Abstract
Studier av integrala membranproteiner in vitro ofta kompliceras genom närvaron av en hydrofob transmembrandomän. Ytterligare komplicera dessa studier, är återinkorporering av detergent-solubiliserade membranproteiner i liposomer en stokastisk process där protein topologi är omöjligt att verkställa. Detta dokument ger en alternativ metod för att dessa utmanande tekniker som utnyttjar en liposom baserad byggnadsställning. Proteinlöslighet förbättras genom deletion av transmembrandomänen, och dessa aminosyror är ersatta med en tethering del, såsom en His-tag. Denna tjuder samverkar med en förankringsgrupp (Ni2 + samordnas av nitrilotriättiksyra (NTA (Ni 2+)) för His-märkta proteiner), som verkställer ett enhetligt protein topologi vid ytan av liposomen. Ett exempel presenteras vari interaktionen mellan dynamin relaterat protein 1 (Drp1) med ett integralt membranprotein, Mitochondrial klyvning Factor (MFF), var investigated använder denna byggnadsställning liposomer metod. I detta arbete har vi visat förmågan hos MFF att effektivt rekrytera lösligt Drp1 till ytan av liposomer, som stimulerade dess GTPas-aktivitet. Dessutom var Drp1 kunna tubulate MFF-dekorerade lipid mall i närvaro av specifika lipider. Detta exempel visar effektiviteten av ställnings liposomer med användning av strukturella och funktionella analyser och belyser den roll som MFF vid reglering Drp1 aktivitet.
Introduction
Studera membran proximala protein-proteininteraktioner är en utmanande strävan på grund av svårigheter att rekapitulera den nativa miljön i de integrerade membranproteiner är involverade en. Detta är på grund av nödvändigheten av detergent solubilisering och den inkonsekventa orienteringen av proteiner i proteoliposomer. För att undvika dessa problem har vi använt en strategi där lösliga domäner av integralmembranproteiner uttrycks som His-tagg fusionsproteiner, och dessa lösliga fragment är förankrade ställnings liposomer via interaktioner med NTA (Ni 2+) huvudgrupper på lipid yta. Med hjälp av dessa ställningar, kan lipid-proximala proteininteraktioner undersökas över ett intervall av lipid- och proteinkompositioner.
Vi har faktiskt tillämpas denna metod för att undersöka kritiska protein-proteininteraktioner som styr sammansättningen av den mitokondriella fission komplexa och undersöka lipid interaktioner som modulerar denna process 2. Under mitokondriell klyvning, en konserverad membran remodeling protein, kallat dynamin relaterat protein 1 (Drp1) 3, rekryteras till ytan av den yttre mitokondriemembranet (OMM) som svar till cellulära signaler som reglerar energi homeostas, apoptotisk signalering, och flera andra gral mitokondriella processer. Denna stora, cytosoliska GTPas rekryteras till ytan av mitokondrier genom interaktioner med integral OMM proteiner 4 - 8. Rollen för ett sådant protein, Mitochondrial klyvning Factor (MFF), har varit svårt att klarlägga på grund av en uppenbar svag interaktion med Drp1 in vitro. Ändå har genetiska studier tydligt visat att MFF är avgörande för framgångsrik mitokondriella fission 7,8. Den metod som beskrivs i detta manuskript kunde övervinna tidigare tillkortakommanden genom att införa samtidiga lipid interaktioner som främjar Drp1-Mff interaktioner. Sammantaget denna nya analys revealedde fundamental växelverkan vägledande montering av den mitokondriella fission komplexa och gav en ny scen för pågående strukturella och funktionella studier av denna viktiga molekylära maskin.
Hittills har undersökning av interaktioner mellan Drp1 och MFF komplicerats av den inneboende flexibiliteten hos MFF 9, heterogeniteten hos Drp1 polymerer 2,10, och svårigheten att rening och rekonstituera fullängds MFF med en intakt transmembrandomän 11. Vi tog upp dessa utmaningar genom att använda NTA (Ni 2+) ställnings liposomer att rekonstruera His-märkt MFF saknar sin membrandomänen (MffΔTM-His 6). Denna strategi var fördelaktigt eftersom MffΔTM var extremt löslig när över uttryckt i E. coli, och denna isolerade protein lätt rekonstitueras på ställnings liposomer. När bundna till dessa lipid-mallar, MFF antas en identisk, utåt vända orienteringen på ytan av membranet.Förutom dessa fördelar, mitokondriska lipider, såsom kardiolipin, tillsattes för att stabilisera mff vikning och association med membranet 11. Kardiolipin samverkar också med den variabla domänen i Drp1 2,12 som kan stabilisera denna oordnade region och underlätta monteringen av fission maskiner.
