Summary
כדי להבהיר את תהליך רב שלבי של הפצת הצפק של קרצינומה השחלות, המחקר הנוכחי מציג מודל ניסיוני בעכברים של התפתחות גידולים המקורי וגרורות הצפק באמצעות חיסון orthotopic עם תאים סרטניים אלה.
Abstract
קרצינומה השחלות אפיתל (EOC) קשורה עם פרוגנוזה גרועה כי זה מראה הפצת הצפק. כדי לשפר את סיכויי ההחלמה, חשוב לשלוט בהפצת הצפק. עם זאת, עדיין לא ברור כיצד תאים סרטניים להתנתק נגעים ראשוניים לצרף mesothelium. הקמת מודל חיה מתאים נדרשה כדי להשיג הבנה של המנגנון של הפצת הצפק in vivo. במחקר הנוכחי, אנחנו מציגים את התהליך מן הזריקה המקומית של תאי EOC לתוך שטח שחלות murine להתפתחות גרורה, כולל הצפק לאיברים מרוחקים. עכברים עירום נשי (BALB / c נו / נו) אחרי 8 שבועות של גיל היו בשימוש. תחת שדה מיקרוסקופי מבט, תאי EOC (1 x 10 5 תאים / μl של מטריקס הבינוני-תאי (ECM) מבוסס הידרוג'ל / השחלה חד-צדדית / עכבר) הוזרקה השחלות בעכברים באמצעות גישת retroperitoneal מסיר המאגף הגבה. השיטה המוצעת זהו leהליך ss פולשני העכבר ממזער נזקים השחלה. כאן אנו מתארים את השלבים מתודולוגיים בפיתוח של היווצרות הגידול המקורי גרורתי של EOC.
Introduction
קרצינומה שחלות אפיתל (EOC) מסבירה את השיעור הגבוה ביותר של תמותה מסרטן בקרב ממאירויות גינקולוגיות 1. EOC מזוהה עם פרוגנוזה גרועה, בעיקר בשל הסימפטומים שלה מאוחר, והיא קשורה לעיתים קרובות עם disseminations intraperitoneal מרובים גרורות מרוחקות 2-4. הפצת הצפק היא תהליך רב שלבים. ראשית, תאים סרטניים להתנתק גוש הראשוני, ולהעביר לתוך חלל הבטן. כאשר התאים הסרטניים לצרף mesothelium הצפק, הם מתחילים לפלוש לרקמות דרך 5,6 mesothelium. על מנת להבין טוב יותר את הביולוגיה של הגידול (למשל, התקדמות סרטן תגובה לטיפול), במודלים של עכברים מספקים שפע של מידע. Xenograft עם תאים סרטניים אנושיים נעשה שימוש נרחב עבור מודלי עכבר שבו תאים סרטניים אנושיים הם מחוסנים תת עורי, intraperitoneally, לתוך וריד, orthotopically. במודל חיה עם g orthotopicallyגידול rafted יכול יותר ביעילות ובדייקנות ליצור לתוצאות המשקפות את סביבת גידול באדם בהשוואה במודל חיה עם גידול מורכב heterotopically. לכן, עבור גידולים אנושיים רבים, מודלי השתלת orthotopic הוקמו 7-11.
כאן, אנו מתארים את חיסון orthotopic של תאים אנושיים EOC באמצעות גישה retroperitoneal מסירה מאגף הגבי, אשר הגביל הפולשנות לעומת חיסון הגחון. טכניקה זו יכולה לספק מגוון רחב של מידע שימושי על EOC, במיוחד מנגנון הפצת intraperitoneal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
פרוטוקול הטיפול פועל בהתאם להנחיות לניסויים בבעלי חיים שאימצה נאגויה האוניברסיטה.
1. הכנת השעיות תא
- שורת תאים ברורה תא קרצינומה שחלות אדם.
- שמור על תאים ES-2 12 במדיום RPMI-1640 עם 10% בסרום שור עוברית (FBS) ו פניצילין / סטרפטומיצין (פניצילין: 100 יחידות / מ"ל, סטרפטומיצין: 0.1 מ"ג / מ"ל). התרבות תאים על 37 מעלות צלזיוס חממה humidified 5% CO 2.
- איסוף תאים בשלב הצמיחה לוגריתמי ב 0.05% טריפסין / 0.02% פתרון EDTA (טריפסין / EDTA).
