Abstract
Undersøgelser af integrale membranproteiner in vitro ofte kompliceret af tilstedeværelsen af en hydrofob transmembrandomæne. Yderligere komplicerende disse undersøgelser, nystiftes vaskemiddel-opløst membranproteiner i liposomer er en stokastisk proces, hvor protein topologi er umuligt at håndhæve. Dette papir giver en alternativ fremgangsmåde til disse udfordrende teknikker, der udnytter et liposom-baseret stillads. Proteinopløselighed forøges ved deletion af transmembrandomænet, og disse aminosyrer er erstattet med en tethering del, såsom et His-mærke. Denne tøjr interagerer med en forankrende gruppe (Ni 2+ koordineret af nitrilotrieddikesyre (NTA (Ni 2+)) for His-mærkede proteiner), der gennemtvinger en ensartet protein topologi ved overfladen af liposomet. Et eksempel præsenteres hvori interaktionen mellem dynamin-relateret protein 1 (Drp1) med et integreret membranprotein, mitochondrial fission Factor (MFF), var INVEstigated hjælp af denne stillads liposomfremgangsmåde. I dette arbejde har vi vist evne FFR til effektivt rekruttere opløselig Drp1 til overfladen af liposomer, som stimulerede sin GTPase aktivitet. Desuden Drp1 var i stand til at tubulate FFR dekoreret lipid skabelon i tilstedeværelse af specifikke lipider. Dette eksempel viser effektiviteten af stillads liposomer ved hjælp af strukturelle og funktionelle assays og fremhæver den rolle FFR i reguleringen Drp1 aktivitet.
Introduction
At studere membran-proksimal protein-protein interaktioner er en udfordrende bestræbelse på grund af vanskeligheder med den gentog det native miljø af de integrerede membranproteiner involveret 1. Dette skyldes nødvendigheden af detergentsolubilisering og den inkonsekvente orientering af proteiner i proteoliposomer. For at undgå disse problemer har vi ansat en strategi, hvorved opløselige domæner af integrale membranproteiner er udtrykt som His-tag fusionsproteiner, og disse opløselige fragmenter er forankret til stillads liposomer via interaktioner med NTA (Ni 2+) hovedgrupper på lipid overflade. Ved hjælp af disse scaffolds, kan lipid-proximal proteininteraktioner undersøges over et område af lipid og protein sammensætninger.
Vi har faktisk anvendt denne metode til at undersøge de kritiske protein-protein interaktioner, der styrer samlingen af det mitokondrielle fission kompleks og undersøge lipid interaktioner, der modulerer denne process to. Under mitokondrie fission, en konserveret membran remodeling protein, kaldet dynamin-relateret protein 1 (Drp1) 3, rekrutteres til overfladen af den ydre mitokondriemembran (OMM) som reaktion på cellulære signaler, som regulerer energi homeostase, apoptotisk signalering, og flere andre integrale mitokondrielle processer. Denne store, cytosolisk GTPase rekrutteres til overfladen af mitokondrier gennem interaktion med integrerede OMM proteiner 4 - 8. Rollen som en sådant protein, mitochondrial fission Factor (MFF), har det været vanskeligt at belyse skyldes en tilsyneladende svag interaktion med Drp1 in vitro. Ikke desto mindre har genetiske undersøgelser viste klart, at FFR er væsentlig for en vellykket mitokondriel fission 7,8. Den i dette manuskript metode var i stand til at overvinde tidligere mangler ved at indføre samtidige lipid interaktioner, der fremmer Drp1-FFR interaktioner. Samlet set denne roman assay reveaførte grundlæggende interaktioner styrende samling af mitokondrie fission komplekse og forudsat en ny fase for igangværende strukturelle og funktionelle studier af dette væsentlige molekylær maskine.
Til dato har undersøgelse af interaktioner mellem Drp1 og MFF blevet kompliceret af den iboende fleksibilitet FFR 9, heterogenitet Drp1 polymerer 2,10, og vanskeligheden ved rensning og rekonstituering fuld længde FFR med et intakt transmembrandomæne 11. Vi rettet disse udfordringer ved at bruge NTA (Ni 2+) stillads liposomer at rekonstruere His-mærket MFF der mangler sit transmembrane domæne (MffΔTM-His 6). Denne strategi var fordelagtigt, fordi MffΔTM var yderst opløselig når overudtrykt i E. coli, og dette isolerede protein blev let rekonstitueres på stillads liposomer. Når tøjret til disse lipid-skabeloner, MFF antog en identisk, udadvendende orientering på overfladen af membranen.Ud over disse fordele, mitokondrielle lipider, såsom cardiolipin, blev tilsat for at stabilisere MFF foldning og association med membranen 11. Cardiolipin interagerer også med den variable domæne af Drp1 2,12, som kan stabilisere denne uordnede region og letter samling af fission maskiner.
