Summary
over kanseri periton yayılması çok adımlı süreci açıklamak için, mevcut çalışma bu tümör hücreleri ile ortotopik aşılamadan yoluyla orijinal tümör gelişimi ve periton metastazı bir fare deneysel modeli sunar.
Abstract
o periton yayılmasını gösterir çünkü Epitelyal over kanseri (EOC) kötü prognoz ile ilişkilidir. prognozu iyileştirmek için, periton yayılmasını kontrol etmek önemlidir. Tümör hücreleri primer lezyonlardan ayırmak ve mesothelium eklemek nasıl Ancak, hala belirsizdir. Uygun bir hayvan modelinin kurulması in vivo periton yayılım mekanizmasının bir anlayış kazanmak için gereklidir. Bu çalışmada, biz periton ve uzak organlara da dahil olmak üzere metastaz gelişimine fare yumurtalık yüzeyine EOC hücrelerinin lokal enjeksiyon işlemi tanıtmak. yaş 8 haftalık dişi çıplak fareler (BALB / c nu / nu) kullanılmıştır. Bir görüş mikroskobik alan altında, EOC hücreleri dorsal zayıf bir retroperitoneal yaklaşımla fare yumurtalıkların enjekte edildi (orta-ekstrasellüler matriks (ECM) 1 x 10 5 hücre / ul hidrojel / tek taraflı yumurtalık / fare tabanlı). Önerilen bu yöntem le olanfare için ss invaziv prosedür ve yumurtalık zarar en aza indirir. Burada, EOC özgün ve metastatik tümör oluşumu gelişiminde metodolojik adımları açıklar.
Introduction
Epitelyal over kanseri (EOC) jinekolojik maligniteler 1 arasında kansere bağlı ölüm oranı en yüksek oluşturmaktadır. EOC öncelikle nedeniyle geç semptomatoloji, kötü prognoz ile ilişkilidir ve genellikle birden çok intraperitoneal saçınımlı ve uzak metastaz 2-4 ile ilişkilidir. Periton yaygınlaştırma çok adımlı bir işlemdir. İlk olarak, tümör hücrelerinin birincil lezyonlarla ayırmak ve karın boşluğuna göç ederler. Tümör hücrelerinin periton mesothelium eklemek, onlar Mesothelium 5,6 ile dokuları işgal etmeye başlar. Daha iyi tümör biyolojisi (örneğin, kanser ilerleme ve terapötik yanıt) anlamak için, fare modelleri bilgi hazinesi sağlar. İnsan kanser hücreleri bir ksenograft yaygın insan kanser hücreleri, intraperitonal, intravenöz ve ortotopikal, deri altından aşılanır olan fare modellerinde kullanılmaktadır. Bir orthotopically g bir hayvan modelirafted tümör daha verimli ve doğru bir şekilde heterotopically aşılanmış tümörlü bir hayvan modeli ile karşılaştırıldığında insanlarda tümör ortamı yansıtan sonuçlar üretebilir. Bu nedenle, birçok insan tümörleri için, ortotopik transplantasyon modelleri 7-11 kurulmuştur.
Burada, ventral aşılamadan oranla invazivliğini sınırlı dorsal kanadını, bir retroperitoneal yaklaşımla insan EOC hücrelerinin ortotopik aşılama açıklar. Bu teknik EOC yararlı bilgiler, periton yayılması özellikle mekanizmasının çeşitli sağlayabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tedavi protokolü Nagoya Üniversitesi tarafından kabul edilen hayvan deney için kuralları takip eder.
Hücre süspansiyonları hazırlanması 1.
- İnsan yumurtalık berrak hücreli karsinoma hücre hattı.
- (100 birim / ml streptomisin: 0.1 mg / ml penisilin),% 10 fetal sığır serumu (FBS) ve penisilin / streptomisin ile RPMI-1640 ortamı içinde ES-2 hücreleri 12 koruyun. % 5 CO2 nemlendirilmiş inkübatör içinde 37 ° C 'de kültür hücreleri.
- % 0.05 tripsin /% 0.02 EDTA çözeltisi (tripsin / EDTA) logaritmik büyüme fazında hücreler toplanır.
- (- 25 cm 2 başına 4 ml, 2 + Ca 2 + / Mg olmadan PBS 3), sonra bir kez PBS ile yıkama hücreleri, hücre kültürü geminin eski ortamı çıkarın.