- ראשית, להסיר את המדיה הישנה מספינת תרבית תאים, ואז לשטוף את התאים פעם עם PBS (PBS ללא Ca 2 + / Mg 2+, 3 - 4 מ"ל לכל 25 ס"מ 2).
- לאחר מכן, הוסף 1 מ"ל לכל 25 ס"מ 2 של טריפסין / EDTA. סובב את כלי תרבית תאים כדי לכסות את monolayer תא עם טריפסין / EDTA. לאחר הסרת והשלכת טריפסין / EDTA, להחזיר את התאכלי תרבות כדי בחממה במשך 3 - 5 דקות או עד תאים מנותקים.
- בדקו את התאים תחת מיקרוסקופ כדי להבטיח את התאים מנותקים מפני השטח של כלי תרבית תאים צפים.
- להוסיף סרום טרי המכיל מדיום הגידול כדי להשבית טריפסין (5 מ"ל לכל 25 ס"מ 2), מחדש להשעות את התאים. העבר מחדש מושעה תאים צינור חרוטי 15 מ"ל.
- צנטריפוגה XG ב 300 במשך 5 דקות. בצע צנטריפוגה או על 4 מעלות צלזיוס או בטמפרטורת החדר. מוציאים בזהירות supernatant מחדש להשעות תאים עם מדיום הגידול (5 מ"ל לכל 25 ס"מ 2).
- ספירת תאים (למשל, על ידי הרחקה trypan כחול) ולאחר מכן מחדש להשעות במדיום הגידול בצפיפות של 2 x 10 8 תאים / מ"ל. שים את התאים מושעה על הקרח.
- מטריקס קפוא להפשיר (ECM) מבוסס aliquots הידרוג'ל באמבט קרח.
- מוסיף את השעית תא aliquots הידרוג'ל המבוסס ECM ביחס של 1: 1 (ג תא סופיoncentration: 1 x 10 5 תאים / μl של הידרוג'ל בינוני ECM מבוססי) ומערבבים היטב. מניח את מתלי תא המוכנים באמבט קרח עד לשימוש.
2. Orthotopic הרכבה עם השעיות תא
הערה: ניתוח אינו דורש לחבילה ייעודית. הניתוח יכול להתבצע על benchtop מעבדה באזור של החדר כי הוא נפרד ויש לו פעילות מינימלית. מכסה מנוע למינרית גם יכול לשמש. יש להשתמש מכשירי ניתוח סטרילי ומספריים לא אמורים לשמש כדי לעשות חתכים בעור.
- משתמשים בעכברים עירום נשי (BALB / c נו / נו) אחרי 8 שבועות של גיל עבור דגם חיסון orthotopic זה.
- ראשית, להרדים את העכבר באמצעות שאיפה עם isoflurane (2 - 4%). בדוק עומק הרדמה על ידי אימות חוסר הנסיגה על קמצוץ בוהן משרד. אחרי העכבר הוא הרדים, להחיל משחה עיניים סטריליות תפל על העיניים כדי למנוע התייבשות כנדרש.
- מניחים את העכבר הרדים על operating הבמה בצד הבטן כלפי מטה. לחטא את אזור הניתוח מספר פעמים הן עם אלכוהול ו לשפשף יוד המבוססת או כלורהקסידין מבוסס.
- ביצוע חתך ~ 2 סנטימטר אנכי ליד עמוד השדרה בין לקשת ירך costal התקינה. השתמש לעטוף כירורגית סטרילית סביב אתר החתך. תקן את משטחי עור החרותים עם מהדק כדי לשמור על הפתיחה.
הערה: Retractors יכול לשמש במקום מלחציים. - לאחר מכן, לעשות חתך שני (כ 1 סנטימטר) ב הצפק הקודקודית תחת החתך הראשון כדי לפתוח את חלל הבטן. קלאמפ משטחי בטן החרות. קליפ רקמת השומן המקיף את צינור השחלה השחלה ipsilateral עם מלחציים להסיר את השחלה מחלל הבטן. בזהירות את השחלה החצוצרה על גזה. לאחר מכן, הצב את העכבר בצד הבטן כלפי מטה תחת מיקרוסקופ לנתח.