Denne robuste metode er bredt anvendelig til fremtidige undersøgelser, der søger at evaluere membran-proksimale protein interaktioner. Gennem brug af yderligere tethering / affinitet interaktioner, kan forfinelse af disse membran rekonstitution undersøgelser styrkes for at efterligne yderligere kompleksitet findes på overfladen af membraner i cellerne. Samtidig kan lipidsammensætninger modificeres til mere nøjagtigt at efterligne de native miljøer i disse makromolekylære komplekser. Sammenfattende denne fremgangsmåde tilvejebringer et middel til at undersøge de relative bidrag af proteiner og lipider i udformningen membran morfologier til i kritiske cellulære proccesser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Scaffold Liposomfremstillinq
BEMÆRK: Ideelt bør indledende forsøg anvende en relativt simpel og uden særlige træk stillads (bestående af DOPC (1,2-dioleoyl--sn-glycero-3-phosphocholin eller PC) og DGS-NTA (Ni 2+) (1,2-dioleoyl - sn-glycero-3 - [(N - (5-amino-1-carboxypentyl) -iminodieddikesyre) succinyl]. (nikkel salt)) Bygning off af disse eksperimenter, lipid ladning, fleksibilitet og krumning kan indføres som individuelle faktorer med potentiale til at ændre membran-proksimale interaktioner. Disse ændringer kan opnås ved tilsætning af definerede mængder af specifikke lipidkomponenter, herunder phosphatidylserin eller cardiolipin (CL), phosphatidylethanolamin (DOPE eller PE), eller galactosyl (β) ceramid.
- Kombiner lipider opløst i chloroform i et rent reagensglas. Opløsningsmidlet afdampes med tør nitrogengas under rotation af røret for at danne en tynd lipidfilm. Fjerne resterende opløsningsmiddel med en centrifugal fordamper i 1 time ved 37 ° C.
BEMÆRK: diverse liposomformuleringer anvendes i protokollerne beskrevet nedenfor: stillads liposomer (3,3 mol% DGS-NTA (Ni 2+) / 96,7 mol% DOPC), stillads liposomer med cardiolipin (3,3 mol% DGS-NTA (Ni 2+) / 10 mol% cardiolipin / 86,7 mol% DOPC), fleksible stillads liposomer med cardiolipin (3,3 mol% DGS-NTA (Ni 2+) / 10 mol% cardiolipin / 35 mol% DOPE / 51,7 mol% DOPC), og beriget stillads liposomer (10 mol-% DGS-NTA (Ni 2+) / 15 mol% cardiolipin / 35 mol% DOPE / 40 mol-% DOPC). - Tilføj Buffer A (25 mM HEPES (4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazinethansulfonsyre), 150 mM KCI, pH justeret til 7,5 med KOH) forvarmet til 37 ° C, således at den endelige lipidkoncentration er 1 - 2 mm. Inkuber 30 min ved 37 ° C med lejlighedsvis vortexing til fuldt ud at opblande lipidblandingen (figur 1a).
- Overførsel til en plastik reagensglas, placere røret i flydende nitrogen, indtil helt frosset (RougHly 30 s) og sted i en 37 ° C vandbad, indtil fuldt optøet (ca. 1 - 2 ud min). Gentag for i alt 4 fryse-tø-cykler (figur 1b).
- Forbered en lipid ekstruder ved opblødning 4 filter støtter og en polycarbonat-filter i buffer og samling af ekstruder i henhold til producentens anvisninger. Ekstrudere lipidopløsning gennem filteret 21 gange. Brug blid, konstant pres for at sikre en homogen størrelsesfordeling (figur 1c).
BEMÆRK: For alle eksperimenter beskrevet i denne protokol blev en 1,0 um polycarbonat filter bruges til ekstrudering. Drp1 interaktion med anioniske lipider kan observeres med en række liposompræparater diametre i området fra 50 nm til 400 nm 12 eller større 13. Derfor blev filteret størrelse på 1 um valgt til at være ideel til både GTPase-aktivitet og til elektronmikroskopi. Hvis der ønskes andre liposom diametre, udarbejdelse af gigantiske unilamelvesikler 14,15 (GUVs) eller lille unilamellar vesikler 16 (SUV'er) kan anvendes. Dynamisk lysspredning kan anvendes til at vurdere liposomstørrelse heterogenitet 13. - Opbevar ekstruderede liposomer ved 4 ° C og kasseres efter 3 - 5 d.
2. Brug af Stillads Liposomer for proteinbinding Analysis
- Prøvefremstilling
- Inkuber His-mærket MffΔTM (5 uM endelig) med stillads liposomer (40 mol% PC / 35 mol% PE / 15 mol% CL / 10 mol-% DGS-NTA (Ni 2+); 50 pM endelig) i mindst 15 min ved stuetemperatur i puffer A + BME (25 mM HEPES, 150 mM KCI, 10 mM β-mercaptoethanol (BME), pH justeret til 7,5 med KOH). For en MFF-fri kontrol, inkuberes liposomer med et His-mærket kontrol protein (såsom GFP) til at binde og skjold eksponeret NTA (Ni 2+).
