Summary
난소 암의 복막 보급의 다단계 과정을 명확히하기 위해, 본 연구는 이러한 종양 세포와 동 소성 접종을 통해 원래의 종양 개발 및 복막 전이의 쥐 실험 모델을 제시한다.
Abstract
이 복막 보급을 보여주기 때문에 상피 난소 암 (EOC)는 불량한 예후와 연관되어있다. 예후를 개선하기 위해, 복막 보급을 제어하는 것이 중요하다. 종양 세포는 일차 병소에서 분리 및 부착 방법 mesothelium 그러나, 여전히 불분명하다. 적절한 동물 모델의 확립은 생체 내에서 복막 보급의 메커니즘을 이해하기 위해 필요하다. 현재의 연구는 복막과 원격 장기 포함한 전이 현상에 쥐 난소 표면에 EOC 세포의 국소 주입의 과정을 소개한다. 나이 8 주째 암컷 누드 마우스 (BALB / C 뉴 / 민)를 사용 하였다. 보기의 현미경 분야에서 EOC 세포 지느러미 측면에서 후 복막 접근 방식을 통해 쥐의 난소에 주입했다 (중간 세포 외 기질 (ECM)의 1 × 10 5 세포 / μL은 하이드로 겔 / 일방적 인 난소 / 마우스 기반). 이 제안 된 방법은 르입니다마우스에 대한 SS 침략 절차 및 난소의 손상을 최소화 할 수 있습니다. 여기서는 EOC 원래 전이성 종양 형성의 개발 방법 론적 단계를 설명한다.
Introduction
상피 난소 암 (EOC)는 부인과 악성 종양 1 중 암 관련 사망의 가장 높은 비율을 차지. EOC는 주로 인해 늦게 증상으로, 예후와 연관되어, 종종 여러 복강 내 disseminations 및 원격 전이 2-4와 연결되어 있습니다. 복막 전파는 다단계 프로세스이다. 우선, 종양 세포는 일차 병소에서 분리 및 복강 내로 이동한다. 종양 세포가 복강 mesothelium에 부착되면, 그들은 mesothelium 5,6- 통해 조직을 침범하기 시작한다. 더 나은 종양 생물학 (예를 들어, 암의 진행 및 치료 반응)을 이해하기 위해서는, 마우스 모델은 풍부한 정보를 제공합니다. 인간 암세포와 이종 널리 인간 암세포를 복강 내, 정맥 내 및 동소 피하 접종 된 마우스 모델을 사용한다. 동소의 g를 가진 동물 모델뗏목 종양보다 효율적이고 정확하게 heterotopically 그래프트 종양 동물 모델에 비해 인간 종양 환경을 반영하는 결과를 생성 할 수있다. 따라서, 많은 인간의 종양, 동 소성 이식 모델은 7-11 설립되었습니다.
여기, 우리는 복부 접종에 비해 침입이 제한 지느러미 측면에서 복막 접근을 통해 인간의 EOC 세포의 동 소성 접종에 대해 설명합니다. 이 기술은 EOC에 유용한 정보, 복강 보급 특히기구의 다양한 기능을 제공 할 수있다.
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Protocol
치료 프로토콜은 나고야 대학에 의해 채택 된 동물 실험에 대한 가이드 라인을 따른다.
세포 현탁액 1. 준비
- 인간의 난소 투명 세포 암 세포주.
- (100 단위 / ㎖, 스트렙토 마이신 0.1 ㎎ / ㎖ 페니실린) 10 % 소 태아 혈청 (FBS) 및 페니실린 / 스트렙토 마이신을 가진 RPMI-1640 배지에서 ES-2 셀 (12)을 유지한다. 5 % CO 2 가습 인큐베이터에서 37 ° C에서 배양 세포.
- 0.05 %의 트립신 / 0.02 %의 EDTA 용액 (트립신 / EDTA)를 대수 증식기의 세포를 수집한다.
- (- 25cm 2 당 4 ml의 2 + 칼슘 / 마그네슘없이 PBS 3) 먼저, 다음 PBS로 한 번 세포를 씻어, 세포 배양 용기에서 이전 용지를 제거합니다.