Denna robust metod är allmänt tillämpas för framtida studier som syftar till att utvärdera membran proximala proteininteraktioner. Genom användning av extra tjudra / affinitetsinteraktioner, kan förfining av dessa membran rekonstitution studier förbättras för att efterlikna ytterligare komplexitet finns på ytan av membranen i celler. Samtidigt, kan lipidkompositionerna modifieras för att mer exakt efterlikna de nativa miljöer av dessa makromolekylära komplex. Sammanfattningsvis ger denna metod ett sätt att undersöka de relativa bidragen av proteiner och lipider i forma membran morfologier till under kritiska cellulära proccesser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Scaffold Liposomberedning
OBS: Helst ska initiala experiment använda en relativt enkel och odefinierbar scaffold (bestående av DOPC (1,2-dioleoyl- sn-glycero-3-fosfokolin eller PC) och DGS-NTA (Ni 2+) (1,2-dioleoyl - sn-glycero-3 - [(N - (5-amino-1-karboxipentyl) iminodiättiksyra) succinyl]. (nickelsalt)) Byggnad off av dessa experiment, lipid laddning, flexibilitet, och krökning kan införas som enskilda faktorer med potential att förändra membran proximal interaktioner. Dessa förändringar kan åstadkommas genom att tillsätta definierade mängder av specifika lipid beståndsdelar, inklusive fosfatidylserin eller kardiolipin (CL), fosfatidyletanolamin (DOPE eller PE), eller galaktosyl (β) ceramid.
- Kombinera lipider upplösta i kloroform i ett rent provrör av glas. Indunsta lösningsmedlet med torr kvävgas under rotation av röret för att bilda en tunn lipidfilm. Avlägsna kvarvarande lösningsmedel med en centrifugal indunstare under 1 h vid 37 ° C.
OBS: Olika liposomformuleringar används i protokollen som beskrivs nedan: ställnings liposomer (3,3 mol-% DGS-NTA (Ni 2+) / 96,7 mol% DOPC), ställnings liposomer med kardiolipin (3,3 mol-% DGS-NTA (Ni 2+) / 10 mol% kardiolipin / 86,7 mol% DOPC), flexibla ställnings liposomer med kardiolipin (3,3 mol% DGS-NTA (Ni 2+) / 10 mol% kardiolipin / 35 mol% DOPE / 51,7 mol% DOPC), och berikad ställnings liposomer (10 mol-% DGS-NTA (Ni 2+) / 15 mol% kardiolipin / 35 mol-% DOPE / 40 mol-% DOPC). - Lägg Buffert A (25 mM HEPES (4- (2-hydroxietyl) -1-piperazinetansulfonsyra), 150 mM KCl, pH justerat till 7,5 med KOH) som förvärmts till 37 ° C så att den slutliga lipidkoncentrationen är 1 - 2 mM. Inkubera 30 min vid 37 ° C med tillfällig virvling för att helt resuspendera lipidblandningen (Figur 1a).
- Överför till en plast provrör, placera röret i flytande kväve tills den är helt frysta (Roughly 30 s), och plats i ett 37 ° C vattenbad tills den är helt tinade (ungefär 1-2 minuter). Upprepa för totalt 4 frys-tö-cykler (figur 1B).
- Förbereda en lipid extruder genom blötläggning 4 filterstöden och ett polykarbonatfilter i buffert och hopsättning extrudern enlighet med tillverkarens anvisningar. Extrudera lipidlösningen genom filtret 21 gånger. Använd mild, konstant tryck för att säkerställa en homogen storleksfördelning (figur 1c).
OBS: För alla experiment som beskrivs i detta protokoll, har en 1,0 pm polykarbonatfilter som används för strängsprutning. Drp1 interaktion med anjoniska lipider kan observeras med en mängd olika liposom diametrar som sträcker sig från 50 nm till 400 nm 12 eller större 13. Därför, filterstorlek 1 pm valt att vara perfekt för både GTPas aktivitet och elektronmikroskopi. Om andra liposom diametrar önskas, framställning av jätte unilamellära vesiklar 14,15 (GUVs) eller små unilamellar vesiklar 16 (SUVs) kan användas. Dynamisk ljusspridning kan användas för att bedöma liposomstorleken heterogenitet 13. - Förvara extruderade liposomer vid 4 ° C och kasta efter 3-5 d.
2. Användning av Scaffold liposomer för proteinbindningsanalys
- prov~~POS=TRUNC
- Inkubera His-märkt MffΔTM (5 ^ M slutlig) med ställnings liposomer (40 mol% PC / 35 mol-% PE / 15 mol-% CL / 10 mol-% DGS-NTA (Ni 2+); 50 ^ M slutlig) under minst 15 min vid RT i buffert A + BME (25 mM HEPES, 150 mM KCl, 10 mM β-merkaptoetanol (BME), pH justerades till 7,5 med KOH). För en MFF-fria kontrollen, inkubera liposomer med en His-märkt kontrollprotein (såsom GFP) att binda och sköld exponerade NTA (Ni 2+).