BEMÆRK: MffΔTM blev udtrykt og oprenset som beskrevet i en tidligere undersøgelse 2. GFP blev oprenset på en lignende måde, men ionbytning blev udeladt. BME var nødvendig for disse eksperimenterendets fordi Drp1 er følsom over for oxidation, som kan ændre sine aktivitet og montage egenskaber. - Tilføj Drp1 (2 uM endelig) og inkuberes i 1 time ved stuetemperatur.
BEMÆRK: Drp1 blev udtrykt og oprenset som beskrevet i en tidligere undersøgelse 2. Efter inkubation med Drp1, kan virkningen af nukleotid bindende for membran deformation undersøges ved at inkubere i yderligere en time med 2 mM MgCl2 og enten 1 mM GTP, 1 mM GMP-PCP, eller Buffer A + BME.
- Inkuber His-mærket MffΔTM (5 uM endelig) med stillads liposomer (40 mol% PC / 35 mol% PE / 15 mol% CL / 10 mol-% DGS-NTA (Ni 2+); 50 pM endelig) i mindst 15 min ved stuetemperatur i puffer A + BME (25 mM HEPES, 150 mM KCI, 10 mM β-mercaptoethanol (BME), pH justeret til 7,5 med KOH). For en MFF-fri kontrol, inkuberes liposomer med et His-mærket kontrol protein (såsom GFP) til at binde og skjold eksponeret NTA (Ni 2+).
- Negativ Stain Transmission Electron Microscopy (EM) Analyse
- Transfer 5 pi af prøven til et ark laboratoriefilm og lægge et kulovertrukket Cu / Rh gitter på prøven. Inkubér gitteret 1 min på prøven, skamplet overskydende væske på filterpapir væk, og overføre til et fald på 2% uranylacetat. Der inkuberes 1 min, skamplet overskydende plet på filtrerpapir, og overføre til en gitter kasse. Opbevares under vakuum O / N til at sikre fuld udtørring.
- prøver billede ved hjælp af en transmissions elektron Microscope på 18.500 - 30.000 X forstørrelse til at observere ultrastrukturelle ændringer i protein og liposom morfologier 17.
Bemærk: Ultrastrukturelle ændringer kan kvantificeres ved hjælp af billedanalyse software, såsom ImageJ 13 (http://imagej.nih.gov/ij/). Protein dekoration kan måles ved sammenligning med nøgne lipid skabeloner. Derudover kan diametrene af rørformede segmenter måles fra den yderste del af indretningerne 13. En mere detaljeret analyse kan udføres under anvendelse cryo-elektronmikroskopi 17. Denne metode kan anvendes til at afbilde native protein-lipid samlinger i opløsningsmiddel uden anvendelse af tungmetal pletter, pels prøven. På denne måde, detaljerede strukturelle træk ikke synlige i negativt plet, herunder ændringer i den underliggende lipid morfologi, kan undersøges og kvantificeres.
3. Anvendelse af Scaffold Liposomer for enzymatisk assay
Bemærk: En colorimetrisk GTPase assay 18 blev anvendt til måling phosphat frigørelse via GTP hydrolyse. Alternative GTPase analyser er tilgængelige 19 og kan implementeres efter behov.
- Inkubér His-mærket MffΔTM (MFF), Fis1ΔTM (Fis1), eller GFP (5 uM endelig for alle) med stillads liposomer (150 uM endelig) i 15 minutter ved stuetemperatur i puffer A + BME (volumen = 30 uL). Tilføj Drp1 (500 nM endelig) og inkuberes i yderligere 15 minutter ved stuetemperatur (volumen = 80 uL).
BEMÆRK: Fis1 blev oprenset på en måde svarende til FFR 2, men ionbytningskromatografi blev udeladt. Formålet med His-mærket GFP er at skærme NTA (Ni 2+) hovedgrupper og forhindre uspecifikke charge interaktioner med andre proteiner. Hvis der observeres nogen effekt i fravær af GFP, kan da ikke være påkrævet denne kontrol. Alternative blokerende proteiner (af samme størrelse til proteinet af interesse) kan ligeledes anvendes, men GFP giver mulighed for direkte visualisering af interaktioner med SCAFfold liposomer. - Overføringsrørene til en thermocycler indstillet til 37 ° C, og igangsætte reaktioner ved tilsætning af GTP og MgCl2 (1 mM og 2 mM endelig, fig volumen = 120 pi).
- På ønskede tidspunkter (dvs. t = 5, 10, 20, 40, 60 min), overfører 20 pi reaktion til brønde i en mikrotiterplade indeholdende 5 pi 0,5 M EDTA til chelatere Mg2 + og standser reaktionen.