- 다음으로, 25cm 트립신 / EDTA 2 당 1 ml에 추가 할 수 있습니다. 트립신 / EDTA로 세포 단층을 포함하는 세포 배양 용기를 돌린다. 제거하고 트립신 / EDTA를 폐기 한 후, 세포를 반환3 인큐베이터에 배양 용기 - 세포 5 분 또는 때까지이 분리된다.
- 현미경으로 세포를 검사하는 세포는 세포 배양 용기 및 부동의 표면으로부터 분리되도록한다.
- 트립신 (25cm이 당 5 ㎖)를 불 활성화하고, 세포를 다시 일시 성장 배지를 함유하는 신선한 혈청에 추가. 15 ML 원뿔 관에 다시 정지 세포를 전송합니다.
- 5 분 동안 300 XG에 원심 분리기. 4 °의 C 또는 실온에서 원심 분리를 수행합니다. 조심스럽게 상층 액을 제거하고 (25cm 2 당 5 ㎖) 성장 매체와 세포를 일시 중지 다시.
- (트리 판 블루 배제에 의해 예) 세포를 계산 한 다음 2 × 108 세포 / ㎖의 밀도로 성장 배지에 재현 탁. 얼음에 일시 중단 된 세포를 넣습니다.
- 해동 냉동 세포 외 기질 (ECM)의 빙욕에서 하이드로 겔 분취 기반.
- 1 (최종 셀 (C) : 1의 비율로 ECM 계 하이드로 겔 분취 량의 세포 현탁액을 추가oncentration : 1 × 10 5 세포 / 중간 ECM 기반의 하이드로 겔의 μL)하고 철저하게 섞는다. 사용할 때까지 얼음 용기에 제조 된 세포 현탁액을 놓습니다.
세포 현탁액 2. 동소 이식 접종
참고 : 전용 제품군을 필요로하지 않는다 수술. 수술 별도 최소 활성을 갖는 실내 영역에서 실험실 벤치 탑상에서 수행 될 수있다. 층류 후드도 사용될 수있다. 무균 수술 도구가 사용되어야하며 가위는 피부 절개를 만들기 위해 사용할 수 없습니다.
- 이 소성을 접종 모델에 대한 연령 8 주에서 여성 누드 마우스 (BALB / C 뉴 / 뉴)를 사용합니다.
- (- 4 %, 2) 우선, 흡입 이소 플루 란을 이용하여 마우스를 마취. 회사 발가락 핀치에 따라 철수의 부족을 확인하여 마취 깊이를 확인합니다. 마우스를 마취 한 후, 필요에 따라 건조 방지하기 위해 눈에 개성 멸균 안과 연고를 적용합니다.
- 조작하기에 마취 마우스를 놓습니다아래 단계의 배 쪽을 보내고. 외과 영역을 알코올과 요오드 계 또는 클로르헥시딘 기반 스크럽 모두 여러 번 소독.
- 수직으로 오른쪽 늑골 아치와 대퇴골과 척추 근처 ~ 2 cm의 절개를합니다. 절개 부위 주변의 무균 수술 드레이프를 사용합니다. 개방을 유지하기 위해 클램프와 절개 피부 표면을 수정합니다.
주 : 견인기 대신 클램프 사용될 수있다. - 다음으로, 복강을 열고 첫 번째 절개에서 정수리 복막에서 두 번째 절개 (약 1cm)를 확인합니다. 절개 복부 표면을 클램프. 복강에서 난소를 제거하는 클램프 동측 난소 및 나팔관 주위의 지방 조직을 클립. 조심스럽게 거즈에 난소 및 나팔관을 배치합니다. 그 후, 해부 현미경으로 마우스의 배 쪽을 아래로 놓습니다.
- 바로 주입하기 전에 (1/2 CC, 29 G) 인슐린 주사기의 세포 현탁액을 놓습니다. 조심스럽게 준비된 세포 현탁액을 (주사 1- 난소에 2 μL). 몇 초를 들어, ECM 계 하이드로 겔의 겔화를 위해 난소 내 바늘을 보유한다. 겔화 후, 주입 된 종양 세포는 난소 안에 남아있다.