OBS: MffΔTM uttrycktes och renades såsom beskrivits i en tidigare studie två. GFP renades på ett liknande sätt, men jonbytessteg utelämnades. BME krävdes för dessa experiments eftersom Drp1 är känsligt för oxidation, som kan förändra sin verksamhet och monteringsegenskaper. - Lägga Drp1 (2 ^ M slutlig) och inkubera under 1 h vid RT.
OBS: Drp1 uttrycktes och renades såsom beskrivits i en tidigare studie två. Efter inkubering med Drp1, kan effekten av nukleotid bindande för membran deformation undersökas genom att inkubera en ytterligare timme med 2 mM MgCl2 och antingen 1 mM GTP, 1 mM GMP-PCP, eller Buffert A + BME.
- Inkubera His-märkt MffΔTM (5 ^ M slutlig) med ställnings liposomer (40 mol% PC / 35 mol-% PE / 15 mol-% CL / 10 mol-% DGS-NTA (Ni 2+); 50 ^ M slutlig) under minst 15 min vid RT i buffert A + BME (25 mM HEPES, 150 mM KCl, 10 mM β-merkaptoetanol (BME), pH justerades till 7,5 med KOH). För en MFF-fria kontrollen, inkubera liposomer med en His-märkt kontrollprotein (såsom GFP) att binda och sköld exponerade NTA (Ni 2+).
- Negativ Stain transmissionselektronmikroskopi (EM) Analys
- Transfer 5 mikroliter prov till ett ark av laboratorie film, och lägga en kolbelagda Cu / Rh rutnät på provet. Inkubera gallret 1 min på provet, blot bort överskottsvätska på filterpapper, och överför till en nedgång på 2% uranylacetat. Inkubera 1 min, blot överskott fläck på filterpapper, och överför till ett rutnät låda. Lagra under vakuum O / N för att säkerställa fullständig torkning.
- Bild prover med ett transmissionselektron MicroscOPE på 18.500 - 30,000X förstoring för att observera ultra förändringar i protein och liposom morfologier 17.
Obs: Ultra förändringar kan kvantifieras med hjälp av bildanalysmjukvara, såsom ImageJ 13 (http://imagej.nih.gov/ij/). Protein dekoration kan mätas i jämförelse med nakna lipid mallar. Dessutom kan diametrarna hos rörformiga segment mätas från den yttersta delen av enheterna 13. En mer detaljerad analys kan utföras med Cryo-elektronmikroskopi 17. Denna metod kan användas för att avbilda nativa protein-lipid heter i lösningsmedel utan användning av tunga fläckar som belägga metallprov. På detta sätt, detaljerade strukturella egenskaper inte uppenbara i negativ fläck, inklusive förändring i den underliggande fett morfologi, kan undersökas och kvantifieras.
3. Användning av Scaffold liposomer för enzymatisk analys
Obs: En colorimetriska GTPas analys 18 användes för att mäta fosfat frigörelse via GTP-hydrolys. Alternativa GTPas analyser är tillgängliga 19 och kan genomföras vid behov.
- Inkubera His-märkt MffΔTM (MFF), Fis1ΔTM (Fis1) eller GFP (5 ^ M slutlig för alla) med ställnings liposomer (150 | iM slutlig) 15 min vid RT i Buffert A + BME (volym = 30 | il). Lägga Drp1 (500 nM slutlig) och inkubera ytterligare 15 min vid RT (volym = 80 | il).
OBS: Fis1 renades på ett liknande sätt för att MFF 2, men jonbyteskromatografi steget utelämnades. Syftet med His-märkta GFP är att skydda NTA (Ni 2+) huvudgrupper och förhindra ospecifik laddnings interaktioner med andra proteiner. Om ingen effekt observeras i frånvaro av GFP, då denna kontroll kan inte krävas. Alternativa blockerande proteiner (av jämförbar storlek till proteinet av intresse) kan också användas, men GFP möjliggör direkt visualisering av interaktioner med SCAFfaldigt liposomer. - Överföringsrören till en termocykler inställd på 37 ° C, och initiera reaktioner genom tillsats av GTP och MgCl2 (1 mM och 2 mM slutlig, respektive; volym = 120 | il).
- Vid önskade tidpunkter (dvs t = 5, 10, 20, 40, 60 min), överför 20 mikroliter av reaktion till brunnar i en mikrotiterplatta innehållande 5 | il av 0,5 M EDTA för att kelatbinda Mg2 + och stoppa reaktionen.