- Forbered et sæt fosfat standarder ved at fortynde KH 2 PO 4 i Buffer A + BME at kalibrere resultaterne. En nyttig sæt standarder er 100, 80, 60, 40, 20, 10, 5 og 0 uM. Der tilsættes 20 ul af hver til brønde indeholdende 5 pi 0,5 M EDTA.
- Tilsæt 150 pi malakitgrønt reagens (1 mM malakitgrønt carbinol, 10 mM ammoniummolybdat tetrahydrat, og 1 N HCI) til hver brønd, og læse OD650 5 min efter tilsætningen.
BEMÆRK: GTP er syrelabil, og vil hydrolysere i nærvær af malakitgrønt reagens. Sørg for, at than tid mellem at tilføje malakit reagens og læsning er konstant at sikre reproducerbare resultater. - Danne en standardkurve ved at afbilde OD 650 af standarderne som en funktion af phosphatkoncentration. Brug lineær regression for at bestemme forholdet mellem OD650 og phosphatkoncentration i en prøve.
- Efter den lineære regression, konvertere OD650 af proteinet reaktionsbetingelser prøver til pM phosphat. Bestemme hastigheden af phosphat generation for hver reaktionsblanding ved at plotte phosphatkoncentration som funktion af tiden, og konvertere til k kat ved at dividere den sats, Den Drp1 koncentration (0,5 uM).
BEMÆRK: Kun den indledende lineær hastighed bør anvendes til at bestemme hastigheden af phosphat generation, og skal anvendes mindst 3 datapunkter. Hvis reaktionshastigheden er tilstrækkelig hurtig, at de første tre datapunkter er ikke lineær (dvs. R 2 i den lineære tilpasning er mindre end 0,9) et tegnbør udføres ificantly kortere tidsforløb med mindst 3 tidspunkter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Mens interaktionen mellem Drp1 og MFF har vist sig at være vigtigt for mitokondriel fission, har dette samspil været vanskeligt at rekapitulere in vitro. Vores mål var at bedre efterligne den cellulære miljø, hvor Drp1 og MFF interagere. Med henblik herpå liposomer indeholdende begrænsende koncentrationer af NTA (Ni 2+) hovedgrupper blev fremstillet ved rehydrering en lipidfilm, som beskrevet ovenfor. Lipidopløsningen består i første omgang af unilamellære og multilamellære vesikler af heterogene diametre som det fremgår af opaciteten af opløsningen (figur 1a). Denne opacitet reduceres ved frysning-optøning (figur 1b), hvilket reducerer forekomsten af multilamellare vesikler. De liposom diametre yderligere homogeniseret ved ekstrudering gennem et polycarbonat filter, hvilket resulterer i en klar opløsning (figur 1c).
2. Med udgangspunkt i disse resultater, vi udnyttet en ny skabelon sammensat af PC, PE, Ni, og CL (kaldet Enriched Scaffold Liposomer eller ESL) at fremme bestilte samling af en polymer Drp1-FFR kompleks stand til at inducere membran deformation. Specifikt forøgede NTA (Ni 2+) og cardiolipin lipider blev anvendt (10 mol-% og 15 mol-% henholdsvis) til denne anvendelse. Derefter blev GFP eller FFR tøjret til ESL skabeloner i nærvær og fravær af Drp1 (figur 2), og evnen hos Drp1 at remodel membraner blev kvalitativt vurderet. I mangel af Drp1, hverken MFF eller GFP resulterede i membran deformation (figur 3a, b), og ligeledes i tilfælde af GFP-dekoreret ESL blev kun konturløse liposomer observeret (figur 3c). Men når Drp1 sattes til MFF-dekorerede ESL skabeloner, remodellering af liposomerne var tydelig (figur 3D).
Mens makromolekylære kompleksdannelse viser tydeligt en vekselvirkning mellem Drp1 og MFF, denne kvalitative analyse alene er i stand til at bestemme de funktionelle effekter af en sådan interaktion. Derfor vi udnyttet en malakitgrønt phosphat generation assay 18 for at vurdere ændringer i den katalytiske aktivitet af Drp1 som respons på interaktion med MFF. Som beskrevet tidligere 2, vi oprindeligt anvendt en simpel stillads liposom (SL 3.3 mol% DGS-NTA (Ni 2+), 96,7 mol% DOPC) for at undersøge virkningen af FFR alene på Drp1 struktur og funktion. Ikke-specifik interaktion Drp1 med NTA (Ni 2+) er tidligere blevet beskrevet 20, så SL oprindeligt var designet til at indeholde lave koncentrationer af NTA (Ni 2+) for at undgå uspecifik aktivitet stimulering af Drp1. Med større mængder af NTA (Ni 2+) i ESL, blev brugen af His-mærket GFP som en kontrol findes at være kritisk at skærme Ni2 + og forhindre ikke-specifikke Drp1 interaktioner. Efter udsmykning af SL liposomer ved FFR eller GFP (som illustreret i figur 2), kan omfanget af selvsamling vurderes ved måling af GTPase aktivitet af Drp1. I fravær af liposomer, Drp1 har en relativt lav basal GTPase aktivitet, som er lidt forøget ved tilsætning af SL. Udsmykning af disse stillads liposomer med MFF forbedret GTPase aktivitet (figur 4a, 1,8 gange). Omvendt, når den eksponerede NTA (Ni 2+) hovedgrupper blev blokeret med His-mærket GFP, var dette augmented GTPase aktivitet poleres. Vi testede også rollen som Fis1, en OMM protein, der er blevet foreslået at have en rolle i mitokondrie fission 21,22, selv om dette er blevet udfordret i de seneste undersøgelser 7,23. Opbinding af Fis1 der mangler sit transmembrane domænetil SL heller ikke fremkalde en stimulering af Drp1 s GTPase aktivitet (figur 4a).