- Daha sonra, 25 cm tripsin / EDTA 2 'ye 1 ml. tripsin / EDTA ile hücre mono tabakasının karşılamak için hücre kültür kabı döndürerek. kaldırma ve tripsin / EDTA atıldıktan sonra, hücre dönüş3 inkübatör kültür gemi - hücreleri 5 dakika kadar veya ayrılır.
- Bir mikroskop altında hücreleri incelemek hücreler, hücre kültürü damar ve yüzen yüzeyinden ayrılır sağlamak.
- Tripsin (25 cm2 başına 5 mi) inaktive ve hücrelerin yeniden askıya almak için büyüme ortamı içeren taze serum ekleyin. 15 ml konik tüp yeniden askıya hücreleri aktarın.
- 5 dakika boyunca 300 x g'de santrifüjleyin. 4 ° C'de ya da oda sıcaklığında santrifüjleme ya da gerçekleştirir. Dikkatle süpernatant kaldırmak ve (25 cm 2 başına 5 ml) büyüme ortamı ile hücreleri askıya yeniden.
- (Tripan mavi eksklüzyonu ile, örneğin,) hücre sayımı, daha sonra 2 x 10 8 hücre / ml bir yoğunlukta büyüme ortamında yeniden askıya. buz üzerinde asılı hücreleri koyun.
- Çözülme dondurulmuş hücre dışı matris (ECM) bir buz banyosu içinde hidrojel alikotları tabanlı.
- 1 (nihai hücre c: 1 bir oranda ECM bazlı hidrojel alikotları hücre süspansiyonu ekleyinbağlı yoğunlaşma: 1 x 10 5 hücre / orta-ECM tabanlı hidrojel ul) ve iyice karıştırın. kullanılana kadar bir buz banyosu içinde hazırlanan hücre süspansiyonları yerleştirin.
Hücre süspansiyonları, 2. Ortotopik aşılama
NOT: özel bir paketi gerektirmez Cerrahi. Cerrahi ayrı ve en az aktiviteye sahip odasının bir bölgesinde bir laboratuar sıra üzerine gerçekleştirilebilir. Bir laminar kapağı da kullanılabilir. Steril cerrahi aletler kullanılmalıdır ve makas cilt kesi yapmak için kullanılmamalıdır.
- Bu ortotopik aşılama modeli için yaş 8 haftalık dişi çıplak farelerin (BALB / c nu / nu) kullanın.
- (-% 4 2) İlk olarak, izofluran ile inhalasyon kullanarak fare uyutmak. Firma ayak tutam üzerine çekilmesi eksikliği doğrulayarak anestezi derinliğini kontrol edin. Fare uyuşturulduktan sonra, gerekli kurumasını önlemek için gözlere bir mülayim steril oftalmik merhem uygulayın.
- Bir operat üzerinde anestezi fare yerleştirinaşağı sahne göbek tarafı ing. Cerrahi parkı alkol ve iyot bazlı veya klorheksidin bazlı fırçalayın hem birkaç kez dezenfekte edin.
- dikey sağ kaburga kemer ve femur arasında omurga yakınında ~ 2 cm kesi olun. insizyon bölgesinde yaklaşık steril bir cerrahi örtü kullanın. açılış korumak için kelepçeler ile kazıma cilt yüzeyleri düzeltmek.
Not: Retraktörler yerine kelepçeler de kullanılabilir. - Sonraki, karın boşluğu açmak için ilk kesi altında parietal periton ikinci bir kesi (yaklaşık 1 cm) yapmak. çizi karın yüzeyleri kelepçe. Karın boşluğunda yumurtalık kaldırmak için bir kelepçe ile ipsilateral yumurtalık ve fallop tüpü çevreleyen yağ dokusu klibi. Dikkatle gazlı bez yumurtalık ve fallop tüpü yerleştirin. Sonra, mikroskop altında fare göbek tarafı aşağıya bakacak şekilde yerleştirin.
- hemen enjeksiyon öncesi (1/2 cc 29 G) bir insülin şırınga hücre süspansiyonu yerleştirin. Özenle hazırlanmış hücre süspansiyonu (enjekte 1- Yumurtalık içine 2 ul). Birkaç saniye için ECM bazlı hidrojel jelleşmesini sağlamak için yumurtalık içinde iğnesinin tespit edilmesi. jelleşme sonra, enjekte edilen tümör hücreleri, yumurtalığın içinde kalır.