- Bered en uppsättning av fosfat standarder genom att späda KH 2 PO 4 i buffert A + BME att kalibrera resultat. En användbar uppsättning standarder är 100, 80, 60, 40, 20, 10, 5, och 0 ^ M. Tillsätt 20 mikroliter av var och en till brunnar innehållande 5 pl av 0,5 M EDTA.
- Lägga 150 mikroliter av Malachite grön reagens (1 mM malakitgrönt karbinol, 10 mM ammoniummolybdat-tetrahydrat, och en N HCl) till varje brunn, och läsa OD 650 5 min efter tillsatsen.
OBS: GTP är syralabil, och kommer att hydrolysera i närvaro av malakitgrönt reagens. Se till att than tid mellan att lägga malakit reagens och läsning är konstant för att säkerställa reproducerbara resultat. - Generera en standardkurva genom att plotta OD 650 av de standarder som en funktion av fosfatkoncentration. Använd linjär regression för att bestämma förhållandet mellan OD 650 och fosfatkoncentrationen i ett prov.
- Med användning av linjär regression, omvandla OD 650 av de proteinreaktionsproven till iM fosfat. Bestämma hastigheten av fosfat generation för varje reaktionsblandning genom att plotta fosfatkoncentrationen som en funktion av tid, och konvertera till kcat genom att dividera hastigheten av Drp1 koncentration (0,5 uM).
OBS: Endast den initiala linjär hastighet bör användas för att bestämma hastigheten av fosfat generation, och ett minimum av 3 datapunkter måste användas. Om reaktionshastigheten är tillräckligt snabb att de tre första datapunkterna inte är linjär (dvs. r 2 för den linjära passformen är mindre än 0,9) ett teckenbör utföras ificantly kortare tidsförlopp med minst 3 tidpunkter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Medan interaktionen mellan Drp1 och MFF har visat sig vara viktigt för mitokondriell klyvning, har denna samverkan varit svårt att rekapitulera in vitro. Vårt mål var att bättre emulera den cellulära miljön vari Drp1 och MFF samverkar. För detta ändamål, liposomer innehållande begränsande koncentrationer av NTA (Ni 2+) huvudgrupperna bereddes genom rehydratisering av en lipidfilm, såsom beskrivits ovan. Lipidlösningen består initialt av unilamellära och multilamellära vesiklar av heterogena diameter, vilket framgår av opaciteten av lösningen (Figur 1a). Denna opacitet reduceras genom frysning-tining (figur 1b), vilket minskar förekomsten av multilamellära vesiklar. Liposom-diametrar är vidare homogeniseras genom extrudering genom ett polykarbonatfilter, vilket resulterar i en klar lösning (Figur 1c).
två. Med utgångspunkt i dessa resultat, utnyttjade vi en ny mall som består av PC, PE, Ni, och CL (kallas Enriched Scaffold liposomer eller ESL) för att främja beställt montering av en polymer Drp1-MFF komplex förmåga att inducera membran deformation. Speciellt ökade NTA (Ni 2+) och kardiolipin lipider användes (10 mol% och 15 mol% respektive) för denna applikation. Därefter tillsattes GFP eller MFF bundna till ESL mallar i närvaro och frånvaro av Drp1 (figur 2), och förmågan hos Drp1 att renovera membran var kvalitativt bedömas. I frånvaro av Drp1, varken MFF nor GFP gav membran deformation (figur 3a, b), och på liknande sätt i fallet med GFP-dekorerade ESL var det endast odefinierbar liposomer observerades (figur 3c). Emellertid, när Drp1 sattes till MFF-dekorerade ESL mallar, ombyggnad av liposomerna var uppenbar (figur 3d).
Medan makromolekylär komplexbildning visar tydligt en interaktion mellan Drp1 och MFF, enbart är denna kvalitativa analys oförmögna att bestämma de funktionella effekterna av en sådan interaktion. Därför utnyttjade vi en malakitgrönt fosfat generation analys 18 för att bedöma förändringar i den katalytiska aktiviteten för Drp1 som svar på interaktion med MFF. Såsom beskrivits tidigare två, till en början utnyttjade vi en enkel scaffold liposom (SL; 3,3 mol-% DGS-NTA (Ni 2+), 96,7 mol-% DOPC) för att undersöka effekten av MFF ensam på Drp1 struktur och funktion. Icke-specifik interaktion av Drp1 med NTA (Ni 2+) har tidigare beskrivits 20, så SL var ursprungligen avsett att innehålla låga koncentrationer av NTA (Ni 2+) för att undvika icke-specifik aktivitet stimulering av Drp1. Med större mängder NTA (Ni 2+) i ESL, var användningen av His-märkt GFP som en kontroll visade sig vara avgörande för att skydda Ni 2+ och förhindra icke-specifika Drp1 interaktioner. Efter dekoration av SL liposomer genom MFF eller GFP (såsom illustreras i figur 2), kan uppskattas omfattningen av självsammansättning genom att mäta GTPas aktivitet Drp1. I frånvaro av liposomer, har Drp1 en relativt låg basal GTPas-aktivitet, som är något förbättras genom tillsats av SL. Dekoration av dessa ställnings liposomer med MFF förbättrad GTPas aktivitet (figur 4a, 1,8 gånger). Omvänt gäller att när den exponerade NTA (Ni 2+) huvudgrupperna blockerades med His-inmärkt GFP, var detta augmented GTPas-aktivitet avlägsnas. Vi testade också roll Fis1, en OMM protein som har föreslagits att ha en roll i mitokondriell klyvning 21,22, även om detta har ifrågasatts under de senaste studierna 7,23. Uppbindning av Fis1 saknar dess transmembrandomänSL också misslyckats med att framkalla en stimulering av Drp1 s GTPas aktivitet (Figur 4a).