Vi udnyttede derefter en lidt mere kompleks lipid stillads indeholdende en lille mængde af cardiolipin (SL / CL: SL med 10 mol-% cardiolipin erstatter DOPC) for at bestemme den rolle, denne mitokondrie lipid i interaktionen af Drp1 og MFF. Denne moderate koncentration af cardiolipin var specielt udvalgt til at begrænse stimulering af Drp1 ved cardiolipin som tidligere 10 beskrevet. Svarende til SL, tilsætning af SL / CL til Drp1 resulterede i en let stimulering af GTPase aktivitet, der blev vendt ved tethering His-mærket Fis1 eller GFP til liposomerne. En synergi mellem MFF og cardiolipin blev observeret som GTPase aktivitet af Drp1 blev stimuleret 2,6 gange, når det blev inkuberet med MFF-dekoreret SL / CL (figur 4b).
Membranfluiditet og evnen of Drp1 at omforme lipid dobbeltlag er blevet foreslået at øge sin GTPase aktivitet. Derfor søgte vi at undersøge effekten af membranfluiditet / fleksibilitet ved anvendelse af en fleksibel stillads liposom. Dette blev opnået ved at erstatte 35 mol-% DOPC i SL / CL med DOPE (SL / PE / CL), som tidligere er blevet vist at give mulighed for Drp1-medieret membran remodeling 10. Tilsætning af udekorerede SL / PE / CL stillads liposomer til Drp1 lidt øger Drp1 GTPase aktivitet og udsmykning af disse liposomer med GFP eliminerer denne effekt. Når SL / PE / CL skabeloner var dekoreret med FFR blev Drp1 aktiviteten forøget (figur 4c, 2,4 gange). Som vi tidligere har vist, blev evnen hos Drp1 at remodel liposomer i lipide tubuli forbedres ved tilsætning af PE til stilladset liposomer. Interessant, gjorde denne forbedrede tubulation fører til dannelsen af en spiralformet Drp1 polymer ikke medføre nogen større stimulation sammenlignet med liposomer, at Drp1 ikke kunne omforme Ved hjælp af disse fleksible lipid skabeloner, blev MFF og Drp1 fundet at interagere på en mere oprindelige miljø in vitro. Denne teknik har gjort det muligt for os at styre den relative forekomst af Drp1, MFF (gennem NTA (Ni 2+) koncentration), og specifikke lipider (cardiolipin og PE specifikt), der syntes at regulere samling af denne makromolekylære kompleks. Som vi har vist, kan denne metode anvendes til at visualisere membranen ombygning af MFF-rekrutteret Drp1 ved elektronmikroskopi, og at bestemme virkningerne af Drp1 samling på sin katalytiske aktivitet ved hjælp GTPase aktivitet assay. 71fig4.jpg "/> 
Figur 1: Lipid Fremstilling Skematisk. (A) Ved resuspension, liposomer af forskellige størrelser dannes og består af unilamellare og multilamelnende vesikler, hvilket resulterer i en uigennemsigtig opløsning (indsat). (B) frysetørring af opløsning resulterer i en mere unilamellare population af liposomer, som stadig er heterogene i diameter. Frysetørring tydeliggør opløsning (indsat). (C) Ekstrudering af lipidopløsning homogeniserer liposomet diameter (1,0 um i dette eksempel), og resulterer i en klar opløsning (indsat). Klik her for at se en større version af dette tal. 
Figur 2: Metoder til at vurdere Protein forsamling. En skematisk skildrer partner protein montering på stillads liposomer præsenteres. His-mærket partnerlande proteiner eller GFP inkuberes med stillads liposomer, og derefter Drp1 inkuberes med dekoreret eller undecorated lipo Somes. Disse Drp1-formonteret liposomer kan derefter analyseres ved strukturelle metoder (elektronmikroskopi) og funktionelle assays (GTPase-assay). Klik her for at se en større version af dette tal. 