- מניחים את ההשעיה תא מזרק אינסולין (1/2 סמ"ק, 29 G) ממש לפני ההזרקה. בזהירות להזריק את השעית התא המוכנה (1- 2 μl) לתוך השחלה. במשך כמה שניות, לשמור את המחט בתוך השחלה כדי להבטיח gelation של הידרוג'ל מבוסס ECM. לאחר gelation, תאי הגידול המוזרקים להישאר בתוך השחלה.
- בזהירות להחזיר את השחלה אל תוך הגוף. לתפור את החתך השני עם משי רפואי סטרילי, ואז לאטום את העור עם קליפים הפצע.
- לאחר ניתוח, העכברים ינוהלו שיכוך כאבים (למשל, meloxicam, תוך שרירית (IM) או תת עורית (SC), 0.2 מ"ג / קילו) לתקופת 24 שעות ראשוניות.
טיפול 3. לאחר ניתוח
- מניח כל עכבר בכלוב נפרד על נייר נקי עם חבילה חמימה כדי לשמור על חומו העכבר עד שהוא שב להכרתו מספיק כדי לשמור שכיבה sternal. לאחר מכן, להחזיר את החיות בכלובים שלהם לגידול וניטור. לפקח על עכברים כל יום במשך 3 - 7 ימים לאחר טיפול כירורגי.
- ניטור של עכברים לאחר ניתוח
- במקרה של סימנים של כאב, לנהל analgeSICS יומי (למשל, meloxicam, im או SC, 0.2 מ"ג / ק"ג).
- אם יש עכברים סימני זיהום (למשל, אדמומיות, נפיחות, הפרשות), לנהל זריקה יומית עם מגיב אנטי זיהומיות (למשל, פניצילין, im, 100,000 IU / ק"ג).
- סר חומר סגירת עור 10 - 14 ימים לאחר טיפול לאחר ניתוח.
ניתוח 4. של גידולים וגרורות
הערה: הגידול יוקם בבית 2 מוזרק השחלה - 3 השבועות לאחר חיסון.
- להקריב את העכברים על ידי פחמן דו חמצני, ולאחר מכן לאסוף דגימות (למשל, גידולים, גרורות, איברים) 13-15 לניתוח נוסף 14,16-20.
הערה: אם מערכת הדמית in vivo זמינה, תאי נושאות אנזימים המייצרים פליטת אור (למשל, בלוציפראז) או חלבון פלואורסצנטי (למשל, ה- GFP) ניתן להשתמש בפרוטוקול זה. פרוטוקול שונה זה יספק מידע שימושיהדינמיקה של התפשטות תאים סרטניים מהגידול הראשוני.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
שישה עכברים בעירום חסנו השחלות שלהם עם תאי תאי קרצינומה הקו ברור הגזע עוברי-2, כמתואר בפרוטוקול זה. כפי שניתן לראות בתרשים 1 א ', לאחר 2 שבועות, 5 מתוך 6 העכברים היה גידול בשחלה מחוסן עם ES-2 תאים, אבל לא היה גידול בשחלה הנגדי ללא חיסון (ששימשו כביקורת). יתר על כן, 2 מתוך 5 העכברים הראו disseminations הצפק המרובה עם מיימת. תאים גרורות בכבד (איור 1B). השחלות, הוא עם מסת הגידול באתר החיסון ובצד השליטה, נותחו, מחולקות, מוכתמת hematoxylin-eosin (HE), ונתחו תחת מיקרוסקופ (איור 2). מספר רב של תאי סרטן שחלות נצפה בשחלה המחוסנת, אבל לא בצד הנגדי. מורפולוגיה התא הייתה זהה לזה של הגידול ההורי.