Vi utnyttjade då en något mer komplex lipid byggnadsställning som innehåller en liten mängd av kardiolipin (SL / CL: SL med 10 mol% kardiolipin ersätter DOPC) för att bestämma vilken roll denna mitokondriella lipid i samspelet mellan Drp1 och MFF. Denna måttlig koncentration av kardiolipin specifikt valt att begränsa stimulering av Drp1 av kardiolipin som beskrivits tidigare 10. I likhet med SL, tillsats av SL / CL Drp1 resulterade i en svag stimulering av GTPas aktivitet som vändes uppbundna His-märkt Fis1 eller GFP till liposomerna. En samverkan mellan MFF och kardiolipin observerades som GTPas aktivitet Drp1 stimulerades 2,6 gånger när det inkuberades med MFF-dekorerade SL / CL (Figur 4b).
Membranfluiditet och förmågan of Drp1 att renovera lipidbiskikt har föreslagits för att förbättra sin GTPas aktivitet. Därför försökte vi undersöka effekten av membran fluiditet / flexibilitet med hjälp av en flexibel ställnings liposom. Detta uppnåddes genom att ersätta 35 mol-% av DOPC i SL / CL med DOPE (SL / PE / CL), som tidigare har visat sig möjliggöra Drp1-förmedlad membran remodeling 10. Tillsats av odekorerade SL / PE / CL ställnings liposomer till Drp1 ökar något Drp1 GTPas aktivitet, och dekoration av dessa liposomer med GFP eliminerar denna effekt. När SL / PE / CL mallar var dekorerad med MFF var Drp1 aktivitet förbättras (Figur 4c, 2,4 gånger). Som vi tidigare har visat, var förmågan hos Drp1 att renovera liposomer till lipid tubuli förbättras genom tillsats av PE till ställnings liposomer. Intressant nog denna förbättrade röran leder till bildandet av en spiral Drp1 polymer inte leda till någon större stimulans jämfört med liposomer som Drp1 inte kunde renovera Med hjälp av dessa anpassnings lipid mallar, var MFF och Drp1 fann att interagera på ett mer naturliga miljö in vitro. Denna teknik har gjort det möjligt för oss att kontrollera den relativa förekomsten av Drp1, MFF (genom NTA (Ni 2+) koncentration), och specifika lipider (kardiolipin och PE specifikt) som verkade för att reglera monteringen av detta makromolekylära komplex. Som vi har visat, kan denna metod användas för att visualisera membran ombyggnad av MFF-rekryterade Drp1 genom elektronmikroskopi, och för att bestämma effekterna av Drp1 montering på dess katalytiska aktivitet med hjälp av GTPas aktivitetsanalys. 71fig4.jpg "/> 
Figur 1: Lipid Förberedelse Schematisk. (A) Vid resuspension liposomer av olika storlekar bildar och består av unilamellära och multilamelnande vesiklar, vilket resulterar i en opak lösning (infälld). (B) frysning-tining resultaten lösning i en mer unilamellär population av liposomer, som fortfarande är heterogen i diameter. Frysning-tining klargör lösningen (infälld). (C) Extrudering av lipidlösningen homogeniserar liposomen diameter (1,0 | j, m i detta exempel), och resulterar i en klar lösning (infälld). Klicka här för att se en större version av denna siffra. 
Figur 2: metoder för att bedöma Protein montering. En schematisk föreställande partnerprotein montering på ställnings liposomer presenteras. His-märkta partnerproteiner eller GFP inkuberas med ställnings liposomer, och sedan Drp1 inkuberas med dekorerad eller odekorerad lipo somes. Dessa Drp1-förmonterade liposomer kan sedan analyseras genom strukturella metoder (elektronmikroskopi) och funktionella analyser (GTPas analys). Klicka här för att se en större version av denna siffra. 