- Dikkatle vücuda yumurtalık döner. steril tıbbi ipek ile ikinci kesi dikin ve sonra yara klipleri ile cilt mühür.
- Cerrahiden sonra, farenin, ilk 24 saatlik bir süre için bir analjezik (örn, meloksikam, kas içinden (İM) ya da deri altından (sc), 0.2 mg / kg) uygulanır.
3. Post-cerrahi tedavisi
- sternal yatma korumak için yeterli bilinci yerine kadar fare sıcak tutmak için sıcak bir paketi ile temiz kağıt üzerinde ayrı bir kafes içinde her fare yerleştirin. Sonra, yetiştirilmesi ve izlenmesi için kafeslerine hayvanları dönün. Cerrahi tedavi sonrası 7 gün - 3 günlük fareler izleyin.
- Ameliyat sonrası farelerin izlenmesi
- ağrı belirtileri durumunda, analge idareSICS günlük olarak (örneğin, meloksikam, İM, veya SC, 0.2 mg / kg).
- Fareler enfeksiyon (örneğin, kızarıklık, şişlik, akıntı) belirtileri varsa, bir anti-enfektif reaktif (örn, penisilin, im, 100.000 IU / kg) ile günlük enjeksiyon yönetmek.
- ameliyat sonrası tedavi sonrası 14 gün - cilt kapatma malzemelerdir 10 çıkarın.
Tümörlerin ve Metastazlarının 4. Analizi
NOT: Tümör enjekte over 2 oluşacaktır - aşılamadan sonra 3 hafta.
- Karbon dioksit fareler kurban, ve daha sonra analiz için numune 14,16-20 (örneğin, tümörler, metastazlar, organları) 13-15 toplar.
Not: bir in vivo görüntüleme sistemi, mevcut ise ışıldaması (örneğin, lusiferaz) ya da floresan proteini (örneğin GFP) üretimi enzimler taşıyan hücrelerin Bu protokol kullanılabilir. Bu modifiye protokol için yararlı bilgiler sağlayacaktırprimer tümörden kanser hücrelerinin yayılmasını dinamiği.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Altı çıplak fareler bu protokol açıklandığı gibi onların yumurtalıklar, insan berrak hücreli karsinom hücre hattı ES-2 ile aşılanmış vardı. Şekil 1A'da gösterildiği gibi, 2 hafta sonra, 6 farelerinin 5 ES-2 hücreleri ile aşılandı yumurtalık tümör vardı, ama (bir kontrol olarak kullanılmıştır) aşılaması olmayan karşı yumurtalık tümör yoktu. Bunun yanında, 5 farelerin 2 asit ile birden periton disseminations göstermiştir. Hücreler karaciğer (Şekil 1B) metastaz. Yumurtalıklar, inokülasyon yerinde kontrol tarafında tümör kitlesi, her ikisi de, parçalara kesit, hematoksilin-eosin (HE) ile boyanmış ve mikroskopla (Şekil 2) altında analiz edildi. yumurtalık kanseri hücrelerinin çok sayıda, ancak karşı tarafta, inoküle edilmiş yumurtalık gözlenmiştir. hücre morfolojisi, ebeveyn tümör ile aynıdır.
