemplo, GFP) se pueden utilizar en este protocolo. Este protocolo modificado proporcionará información útil parala dinámica de la propagación de las células cancerosas del tumor primario.
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Representative Results
Seis ratones desnudos tenían sus ovarios inoculados con la línea celular de carcinoma de células claras humana ES-2, tal como se describe en este protocolo. Como se muestra en la Figura 1A, después de 2 semanas, 5 de los 6 ratones tenían un tumor en el ovario inoculado con ES-2 células, pero no había tumor en el ovario contralateral sin inoculación (utilizado como control). Además, 2 de los 5 ratones mostraron múltiples diseminaciones peritoneales con ascitis. Las células metástasis en el hígado (Figura 1B). Los ovarios, tanto con la masa tumoral en el sitio de la inoculación y en el lado de control, se disecaron, se seccionaron, se tiñeron con hematoxilina-eosina (HE), y se analizaron con un microscopio (Figura 2). Se observó un gran número de células de cáncer de ovario en el ovario inoculado, pero no en el lado contralateral. La morfología de las células era el mismo que el del tumor parental.
"Figura 1" src = "/ files / ftp_upload / 54353 / 54353fig1.jpg" />
Figura 1: El tumor ortotópico La constitución por inoculación con claras humana de carcinoma de células Células ES-2. A y B, el / c nu / nu ratón BALB fueron sometidos a la inoculación con ortotópico ES-2 células. Después de 2 semanas, el ratón fue sacrificado por la necropsia. B, Las células metástasis en el hígado (como se indica por las flechas). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: hematoxilina-eosina de Ovario con ortotópico La inoculación con claras humana de carcinoma de células Células ES-2. A y B, ovario con la inoculación de ES-2 células, se tiñeron con hematoxilina-eosina (HE). tinción similar se observó en comparación con la de carcinoma de células clarasen el ovario humano. C y D, tinción HE del ovario sin inoculación como control. Las barras de escala, 100 micras (A, C), 20 micras (B, D). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Los modelos animales son esenciales para analizar los mecanismos de desarrollo del tumor, progresión, metástasis, y la eficacia del fármaco contra las células cancerosas. Los ratones con células de cáncer de ovario humano también se han utilizado como un modelo animal. A continuación, describimos un procedimiento menos invasivo para la administración de células tumorales de ovario en un sitio ortotópico. Usando este procedimiento, la inoculación en el ovario a través de un enfoque retroperitoneal desde el flanco dorsal ofrece ventajas significativas sobre otras técnicas de uso común. En primer lugar, la inoculación ortotópico puede proporcionar resultados más eficaces y precisos que reflejan el ambiente del tumor en humanos 13,21. En segundo lugar, este enfoque retroperitoneal desde el flanco dorsal sólo necesita una pequeña disección (<1 - 2 cm) por lo que es un procedimiento rápido en comparación con el enfoque peritoneal. Por lo tanto, este enfoque retroperitoneal es menos invasiva para los ratones. En tercer lugar, el ovario de murino es muy pequeña, y por lo tanto no puede aceptar una gran cantidad de reacaballeros. En este procedimiento presentado, utilizamos suspensiones celulares de alta concentración (1 x 10 5 células / l) y un volumen de inoculación bajo (1 - 2 l / inyección) como un solo tiro; por lo tanto, minimiza el daño al ovario. También evita la fuga de las células inoculadas de ovario. Aunque la investigación adicional es esencial, la inoculación ortotópico murino descrito puede ser un enfoque útil para ayudar a desarrollar nuevas terapias para el tratamiento de EOC en el futuro.
Hay dos puntos críticos en este protocolo. En primer lugar, las células se utilizan en la fase de crecimiento logarítmico. En segundo lugar, las células suspendidas con hidrogel a base de ECM se colocan en hielo hasta su uso. Cuando el hidrogel a base de ECM comienza a calentarse, el proceso de gelificación comenzará. Para evitar la gelificación del hidrogel a base de ECM, las células se resuspendieron con el hidrogel y los instrumentos (por ejemplo, tubos, jeringas, y agujas) a base de ECM se mantienen en hielo hasta su uso. Hay una limitación de esta técnica.El volumen de inyección de la suspensión de células es inferior a 3 l, debido a que el ovario de ratón no puede aceptar un gran volumen de inóculo.
Este protocolo puede ser modificado en algunos puntos. Si un sistema de formación de imágenes in vivo está disponible, las células que llevan enzimas que producen bioluminiscencia (por ejemplo, luciferasa) o la proteína fluorescente (por ejemplo, GFP) se puede utilizar en este protocolo. Este protocolo modificado proporcionará información útil para las dinámicas de la propagación de las células cancerosas del tumor primario. Además, este protocolo utiliza ES-2 células para la inoculación con el ovario de ratón. ES-2 células se derivan de carcinoma de células claras, y esta línea celular exhibe un crecimiento agresivo en ratones desnudos. Otras líneas celulares (por ejemplo, carcinoma seroso) también se puede utilizar este protocolo en lugar de ES-2 células.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Los autores agradecen a los miembros del Departamento de Obstetricia y Ginecología y Biología del Cáncer por sus útiles discusiones y asistencia técnica. Este estudio fue apoyado por una Sociedad Japonesa para la Promoción de la Ciencia (JSP) subvención-en-Ayudas a la Investigación Científica (15K15604; H. Kajiyama).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Matrigel matrix | BD | 354234 | ECM-based hydrogel |
| Insulin syringe | TERUMO | SS-05M2913 | 1/2 cc, 29 G x 1/2" |
| Suturing needle with suture | 11 mm, 3/8, Nylon6-0 | ||
| Reflex 7 mm Wound Clip Applier | CellPoint Scientific | 204-1000 | |
| Reflex 7 mm wound clips | CellPoint Scientific | 203-1000 |
References
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