- 조심스럽게 몸에 난소를 돌려줍니다. 멸균 의료 실크와 두 번째 절개를 봉합하고 상처 클립으로 피부를 밀봉.
- 수술 후 생쥐의 초기 24 시간의 기간 동안 진통제 (예를 들어, 멜 록시 캄, 근육 내 (IM) 또는 피하 (SC), 0.2 ㎎ / ㎏)을 투여한다.
3. 후 수술 치료
- 이 흉골 드러 누움을 유지하기 위해 충분한 의식을 회복 할 때까지 마우스를 따뜻하게 유지하기 위해 뜨거운 팩을 깨끗한 종이에 별도의 장에 각 마우스를 놓습니다. 그런 다음, 양육 및 모니터링을 위해 자신의 새장에 동물을 반환합니다. 수술 적 치료 다음 칠일 - 3 매일 쥐를 모니터링합니다.
- 수술 후 마우스의 모니터링
- 고통의 흔적의 경우, analge 관리SICS 매일 (예를 들어, 멜 록시 캄, 메신저 또는 SC / kg, 0.2 mg)을 얻었다.
- 마우스 감염 (예를 들어, 발적, 부종, 방전)의 흔적이있는 경우, 항 감염 시약 (예, 페니실린, 메신저, 100,000 IU / kg)을 매일 주사를 관리 할 수 있습니다.
- 수술 치료 후 14 일 - 피부 폐쇄 재료 (10)를 제거합니다.
종양과 전이 4. 분석
주 : 종양이 주입 된 난소이 형성됩니다 - 접종 후 삼주.
- 이산화탄소에 의한 쥐를 희생하고 추가 분석을 14,16-20에 대한 샘플 (예를 들어, 종양, 전이, 기관) 13-15를 수집합니다.
주 : 생체 내 이미징 시스템이 제공되는 경우, 생물 발광 (예 : 루시 페라 제) 또는 형광 단백질 (예 : GFP)를 생성하는 효소 담 셀이 프로토콜에서 사용될 수있다. 이 수정 된 프로토콜에 대한 유용한 정보를 제공 할 것입니다일차 종양 암 세포의 확산의 역학.
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Representative Results
여섯 누드 마우스는이 프로토콜에 기재된 바와 같이 난소가 인간 투명 세포 암종 세포주 ES-2로 접종했다. 도 1a에 도시 된 바와 같이, 1 주 후 6 마우스의 5 ES-2 세포에 접종 난소 종양을 가졌으나 (대조군으로서 사용됨) 접종하지 않고 반대측 난소에는 종양이 없었다. 또한, 5 쥐의 2 복수 여러 복막 disseminations을 보였다. 세포는 간 (그림 1B)로 전이. 난소 접종 부위와 제어 측의 종양 질량 둘 해부 단면, 헤 마톡 실린 - 에오신 (HE)으로 염색하고, 현미경 (도 2)에 따라 분석 하였다. 난소 암 세포의 다수가 아닌 반대편에서 접종 난소에서 관찰되었다. 셀 형태는 부모의 종양과 동일하다.