"איור 1" src = "/ files / ftp_upload / 54,353 / 54353fig1.jpg" />
איור 1: היווצרות גידולים ידי Orthotopic הרכבה עם ES-2 תאים קרצינומה תאים אנושיים נקה. A ו- B, עכבר BALB / ג נו / נו עברו חיסון orthotopic עם תאי ES-2. לאחר 2 שבועות, העכבר הוקרב על necropsy. B, תאים גרורות בכבד (כפי שצוין על ידי חיצים). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2: Hematoxylin-eosin מכתים של השחלות עם Orthotopic הרכבה עם ES-2 תאים Cell Carcinoma האדם נקה. A ו- B, השחלה עם חיסון של בתאי גזע עובריים-2, מוכתם hematoxylin-eosin (HE). מכתים דומה נתפס בהשוואה לזו של קרצינומה של תאים ברוריםבשחלה האדם. C ו- D, HE מכתים של השחלה ללא חיסון כביקורת. ברי סולם, 100 מיקרומטר (A, C), 20 מיקרומטר (B, D). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
במודלים של בעלי חיים חיוניים כדי לנתח את מנגנוני התפתחות גידולים, התקדמות, גרורות, וכן יעילות התרופה כנגד תאים סרטניים. בעכברים נושאי בתאי סרטן שחלות אדם גם שמשו במודל חיה. כאן אנו מתארים הליך פולשני פחות עבור הממשל של תאים סרטניים בשחלות ב אתר orthotopic. באמצעות הליך זה, חיסון לתוך השחלה דרך גישה retroperitoneal מסירה מאגף הגבי מציע יתרונות משמעותיים על פני שיטות אחרות נפוץ. ראשית, חיסון orthotopic יכול לספק יותר תוצאות יעילות ומדויקות המשקפים סביבת הגידול באדם 13,21. שנית, גישת retroperitoneal זו מסירת המאגף הגבה רק צריכה לנתיחה קטנה (<1 - 2 סנטימטר), כך הוא הליך מהיר לעומת הגישה הצפק. לכן, הגישה retroperitoneal זו היא פחות פולשנית עבור עכברים. שלישית, השחלה בעכברים הוא קטן מאוד, ולא תוכל לקבל כמות גדולה של ריאהגברים. בהליך זה מובא, אנו משתמשים השעיות תא מרוכזות מאוד (1 x 10 5 תאים / μl) ואת נפח חיסון נמוך (1 - 2 μl / הזרקה) כמו ירייה אחת; ולכן, זה ממזער את הנזק אל השחלה. זה גם ימנע הדליפה של תאים מחוסנים מהשחלה. למרות מחקר נוסף הוא חיוני, החיסון orthotopic murine המתואר יכול להיות גישה יעילה כדי לעזור לפתח טיפולים חדשים לטיפול EOC בעתיד.
ישנן שתי נקודות קריטיות בפרוטוקול זה. ראשית, התאים משמשים בשלב צמיחת הלוגריתמים. שנית, התאים מושעים עם הידרוג'ל מבוסס ECM מונחים על קרח עד לשימוש. כאשר הידרוג'ל מבוסס ECM מתחיל להתחמם, תהליך gelation יתחיל. כדי למנוע את gelation של הידרוג'ל מבוסס ECM, תאים מחדש תלויים עם הידרוג'ל מבוסס ECM ומכשירים (למשל, צינורות, מזרקים, מחטים) נשמרים על קרח עד לשימוש. יש מגבלה אחת של טכניקה זו.נפח ההזרקה של השעית התא הוא פחות מ -3 μl, כי שחלת העכבר לא יכולה לקבל כמויות גדולות של בידוד.
פרוטוקול זה יכול להיות שונה בנקודות מסוימות. אם מערכת הדמיה in vivo זמין, התאים נושאות אנזימים המייצרים פליטת אור (למשל, בלוציפראז) או חלבון פלואורסצנטי (למשל, ה- GFP) ניתן להשתמש בפרוטוקול זה. פרוטוקול שונה זה יספק מידע שימושי על הדינמיקה של התפשטות תאים סרטניים מהגידול הראשוני. כמו כן, פרוטוקול זה משתמש ES-2 תאים עבור חיסון עם שחלת עכבר. ES-2 תאים נגזרים קרצינומה של תאים ברורים, את שורות תאים מפגינות צמיחה אגרסיבית עכבר בעירום. שורות תאים אחרים (למשל, קרצינומה הצפק) יכול לשמש גם בפרוטוקול זה במקום בתאי גזע עובריים-2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
החוקרים אין לי מה לחשוף.
Acknowledgments
המחברים מודים לחברי מחלקת נשים ויולדות וביולוגיה סרטן לדיונים שלהם מסייע סיוע טכני. מחקר זה נתמך על ידי האגודה יפן לקידום המדע (JSPs) גרנט ב- Aid למחקר מדעי (15K15604; לה 'Kajiyama).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Matrigel matrix | BD | 354234 | ECM-based hydrogel |
| Insulin syringe | TERUMO | SS-05M2913 | 1/2 cc, 29 G x 1/2" |
| Suturing needle with suture | 11 mm, 3/8, Nylon6-0 | ||
| Reflex 7 mm Wound Clip Applier | CellPoint Scientific | 204-1000 | |
| Reflex 7 mm wound clips | CellPoint Scientific | 203-1000 |
References
- Jemal, A., et al.