Figur 3: Strukturel Vurdering af Drp1 Rekruttering. Negative plet transmission mikrografier af GFP eller FFR indrettede liposomer alene (A, B, henholdsvis) eller inkuberet med Drp1 (C, D, henholdsvis). Scale bar = 100 nm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Stillads Liposome enzymatisk analyse. (A - C) Dannelsen af phosphat over tid blev målt (indsat), og kcat blev bestemt. Denne metode blev anvendt til SL-tøjret proteiner (A), SL / CL-tøjret proteiner (B), eller SL / PE / CL-tøjret proteiner (C). #: P <0,05, *: p <0,0001, **: p <0,000001 som bestemt ved uparret t-test. Alle fejl søjler repræsenterer standardafvigelse fra 3 uafhængige stikprøver. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokol giver en metode til undersøgelse af protein-protein interaktioner, der involverer integrale membranproteiner. Ved at udnytte en modulær liposom stillads, undersøgere er i stand til at vurdere aktiviteten af et eller flere proteiner i et lipid-proksimal miljø. Tidligere undersøgelser har påvist en lignende fremgangsmåde til receptor enzymer af plasmamembranen 24-26. Vi har udvidet denne metode til at inkorporere lipid cofaktorer og udforske interaktioner mellem proteiner, der udgør den mechanoenzymatic kerne af det mitokondrielle fission maskiner.
For modelsystemet præsenteret ovenfor, fandt vi, at MFF-dekoreret SL udvidet Drp1 selvsamling. Desuden viser vi nu, at MFF-dekoreret ESL skabeloner effektivt blev ombygget af vildtype Drp1 at danne udvidede rørformede strukturer. Vi vurderede også roller forskellige mitokondrielle lipider, herunder den negativt ladede cardiolipin og den koniske lipid PE.Cardiolipin synergistisk med FFR for yderligere at forbedre Drp1 selvsamling, mens fleksibiliteten og flydende membran bibragt af PE øger membran tubulation, men ikke yderligere forøge MFF-induceret stimulering.
For at vurdere ultrastrukturelle ændringer i membran morfologier, analyser EM var påkrævet. Drp1 GTPase aktivitet var forhøjet gennem klynge- og samling af filamentøse polymerer, der ikke omforme liposomerne i større omfang 2. Men membran deformation blev observeret, når mere mitokondrier-lignende SL / PE / CL skabelon blev anvendt. Interessant nok blev enzymaktiviteten ikke forbedret. Derfor EM studier var afgørende at identificere vigtige forskelle, der ellers ville blive savnet ved hjælp af den funktionelle analyse.
Mens denne teknik er kraftfuld for at udforske funktion og interaktion af opløselige proteiner og opløselige proteindomæner, kan disse lipid scaffolds ikke højde for den rolle, transmembrane domænes. Dette er en vigtig overvejelse, fordi det transmembrane domæne kan påvirke dynamiske protein processer såsom selv-samling 27 og lateral diffusion 28-30 i lipid dobbeltlag. Hvis disse faktorer er afgørende for at vurdere protein-interaktioner ved membranens overflade, ville så traditionelle lipid rekonstituering eksperimenter med detergent blive begunstiget. Alternative bindsler kan også undersøges for at kontrollere rekruttering og mobilitet membranen forankrede proteiner.
Ud over at anvende His-mærkede proteiner med NTA (Ni 2+) lipidankre, andre bindsler såsom biotin-konjugeret 31 eller reaktiv gruppe-konjugeret lipider kan anvendes. Disse kovalente modifikationer ville mere stabilt fælde proteiner på lipid overfladen, men mobilitet og udveksling af disse faktorer vil sandsynligvis blive mindsket. Som sådan bør tøjret overvejes nøje i forbindelse med de proteinkomplekser blive undersøgt. Når considering brugen af denne fremgangsmåde, er tilstanden af tøjre proteiner til lipid skabeloner har potentiale til at påvirke visse assays. For eksempel kan His-mærke tethering til NTA (Ni 2+) metode være mere passende for in situ-assays i stedet for eksperimenter separation, især i tilfælde af forbigående protein-protein interaktioner. Det fremgår klart i figur 3 af uoverensstemmelsen mellem den in situ negative plet elektronmikroskopi og sedimentation analysen.
I fremtiden kan en kombination af to eller flere af disse anker lipider med forskellige mål hovedgrupper skal gennemføres for at give mulighed for ansættelse af flere proteiner til et stillads skabelon uden konkurrence for en enkelt lipid tøjr. Desuden kan den relative forekomst af hver komponent forvaltes ved ændring af lipidsammensætningen. Yderligere lipid cofaktorer, såsom phosphoinositider, cardiolipin og phosphatidylserin, let kan indføresi disse skabeloner til at vurdere den isolerede virkning af en række forskellige faktorer.