"Şekil 1" src = "/ files / ftp_upload / 54353 / 54353fig1.jpg" />
Şekil 1: İnsan Berrak Hücreli Karsinomu Hücreler ES-2 ile Ortotopik Aşılama Yoluyla Tümör oluşumu. A ve B, BALB / c nu / nu fare ES-2 hücreleri ile ortotopik aşılama yapıldı. 2 hafta sonra, fare nekropsi için kurban edildi. (Oklarla gösterildiği gibi) b Hücreler karaciğer metastaz. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 2: İnsan Berrak Hücreli Karsinomu Hücreler ES-2 ile Ortotopik Aşılama ile Overin boyanması Hematoksilen-eozin. A ve B, ES-2 hücrelerinin inokülasyonu ile yumurtalık, hematoksilin-eosin (HE) ile boyanmıştır. Benzer boyama berrak hücreli karsinom kıyasla görülmüştürinsan yumurtalık. C ve D, bir kontrol olarak aşılaması olmayan yumurtalık lekelenmesi. Ölçek çubukları, 100 um (A, C), 20 um (B, D). Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hayvan modelleri, kanser hücrelerine karşı tümör gelişimi, ilerlemesi, metastaz ve ilaç etkinliğinin mekanizmalarını analiz için esastır. insan yumurtalık kanseri hücreleri olan farelere, aynı zamanda bir hayvan modeli olarak kullanılmıştır. Burada, ortotopik yerinde yumurtalık tümörü hücre uygulama için daha az invaziv bir prosedür açıklanmaktadır. dorsal zayıf bir retroperitoneal yaklaşımla yumurtalık içine bu prosedür, aşılama kullanan diğer sık kullanılan tekniklere göre önemli avantajlar sunmaktadır. Birincisi, kadavradan aşılama insanlarda 13,21, ABD Doları tümör ortamı yansıtan daha verimli ve doğru sonuçlar sağlayabilir. İkincisi, dorsal zayıf bu retroperitoneal yaklaşım sadece küçük bir diseksiyon ihtiyacı (<1 - 2 cm) bu yüzden periton yaklaşıma göre hızlı bir işlemdir. Bu nedenle, bu retroperitoneal yaklaşım fareler için daha az invaziv. Üçüncü olarak, fare yumurtalık rea büyük miktarda kabul etmek çok küçük ve böylece değiştiremiyorbeyler. Bu sunulan prosedürde, biz son derece konsantre hücre süspansiyonları (1 x 10 5 hücre / ul) ve düşük aşılama hacmi kullanmak - tek bir atış olarak (1 2 ul / enjeksiyon); Bu nedenle, yumurtalık zararı en aza indirir. Ayrıca yumurtalıktan aşılanmış hücre sızmasını önler. daha fazla araştırma gerekli olmasına rağmen, tanımlanan kemirgen ortotopik aşılama gelecekte EOC tedavisi için yeni tedavilerin geliştirilmesine yardımcı yararlı bir yaklaşım olabilir.
Bu protokolde iki kritik nokta vardır. İlk olarak, hücreler, logaritmik büyüme fazında kullanılır. İkinci olarak, ECM bazlı hidrojel süspansiyon hücreler kullanıma kadar buz üzerine yerleştirilir. ECM-tabanlı hidrojel ısınmaya başladığında, jelleşme işlemi başlayacaktır. ECM bazlı hidrojel jelleşmesinden kaçınmak için hücreler ECM bazlı hidrojel ve aletleri (örneğin, tüpler, şırıngalar, iğneler) ile yeniden süspanse kullanılana kadar buz üzerinde muhafaza edilir. Bu tekniğin bir sınırlama yoktur.Fare yumurtalık inokulum büyük bir ses kabul edemez, çünkü hücre süspansiyonu enjeksiyon hacmi az 3 ul.
Bu protokol, bazı noktalarda değiştirilebilir. In vivo görüntüleme sistemi mevcut ise, hücreler ışıldaması (ör lusiferaz) ya da floresan proteini (örneğin, GFP) Bu protokol kullanılabilir üreten enzimler açısı. Bu modifiye protokol primer tümörden, kanser hücrelerinin yayılmasını dinamikleri açısından yararlı bilgiler sağlayacaktır. Ayrıca, bu protokol fare yumurtalık ile aşılama için ES-2 hücreleri kullanır. ES-2 hücreleri, berrak hücreli karsinom elde edilir ve bu da hücre hattı farede agresif bir büyüme gösterir. Diğer hücre çizgileri (örneğin, seröz karsinom), aynı zamanda ES-2 hücrelerinin yerine, bu protokol kullanılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.
Acknowledgments
Yazarlar yararlı tartışmalar ve teknik yardım için Kadın Hastalıkları ve Doğum Anabilim Dalı üyeleri ve Kanser Biyoloji teşekkür ederiz. Bu çalışma Bilim Teşvik (JSPS) için Japan Society tarafından desteklenen Hibe-in-Aid Bilimsel Araştırma (15K15604 H. Kajiyama için).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Matrigel matrix | BD | 354234 | ECM-based hydrogel |
| Insulin syringe | TERUMO | SS-05M2913 | 1/2 cc, 29 G x 1/2" |
| Suturing needle with suture | 11 mm, 3/8, Nylon6-0 | ||
| Reflex 7 mm Wound Clip Applier | CellPoint Scientific | 204-1000 | |
| Reflex 7 mm wound clips | CellPoint Scientific | 203-1000 |
References
- Jemal, A., et al.