Figur 3: strukturell utvärdering av Drp1 Rekrytering. Negativa fläck transmissionsmikrofotografier av GFP eller MFF dekorerade liposomer enbart (A, B, respektive) eller inkuberades med Drp1 (C, D, respektive). Skalstreck = 100 nm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Scaffold Liposome enzymatisk analys. (A - C) Alstring av fosfat över tiden mättes (infälld) och kcat bestämdes. Denna metod applicerades på SL-tjudrade proteiner (A), SL / CL-tjudrade proteiner (B), eller SL / PE / CL-tjudrade proteiner (C). #: P <0,05, *: p <0,0001, **: p <0,000001 bestämd genom oparade t-test. Alla felstaplar representerar standardavvikelse från 3 oberoende prov. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Detta protokoll erbjuder en metod för att undersöka protein-protein-interaktioner som involverar integrerade membranproteiner. Genom att använda en modulär liposom byggnadsställning, utredare har förmåga att bedöma aktiviteten av ett eller flera proteiner i en lipid-proximal miljö. Tidigare studier har visat en liknande metod för receptor enzymer av plasmamembranet 24-26. Har vi utökat denna metod för att införliva lipid kofaktorer och utforska interaktioner mellan proteiner som utgör mechanoenzymatic kärnan i den mitokondriella fission maskiner.
För systemmodellen som presenteras ovan, fann vi att MFF-dekorerad SL förbättrade Drp1 självorganisering. Dessutom, nu visar vi att MFF-dekorerade ESL mallar effektivt byggdes om av vildtyp Drp1 att bilda utökade rörkonstruktioner. Vi bedömde också roller olika mitokondriella lipider, inklusive den negativt laddade kardiolipin och koniska lipid PE.Kardiolipin synergistiskt med MFF för att ytterligare förbättra Drp1 självorganisering, medan membranet flexibilitet och smidighet som ges av PE förbättrar membranröran men inte ytterligare öka MFF-inducerad stimulering.
För att bedöma ultra förändringar i membran morfologier, analyser EM krävdes. Drp1 GTPas aktivitet höjdes genom klustring och montering av trådformiga polymerer som inte omforma liposomerna i någon större utsträckning två. Dock membran deformation observerades när mer mitokondrier liknande SL / PE / CL mall användes. Intressant nog var enzymaktiviteten inte förbättras. Därför EM studierna var viktigt att identifiera viktiga skillnader som annars skulle missas med hjälp av funktionell analys.
Även om denna teknik är kraftfull för att utforska funktionen och interaktionen av lösliga proteiner och lösliga proteindomäner kan dessa lipid ställningar inte hänsyn till den roll som transmembrana domänens. Detta är en viktig faktor, eftersom transmembrandomänen kan påverka dynamiska protein processer såsom självorganisering 27 och lateral diffusion 28-30 i lipiddubbelskikt. Om dessa faktorer är avgörande för att utvärdera proteininteraktioner vid membranytan, skulle då traditionella lipid beredning experiment med tvättmedel gynnas. Alternativa tjuder kan också undersökas för att kontrollera rekrytering och rörlighet av membran förankrade proteiner.
Förutom att använda His-märkta proteiner med NTA (Ni 2+) lipid ankare, andra tjuder såsom biotin-konjugerad 31 eller reaktiv grupp-konjugerade lipider kan utnyttjas. Dessa kovalenta modifieringar skulle mer stabilt fälla proteiner på lipid ytan, men rörlighet och utbyte av dessa faktorer skulle sannolikt försvagas. Som sådan bör tjudret noga övervägas i samband med proteinkomplex som studeras. när considering användningen av denna metod, sättet tjudra proteiner till lipid mallar har potential att påverka vissa analyser. Exempelvis kan den His-tag-sammanlänkning till NTA (Ni 2+) metod vara mer lämplig för in situ-analyser i stället för experiment med separation, i synnerhet i fallet med transienta protein-proteininteraktioner. Detta framgår tydligt i Figur 3 genom den diskrepans mellan in situ negativ fläck elektronmikroskopi och sedimenteringsanalys.
I framtiden kan en kombination av två eller flera av dessa ankare lipider med tydliga mål huvudgrupper implementeras för att möjliggöra rekrytering av flera proteiner till en byggnadsställning mall utan konkurrens om en enda lipid tjuder. Vidare kan den relativa abundansen av varje komponent hanteras genom ändring av lipidkompositionen. Ytterligare lipid kofaktorer, såsom fosfoinositider, kardiolipin och fosfatidylserin, kan lätt införasi dessa mallar för att bedöma den isolerade effekten av en mängd olika faktorer.