Samlet set har disse lipid scaffolds repræsenterer en hidtil ukendt platform til undersøgelse af komplekse protein-interaktioner nær lipidmembraner. Disse skabeloner er let genereret og er let at skræddersy til en række forskellige formål, herunder enzymatiske assays, elektronmikroskopi eller fluorescens billeddannelse. Desuden kan lipidsammensætningen formuleres til at ligne en organel eller membran microdomain af interesse for bedre rekapitulere proteinfunktion ved disse specifikke regioner. Ved hjælp af disse teknikker, kan biokemikere sonde de komplekse vekselvirkninger membranbundne og membran proteiner med deres partnere og deres miljø.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phosphatidylcholine (DOPC) | Avanti Polar Lipids | 850375 | |
| Phosphatidylethanolamine (DOPE) | Avanti Polar Lipids | 850725 | |
| DGS-NTA(Ni2+) | Avanti Polar Lipids | 790404 | |
| Bovine Heart Cardiolipin (CL) | Avanti Polar Lipids | 840012 | |
| Chloroform | Acros Organics | 268320010 | |
| Liposome Extruder | Avanti Polar Lipids | 610023 | |
| Cu/Rh Negative Stain Grids | Ted Pella | 79712 | |
| Microfuge Tube | Beckman | 357448 | |
| GTP | Jena Biosciences | NU-1012 | |
| GMP-PCP | Sigma Aldrich | M3509 | |
| Microtiter Plate strips | Thermo Scientific | 469949 | |
| EDTA | Acros Organics | 40993-0010 | |
| Instant Blue Coomassie Dye | Expedeon | ISB1L | |
| HEPES | Fisher Scientific | BP310 | |
| BME | Sigma Aldrich | M6250 | |
| KCl | Fisher Scientific | P330 | |
| KOH | Fisher Scientific | P250 | |
| Magnesium Chloride | Acros Organics | 223211000 | |
| 4 - 20% SDS-PAGE Gel | Bio Rad | 456-1096 | |
| 4x Laemmli Loading Dye | Bio Rad | 161-0747 | |
| HCL | Fisher Scientific | A144S | |
| Malachite Green Carbinol | Sigma Aldrich | 229105 | |
| Ammonium Molybdate Tetrahydrate | Sigma Aldrich | A7302 | |
| Laboratory Film | Parafilm | PM-996 | |
| Uranyl Acetate | Polysciences | 21447 | |
| Tecnai T12 100 keV Microscope | FEI | ||
| Optima MAX | Beckman | ||
| TLA-55 Rotor | Beckman | ||
| Refrigerated CentriVap Concentrator | Labconico | ||
| Mastercycler Pro Thermocycler | Eppendorf | ||
| VersaMax Microplate reader | Molecular Devices |
References
- Seddon, A. M., Curnow, P., Booth, P. J. Membrane proteins, lipids and detergents: not just a soap opera. Biochim Biophys Acta (BBA) - Biomembranes. 1666 (1-2), 105-117 (2004).
- Clinton, R. W., Francy, C. A., Ramachandran, R., Qi, X., Mears, J. A. Dynamin-related Protein 1 Oligomerization in Solution Impairs Functional Interactions with Membrane-anchored Mitochondrial Fission Factor. J Biol Chem. 291 (1), 478-492 (2016).
- Chan, D. C. Mitochondrial Fusion and Fission in Mammals. Annual Review of Cell and Dev Biol. 22 (1), 79-99 (2006).
- Bui, H. T., Shaw, J. M. Dynamin Assembly Strategies and Adaptor Proteins in Mitochondrial Fission. Curr Biol. 23 (19), R891-R899 (2013).
- Elgass, K., Pakay, J., Ryan, M. T., Palmer, C. S. Recent advances into the understanding of mitochondrial fission. Biochim Biophys Acta (BBA) - Mol Cell Res. 1833 (1), 150-161 (2013).
- Losón, O. C., Song, Z., Chen, H., Chan, D. C. Fis1, Mff, MiD49, and MiD51 mediate Drp1 recruitment in mitochondrial fission. Mol Biol Cell. 24 (5), 659-667 (2013).
- Otera, H., Wang, C., et al. Mff is an essential factor for mitochondrial recruitment of Drp1 during mitochondrial fission in mammalian cells. J Cell Biol. 191 (6), 1141-1158 (2010).
- Gandre-Babbe, S., van der Bliek, A. M. The Novel Tail-anchored Membrane Protein Mff Controls Mitochondrial and Peroxisomal Fission in Mammalian Cells. Mol Biol Cell. 19 (6), 2402-2412 (2008).
- Koirala, S., Guo, Q., et al. Interchangeable adaptors regulate mitochondrial dynamin assembly for membrane scission. Proc Natl Acad Sci. 110 (15), E1342-E1351 (2013).