- Kajiyama, H., et al. Long-term clinical outcome of patients with recurrent epithelial ovarian carcinoma: is it the same for each histological type. Int J Gynecol Cancer. 22 (3), 394-399 (2012).
- Kikkawa, F., et al. Advances in treatment of epithelial ovarian cancer. Nagoya J Med Sci. 68 (1-2), 19-26 (2006).
- Yoshikawa, N., et al. Clinicopathologic features of epithelial ovarian carcinoma in younger vs. older patients: analysis in Japanese women. J Gynecol Oncol. 25 (2), 118-123 (2014).
- Kajiyama, H., et al. Involvement of SDF-1alpha/CXCR4 axis in the enhanced peritoneal metastasis of epithelial ovarian carcinoma. Int J Cancer. 122 (1), 91-99 (2008).
- Terauchi, M., et al. Possible involvement of TWIST in enhanced peritoneal metastasis of epithelial ovarian carcinoma. Clin Exp Metastasis. 24 (5), 329-339 (2007).
- Bronstein, L., Zechner, C., Koeppl, H. Bayesian inference of reaction kinetics from single-cell recordings across a heterogeneous cell population. Methods. 85, 22-35 (2015).
- Guo, W., Zhang, S., Liu, S. Establishment of a novel orthotopic model of breast cancer metastasis to the lung. Oncol Rep. 33 (6), 2992-2998 (2015).
- Lewis-Tuffin, L. J., et al. Src family kinases differentially influence glioma growth and motility. Mol Oncol. , (2015).
- Saar, M., et al. Orthotopic tumorgrafts in nude mice: A new method to study human prostate cancer. Prostate. 75 (14), 1526-1537 (2015).
- Zou, Y., et al. miR-29c suppresses pancreatic cancer liver metastasis in an orthotopic implantation model in nude mice and affects survival in pancreatic cancer patients. Carcinogenesis. 36 (6), 676-684 (2015).
- Lau, D. H., Lewis, A. D., Ehsan, M. N., Sikic, B. I. Multifactorial mechanisms associated with broad cross-resistance of ovarian carcinoma cells selected by cyanomorpholino doxorubicin. Cancer Res. 51 (19), 5181-5187 (1991).
- Bao, L., Matsumura, Y., Baban, D., Sun, Y., Tarin, D. Effects of inoculation site and Matrigel on growth and metastasis of human breast cancer cells. Br J Cancer. 70 (2), 228-232 (1994).
- Huang, M. J., et al. Epidemiological investigation on major depressive disorder in the most heavily damaged areas from Wenchuan earthquake in 2008. Zhonghua Liu Xing Bing Xue Za Zhi. 31 (2), 167-170 (2010).
- Ma, L., et al. Mortality of neonatal respiratory failure related to socioeconomic factors in Hebei province of China. Neonatology. 100 (1), 14-22 (2011).
- Lin, Z., et al. Serum levels of FGF-21 are increased in coronary heart disease patients and are independently associated with adverse lipid profile. PLoS One. 5 (12), e15534 (2010).
- Liu, B., et al. Lumbar interspinous non-fusion techniques: comparison between Coflex and Wallis. Nan Fang Yi Ke Da Xue Xue Bao. 30 (11), 2455-2458 (2010).
- Zhang, Y., et al. Wave intensity analysis of carotid artery: a noninvasive technique for assessing hemodynamic changes of hyperthyroid patients. J Huazhong Univ Sci Technolog Med Sci. 30 (5), 672-677 (2010).
- Song, G. S., et al. Comparative transcriptional profiling and preliminary study on heterosis mechanism of super-hybrid rice. Mol Plant. 3 (6), 1012-1025 (2010).
- Wan, L., et al. The analysis of variation of Han female adolescent bone development in Henan and Zhejiang province. Fa Yi Xue Za Zhi. 26 (2), 97-99 (2010).
- Wang, H. B., et al. Excitation-emission fluorescence characterization study of the three phenolic compounds. Guang Pu Xue Yu Guang Pu Fen Xi. 30 (5), 1271-1274 (2010).