Sammantaget dessa lipid ställningar representerar en ny plattform för att undersöka komplexa proteininteraktioner i närheten av lipidmembran. Dessa mallar är lätt genereras och är enkla att skräddarsy till en rad olika tillämpningar, bland annat enzymatiska analyser, elektronmikroskopi, eller fluorescens avbildning. Dessutom kan lipid kompositionen formuleras för att likna en organell eller membranmikrodomän av intresse för bättre rekapitulera proteinfunktion vid dessa specifika regioner. Med hjälp av dessa tekniker, kan biokemister undersöka de komplexa sambanden av membranbundna och membranassocierade proteiner med sina partners och deras omgivning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phosphatidylcholine (DOPC) | Avanti Polar Lipids | 850375 | |
| Phosphatidylethanolamine (DOPE) | Avanti Polar Lipids | 850725 | |
| DGS-NTA(Ni2+) | Avanti Polar Lipids | 790404 | |
| Bovine Heart Cardiolipin (CL) | Avanti Polar Lipids | 840012 | |
| Chloroform | Acros Organics | 268320010 | |
| Liposome Extruder | Avanti Polar Lipids | 610023 | |
| Cu/Rh Negative Stain Grids | Ted Pella | 79712 | |
| Microfuge Tube | Beckman | 357448 | |
| GTP | Jena Biosciences | NU-1012 | |
| GMP-PCP | Sigma Aldrich | M3509 | |
| Microtiter Plate strips | Thermo Scientific | 469949 | |
| EDTA | Acros Organics | 40993-0010 | |
| Instant Blue Coomassie Dye | Expedeon | ISB1L | |
| HEPES | Fisher Scientific | BP310 | |
| BME | Sigma Aldrich | M6250 | |
| KCl | Fisher Scientific | P330 | |
| KOH | Fisher Scientific | P250 | |
| Magnesium Chloride | Acros Organics | 223211000 | |
| 4 - 20% SDS-PAGE Gel | Bio Rad | 456-1096 | |
| 4x Laemmli Loading Dye | Bio Rad | 161-0747 | |
| HCL | Fisher Scientific | A144S | |
| Malachite Green Carbinol | Sigma Aldrich | 229105 | |
| Ammonium Molybdate Tetrahydrate | Sigma Aldrich | A7302 | |
| Laboratory Film | Parafilm | PM-996 | |
| Uranyl Acetate | Polysciences | 21447 | |
| Tecnai T12 100 keV Microscope | FEI | ||
| Optima MAX | Beckman | ||
| TLA-55 Rotor | Beckman | ||
| Refrigerated CentriVap Concentrator | Labconico | ||
| Mastercycler Pro Thermocycler | Eppendorf | ||
| VersaMax Microplate reader | Molecular Devices |
References
- Seddon, A. M., Curnow, P., Booth, P. J. Membrane proteins, lipids and detergents: not just a soap opera. Biochim Biophys Acta (BBA) - Biomembranes. 1666 (1-2), 105-117 (2004).
- Clinton, R. W., Francy, C. A., Ramachandran, R., Qi, X., Mears, J. A. Dynamin-related Protein 1 Oligomerization in Solution Impairs Functional Interactions with Membrane-anchored Mitochondrial Fission Factor. J Biol Chem. 291 (1), 478-492 (2016).
- Chan, D. C. Mitochondrial Fusion and Fission in Mammals. Annual Review of Cell and Dev Biol. 22 (1), 79-99 (2006).
- Bui, H. T., Shaw, J. M. Dynamin Assembly Strategies and Adaptor Proteins in Mitochondrial Fission. Curr Biol. 23 (19), R891-R899 (2013).
- Elgass, K., Pakay, J., Ryan, M. T., Palmer, C. S. Recent advances into the understanding of mitochondrial fission. Biochim Biophys Acta (BBA) - Mol Cell Res. 1833 (1), 150-161 (2013).
- Losón, O. C., Song, Z., Chen, H., Chan, D. C. Fis1, Mff, MiD49, and MiD51 mediate Drp1 recruitment in mitochondrial fission. Mol Biol Cell. 24 (5), 659-667 (2013).
- Otera, H., Wang, C., et al. Mff is an essential factor for mitochondrial recruitment of Drp1 during mitochondrial fission in mammalian cells. J Cell Biol. 191 (6), 1141-1158 (2010).
- Gandre-Babbe, S., van der Bliek, A. M. The Novel Tail-anchored Membrane Protein Mff Controls Mitochondrial and Peroxisomal Fission in Mammalian Cells. Mol Biol Cell. 19 (6), 2402-2412 (2008).
- Koirala, S., Guo, Q., et al. Interchangeable adaptors regulate mitochondrial dynamin assembly for membrane scission. Proc Natl Acad Sci. 110 (15), E1342-E1351 (2013).
- Macdonald, P. J., Stepanyants, N., et al. A dimeric equilibrium intermediate nucleates Drp1 reassembly on mitochondrial membranes for fission. Mol Biol Cell. 25 (12), 1905-1915 (2014).