- Macdonald, P. J., Stepanyants, N., et al. A dimeric equilibrium intermediate nucleates Drp1 reassembly on mitochondrial membranes for fission. Mol Biol Cell. 25 (12), 1905-1915 (2014).
- Macdonald, P. J., Francy, C. A., et al. Distinct Splice Variants of Dynamin-related Protein 1 Differentially Utilize Mitochondrial Fission Factor as an Effector of Cooperative GTPase Activity. J Biol Chem. 291 (1), 493-507 (2016).
- Bustillo-Zabalbeitia, I., Montessuit, S., Raemy, E., Basañez, G., Terrones, O., Martinou, J. -C. Specific Interaction with Cardiolipin Triggers Functional Activation of Dynamin-Related Protein 1. PLoS ONE. 9 (7), (2014).
- Francy, C. A., Alvarez, F. J. D., Zhou, L., Ramachandran, R., Mears, J. A. The Mechanoenzymatic Core of Dynamin-Related Protein 1 Comprises the Minimal Machinery Required for Membrane Constriction. J Biol Chem. 290 (18), 11692-11703 (2015).
- Walde, P., Cosentino, K., Engel, H., Stano, P. Giant Vesicles: Preparations and Applications. ChemBioChem. 11 (7), 848-865 (2010).
- Moscho, A., Orwar, O., Chiu, D. T., Modi, B. P., Zare, R. N. Rapid preparation of giant unilamellar vesicles. Proc Natl Acad Sci. 93 (21), 11443-11447 (1996).
- Klingler, J., Vargas, C., Fiedler, S., Keller, S. Preparation of ready-to-use small unilamellar phospholipid vesicles by ultrasonication with a beaker resonator. Anal Biochem. 477, 10-12 (2015).
- Mears, J. A., Hinshaw, J. E.
- Leonard, M., Doo Song, B., Ramachandran, R., Schmid, S. L. Robust Colorimetric Assays for Dynamin's Basal and Stimulated GTPase Activities. Methods Enzymol. 404, 490-503 (2005).
- Ingerman, E., Perkins, E. M., et al. Dnm1 forms spirals that are structurally tailored to fit mitochondria. J Cell Biol. 170 (7), 1021-1027 (2005).
- Fröhlich, C., Grabiger, S., et al. Structural insights into oligomerization and mitochondrial remodelling of dynamin 1-like protein. EMBO J. 32 (9), 1280-1292 (2013).
- James, D. I., Parone, P. A., Mattenberger, Y., Martinou, J. -C. hFis1, a Novel Component of the Mammalian Mitochondrial Fission Machinery. J Biol Chem. 278 (38), 36373-36379 (2003).
- Yoon, Y., Krueger, E. W., Oswald, B. J., McNiven, M. A. The Mitochondrial Protein hFis1 Regulates Mitochondrial Fission in Mammalian Cells through an Interaction with the Dynamin-Like Protein DLP1. Mol Cell Biol. 23 (15), 5409-5420 (2003).
- Osellame, L. D., Singh, A. P., et al. Cooperative and independent roles of Drp1 adaptors Mff and MiD49/51 in mitochondrial fission. J Cell Sci. 129 (11), 2170-2181 (2016).
- Esposito, E. A., Shrout, A. L., Weis, R. M. Template-Directed Self-Assembly Enhances RTK Catalytic Domain Function. J Biomol Screen. 13 (8), 810-816 (2008).
- Shrout, A. L., Esposito, E. A., Weis, R. M. Template-directed Assembly of Signaling Proteins: A Novel Drug Screening and Research Tool. Chem Biol Drug Des. 71 (3), 278-281 (2008).
- Celia, H., Wilson-Kubalek, E., Milligan, R. A., Teyton, L. Structure and function of a membrane-bound murine MHC class I molecule. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 96 (10), 5634-5639 (1999).
- Li, E., Wimley, W. C., Hristova, K. Transmembrane helix dimerization: Beyond the search for sequence motifs. Biochim Biophys Acta (BBA) - Biomembranes. 1818 (2), 183-193 (2012).
- Zhang, F., Crise, B., Su, B., Hou, Y., Rose, J. K., Bothwell, A., Jacobson, K. Lateral diffusion of membrane-spanning and glycosylphosphatidylinositol- linked proteins: toward establishing rules governing the lateral mobility of membrane proteins. J Cell Biol. 115 (1), 75-84 (1991).
- Ramadurai, S., Holt, A., Krasnikov, V., van den Bogaart, G., Killian, J. A., Poolman, B.
- Gambin, Y., Reffay, M., et al. Variation of the lateral mobility of transmembrane peptides with hydrophobic mismatch. J Phys Chem. B. 114 (10), 3559-3566 (2010).
- Wilson-Kubalek, E. M., Brown, R. E., Celia, H., Milligan, R. A. Lipid nanotubes as substrates for helical crystallization of macromolecules. Proc Natl Acad Sci. 95 (14), 8040-8045 (1998).