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그림 1 : 인간 투명 세포 암 세포의 ES-2 소성을 접종하여 종양 형성. A와 B는 BALB / C 뉴 / 뉴 마우스 ES-2 세포에 접종 동 소성을 시행 하였다. 이주 후, 마우스를 희생 부검 하였다. (화살표로 표시됨) B, 셀 간으로 전이. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2 : 인간 투명 세포 암 세포의 ES-2 소성을 접종과 난소의 염색을 헤 마톡 실린이 - 에오신. A와 B, ES-2 세포의 접종과 난소, 헤 마톡 실린 - 에오신 (HE) 염색. 유사 염색 투명 세포 암종에 비해 보였다인간의 난소한다. C와 D는 HE는 제어로 접종하지 않고 난소의 염색. 스케일 바, 100 μm의 (A, C), 20 μm의 (B, D). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
동물 모델은 암 세포에 대해 종양 발달 진행, 전이, 약물 효능의 기전을 분석하기 위해 필수적이다. 인간 난소 암 세포를 담지 마우스는 동물 모델로서 사용되어왔다. 여기서, 우리는 동소 사이트 난소 종양 세포의 투여에 덜 침습적 인 과정을 설명한다. 지느러미 측면에서 후 복막 접근 방식을 통해 난소에이 절차 접종을 사용하면 일반적으로 사용되는 다른 기술에 비해 상당한 이점을 제공한다. 우선, 소성을 접종 인간의 종양 13,21 환경을 반영보다 효율적이고 정확한 결과를 제공 할 수있다. 둘째, 지느러미 측면에서이 복막 접근법은 단지 작은 절개가 필요 (<1-2cm를) 그래서 복막 접근 방식에 비해 빠른 절차입니다. 따라서,이 후 복막 접근 방식은 마우스에 대해 덜 침습적입니다. 셋째, 뮤린 난소 REA 많은 양을 받아 매우 작고, 따라서없는남자용 화장실. 이 발표 과정에서, 우리는 고농도 세포 현탁액 (1 × 10 5 세포 / μL) 및 낮은 접종 볼륨 사용 - 하나의 샷으로 (1 2 μL / 주입) 따라서 난소의 손상을 최소화한다. 또한 난소 식균 세포의 누설을 방지한다. 추가 연구가 필수적이지만, 설명 된 뮤린 동소 접종 앞으로 EOC의 치료를위한 새로운 치료제를 개발할 수 있도록하는 유용한 방법이 될 수있다.
이 프로토콜에서 두 가지 중요한 포인트가 있습니다. 우선, 세포가 대수 성장기에 사용된다. 둘째, ECM 계 하이드로 겔에 현탁 세포를 사용할 때까지 얼음 상에 배치된다. 전자 재료 계 하이드로 겔 가온 시작하면 겔화 처리를 시작한다. 전자 재료 기반의 하이드로 겔의 겔화를 방지하기 위해, 세포가 ECM 기반의 하이드로 겔 및 기기 (예를 들면, 튜브, 주사기, 바늘)으로 재현 탁은 사용할 때까지 얼음에 보관됩니다. 이 기술의 한 가지 제한이 있습니다.마우스 난소 접종 대용량을 수용 할 수 없기 때문에 세포 현탁액의 주입 부피 미만 3 μL이다.
이 프로토콜은 어떤 점에서 수정 될 수있다. 생체 내 이미징 장치를 사용할 경우, 세포는 생물 발광 (예 : 루시 페라 제) 또는 형광 단백질 (예 : GFP)이 프로토콜에 사용될 수를 제조하는 효소 담. 이 수정 된 프로토콜은 일차 종양 암 세포의 확산의 역학에 대한 유용한 정보를 제공 할 것이다. 또한,이 프로토콜은 마우스 난소 접종에 대한 ES-2 세포를 사용합니다. ES-2 세포는 투명 세포 암종으로부터 유래되고,이 세포주는 누드 마우스에서 공격적인 성장을 나타낸다. 다른 세포주 (예, 장 액성 암종)는 또한 ES-2 세포 대신이 프로토콜을 사용할 수있다.
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Disclosures
저자는 공개 아무것도 없어.
Acknowledgments
저자는 도움이 토론 및 기술 지원에 대한 산부인과의 부서의 구성원과 암 생물학 감사합니다. 이 연구는 과학의 진흥 (JSPS)에 대한 일본 사회에 의해 지원되었다 그랜트 -에 - 보조 과학 연구 (15K15604, H. Kajiyama에).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Matrigel matrix | BD | 354234 | ECM-based hydrogel |
| Insulin syringe | TERUMO | SS-05M2913 | 1/2 cc, 29 G x 1/2" |
| Suturing needle with suture | 11 mm, 3/8, Nylon6-0 | ||
| Reflex 7 mm Wound Clip Applier | CellPoint Scientific | 204-1000 | |
| Reflex 7 mm wound clips | CellPoint Scientific | 203-1000 |
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