- Macdonald, P. J., Francy, C. A., et al. Distinct Splice Variants of Dynamin-related Protein 1 Differentially Utilize Mitochondrial Fission Factor as an Effector of Cooperative GTPase Activity. J Biol Chem. 291 (1), 493-507 (2016).
- Bustillo-Zabalbeitia, I., Montessuit, S., Raemy, E., Basañez, G., Terrones, O., Martinou, J. -C. Specific Interaction with Cardiolipin Triggers Functional Activation of Dynamin-Related Protein 1. PLoS ONE. 9 (7), (2014).
- Francy, C. A., Alvarez, F. J. D., Zhou, L., Ramachandran, R., Mears, J. A. The Mechanoenzymatic Core of Dynamin-Related Protein 1 Comprises the Minimal Machinery Required for Membrane Constriction. J Biol Chem. 290 (18), 11692-11703 (2015).
- Walde, P., Cosentino, K., Engel, H., Stano, P. Giant Vesicles: Preparations and Applications. ChemBioChem. 11 (7), 848-865 (2010).
- Moscho, A., Orwar, O., Chiu, D. T., Modi, B. P., Zare, R. N. Rapid preparation of giant unilamellar vesicles. Proc Natl Acad Sci. 93 (21), 11443-11447 (1996).
- Klingler, J., Vargas, C., Fiedler, S., Keller, S. Preparation of ready-to-use small unilamellar phospholipid vesicles by ultrasonication with a beaker resonator. Anal Biochem. 477, 10-12 (2015).
- Mears, J. A., Hinshaw, J. E.
- Leonard, M., Doo Song, B., Ramachandran, R., Schmid, S. L. Robust Colorimetric Assays for Dynamin's Basal and Stimulated GTPase Activities. Methods Enzymol. 404, 490-503 (2005).
- Ingerman, E., Perkins, E. M., et al. Dnm1 forms spirals that are structurally tailored to fit mitochondria. J Cell Biol. 170 (7), 1021-1027 (2005).
- Fröhlich, C., Grabiger, S., et al. Structural insights into oligomerization and mitochondrial remodelling of dynamin 1-like protein. EMBO J. 32 (9), 1280-1292 (2013).
- James, D. I., Parone, P. A., Mattenberger, Y., Martinou, J. -C. hFis1, a Novel Component of the Mammalian Mitochondrial Fission Machinery. J Biol Chem. 278 (38), 36373-36379 (2003).
- Yoon, Y., Krueger, E. W., Oswald, B. J., McNiven, M. A. The Mitochondrial Protein hFis1 Regulates Mitochondrial Fission in Mammalian Cells through an Interaction with the Dynamin-Like Protein DLP1. Mol Cell Biol. 23 (15), 5409-5420 (2003).
- Osellame, L. D., Singh, A. P., et al. Cooperative and independent roles of Drp1 adaptors Mff and MiD49/51 in mitochondrial fission. J Cell Sci. 129 (11), 2170-2181 (2016).
- Esposito, E. A., Shrout, A. L., Weis, R. M. Template-Directed Self-Assembly Enhances RTK Catalytic Domain Function. J Biomol Screen. 13 (8), 810-816 (2008).
- Shrout, A. L., Esposito, E. A., Weis, R. M. Template-directed Assembly of Signaling Proteins: A Novel Drug Screening and Research Tool. Chem Biol Drug Des. 71 (3), 278-281 (2008).
- Celia, H., Wilson-Kubalek, E., Milligan, R. A., Teyton, L. Structure and function of a membrane-bound murine MHC class I molecule. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 96 (10), 5634-5639 (1999).
- Li, E., Wimley, W. C., Hristova, K. Transmembrane helix dimerization: Beyond the search for sequence motifs. Biochim Biophys Acta (BBA) - Biomembranes. 1818 (2), 183-193 (2012).
- Zhang, F., Crise, B., Su, B., Hou, Y., Rose, J. K., Bothwell, A., Jacobson, K. Lateral diffusion of membrane-spanning and glycosylphosphatidylinositol- linked proteins: toward establishing rules governing the lateral mobility of membrane proteins. J Cell Biol. 115 (1), 75-84 (1991).
- Ramadurai, S., Holt, A., Krasnikov, V., van den Bogaart, G., Killian, J. A., Poolman, B.
- Gambin, Y., Reffay, M., et al. Variation of the lateral mobility of transmembrane peptides with hydrophobic mismatch. J Phys Chem. B. 114 (10), 3559-3566 (2010).
- Wilson-Kubalek, E. M., Brown, R. E., Celia, H., Milligan, R. A. Lipid nanotubes as substrates for helical crystallization of macromolecules. Proc Natl Acad Sci. 95 (14), 8040-8045 (1998).