- Kajiyama, H., et al. Long-term clinical outcome of patients with recurrent epithelial ovarian carcinoma: is it the same for each histological type. Int J Gynecol Cancer. 22 (3), 394-399 (2012).
- Kikkawa, F., et al. Advances in treatment of epithelial ovarian cancer. Nagoya J Med Sci. 68 (1-2), 19-26 (2006).
- Yoshikawa, N., et al. Clinicopathologic features of epithelial ovarian carcinoma in younger vs. older patients: analysis in Japanese women. J Gynecol Oncol. 25 (2), 118-123 (2014).
- Kajiyama, H., et al. Involvement of SDF-1alpha/CXCR4 axis in the enhanced peritoneal metastasis of epithelial ovarian carcinoma. Int J Cancer. 122 (1), 91-99 (2008).
- Terauchi, M., et al. Possible involvement of TWIST in enhanced peritoneal metastasis of epithelial ovarian carcinoma. Clin Exp Metastasis. 24 (5), 329-339 (2007).
- Bronstein, L., Zechner, C., Koeppl, H. Bayesian inference of reaction kinetics from single-cell recordings across a heterogeneous cell population. Methods. 85, 22-35 (2015).
- Guo, W., Zhang, S., Liu, S. Establishment of a novel orthotopic model of breast cancer metastasis to the lung. Oncol Rep. 33 (6), 2992-2998 (2015).
- Lewis-Tuffin, L. J., et al. Src family kinases differentially influence glioma growth and motility. Mol Oncol. , (2015).
- Saar, M., et al. Orthotopic tumorgrafts in nude mice: A new method to study human prostate cancer. Prostate. 75 (14), 1526-1537 (2015).
- Zou, Y., et al. miR-29c suppresses pancreatic cancer liver metastasis in an orthotopic implantation model in nude mice and affects survival in pancreatic cancer patients. Carcinogenesis. 36 (6), 676-684 (2015).
- Lau, D. H., Lewis, A. D., Ehsan, M. N., Sikic, B. I. Multifactorial mechanisms associated with broad cross-resistance of ovarian carcinoma cells selected by cyanomorpholino doxorubicin. Cancer Res. 51 (19), 5181-5187 (1991).
- Bao, L., Matsumura, Y., Baban, D., Sun, Y., Tarin, D. Effects of inoculation site and Matrigel on growth and metastasis of human breast cancer cells. Br J Cancer. 70 (2), 228-232 (1994).
- Huang, M. J., et al. Epidemiological investigation on major depressive disorder in the most heavily damaged areas from Wenchuan earthquake in 2008. Zhonghua Liu Xing Bing Xue Za Zhi. 31 (2), 167-170 (2010).
- Ma, L., et al. Mortality of neonatal respiratory failure related to socioeconomic factors in Hebei province of China. Neonatology. 100 (1), 14-22 (2011).
- Lin, Z., et al. Serum levels of FGF-21 are increased in coronary heart disease patients and are independently associated with adverse lipid profile. PLoS One. 5 (12), e15534 (2010).
- Liu, B., et al. Lumbar interspinous non-fusion techniques: comparison between Coflex and Wallis. Nan Fang Yi Ke Da Xue Xue Bao. 30 (11), 2455-2458 (2010).
- Zhang, Y., et al. Wave intensity analysis of carotid artery: a noninvasive technique for assessing hemodynamic changes of hyperthyroid patients. J Huazhong Univ Sci Technolog Med Sci. 30 (5), 672-677 (2010).
- Song, G. S., et al. Comparative transcriptional profiling and preliminary study on heterosis mechanism of super-hybrid rice. Mol Plant. 3 (6), 1012-1025 (2010).
- Wan, L., et al. The analysis of variation of Han female adolescent bone development in Henan and Zhejiang province. Fa Yi Xue Za Zhi. 26 (2), 97-99 (2010).
- Wang, H. B., et al. Excitation-emission fluorescence characterization study of the three phenolic compounds. Guang Pu Xue Yu Guang Pu Fen Xi. 30 (5), 1271-1274 (2010).
